陳松林，吳志剛，姜 武，陶正明

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州 325035；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005）

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鐵皮石斛3種酸性多糖的分離純化及體外抗氧化活性

陳松林1，2，吳志剛1，姜 武2，陶正明1，2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州 325035；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005）

摘 要：為研究鐵皮石斛酸性多糖的構(gòu)成及抗氧化活性，采用水提法提取鐵皮石斛粗多糖（DOCP），利用陰離子交換劑纖維素柱（DEAE-52）和丙烯葡聚糖凝膠柱（SephacrylS-200）分離純化，凝膠色譜、液相色譜、紫外光譜及紅外光譜測(cè)定理化性質(zhì)。結(jié)果表明，分離純化獲得DOAP1-d，DOAP2-c和DOAP3-b 3種鐵皮石斛酸性多糖，分子量分別為530，13.8及130.2 ku。其中DOAP1-d和DOAP2-c由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成，而DOAP3-b另包含鼠李糖和半乳糖醛酸兩種單糖。紅外分析顯示，DOAP1-d含有a-呋喃型糖苷，DOAP2-c和DOAP3-b則含有a-吡喃型糖苷。體外活性試驗(yàn)表明，3種酸性多糖在ABTS、清除羥基自由基和DPPH自由基清除方面均比中性多糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；酸性多糖；理化性質(zhì)；抗氧化活性

文獻(xiàn)著錄格式:陳松林，吳志剛，姜武，等.鐵皮石斛3種酸性多糖的分離純化及體外抗氧化活性［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（6）: 838-844.

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimuraet Migo.）為蘭科石斛屬（Dendrobium）多年附生草本植物，具有潤(rùn)肺止咳、滋陰養(yǎng)胃和清熱明目以及抗腫瘤之多種功效［1］，俗稱鐵皮蘭，黑節(jié)草，是中國傳統(tǒng)名貴中藥材。多年藥理學(xué)研究表明，多糖為鐵皮石斛的主要藥效成分，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、降血糖、抗腫瘤以及抗白內(nèi)障等［2］。

在鐵皮石斛多糖研究中，有學(xué)者分離得到3種多糖（黑節(jié)草多糖），測(cè)得分子量分別為1 000，500和120 ku，并確定它們?yōu)橐活怬-乙酰葡萄甘露聚糖［3］。此外，也有研究者分離出DT2，DT3單一組分多糖，分子量分別為740和130 ku，主要由單糖Glc，Gal，Xyl，Ara和Man構(gòu)成，摩爾比分別為5.9∶1.0∶1.0∶0.8∶0.5和7.9∶1.3∶1.0∶0.5∶0.7［4］。Xia等［5］也從鐵皮石斛中分離出2個(gè)單一組分多糖（DOP-1和DOP-2），對(duì)其結(jié)構(gòu)的分析表明，DOP-1 和DOP-2的分子量分別為533.7和159.5 ku，且都含有相同單糖組成（Man，Glc，Gal，Ara）。

然而，上述多糖僅是鐵皮石斛多糖的中性組分，對(duì)其酸性組分的研究甚少。本研究首次對(duì)鐵皮石斛的酸性多糖部分進(jìn)行分離純化，測(cè)定其理化性質(zhì)，并比較中性多糖和酸性多糖的體外抗氧化活性差異，以期為石斛多糖的藥理藥效及鐵皮石斛藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2年生鐵皮石斛新鮮莖條為材料，于2014 年4月12日采收于浙江省溫州市樂清市。

1.2 鐵皮石斛預(yù)處理及水溶性多糖提取

參考文獻(xiàn)［6-7］的方法，將新鮮莖條烘干、磨碎成粉末，先后用60～90℃餾程的石油醚和80%乙醇加熱回流脫脂脫色2 h，各重復(fù)5次。80℃恒溫下，用20倍（體積比）的去離子水浸提2 h，離心，取上清液，重復(fù)3次。濃縮上清液，80%乙醇醇沉、離心、溶解，重復(fù)3次，收集多糖固體，60℃干燥；Sevag法除蛋白，濃縮，醇沉收集多糖。用分子截留量為3 500 u的半透膜于去離子水中4℃透析48 h，收集多糖溶液，濃縮，醇沉收集多糖，60℃干燥，得多糖粉末。 ［8］的方法，利用25 mm×500 mm 的DEAE-Cellulose-52交換劑柱（Whatman公司）分離中性多糖和酸性多糖。稱取0.5 g多糖粉末溶于10 mL的去離子水中，利用0，0.05，0.10，0.20，0.30，0.50，1.00 mol·L-1的NaCl溶液梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，試管收集洗脫液，2 mL每管，苯酚-硫酸法顯色，UV-2550型紫外分光光度計(jì)（SHIMADZU公司）在490 nm處監(jiān)測(cè)洗脫液吸光值，繪制洗脫曲線。根據(jù)曲線收集酸性組分多糖（NaCl溶液洗脫下的多糖組分），濃縮，透析濾過鹽分，醇沉、離心、干燥。 ［11］的方法，在10 mL試管中加入5 mL7 mmol·L-1ABTS溶液（Aladdin公司）和88 μL140 mmol·L-1過硫酸鉀溶液，搖勻混合，避光靜置過夜，在500 mL燒杯中按1∶50的體積比加250 mL蒸餾水制成工作液。 ［12］的方法。樣品組: 10 mL試管中加入2.5 mL0.004%的DPPH溶液（溶于95%乙醇）與0.5 mL不同濃度（0.2，0.4，0.6，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mg·mL-1）的多糖溶液，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)；對(duì)照組用95%乙醇代替DPPH溶液；空白組用蒸餾水代替多糖溶液。以上3組置于28℃水浴30 min，離心，取上清液。用0.5 mL蒸餾水和2.5 mL95%的乙醇調(diào)零，于515 nm處測(cè)定吸光值。按照上述方法，抗壞血酸（VC）作陽性對(duì)照。用以下公式計(jì)算多糖對(duì)DPPH的清除率: ［13］的方法。樣品組: 10 mL試管中加入1 mL6 mmol·L-1FeSO4、0.4 mL12 mmol·L-1水楊酸、0.2 mL不同濃度的多糖溶液（0.2，0.4，0.6，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mg·mL-1）、1 mL6 mmol·L-1H2O2和0.4 mL蒸餾水，設(shè)3個(gè)平行樣；空白組用蒸餾水代替多糖溶液，對(duì)照組用蒸餾水代替水楊酸；以上3組試管于水浴鍋37℃恒溫水浴1 h，取出冷卻，于510 nm處測(cè)定吸光值。按照上述方法，以抗壞血酸（VC）作陽性對(duì)照。用以下公式計(jì)算多糖對(duì)·OH的清除率:

1.3 鐵皮石斛酸性多糖的分離、純化

酸性組分多糖經(jīng)25 mm×400 mm的Sephacryl S-200柱（Pharmacia公司）純化。取0.1 g多糖樣品溶于5 mL去離子水中，0.1 mol·L-1NaCl溶液洗脫，洗脫流速1 mL·min-1，試管收集洗脫液，2 mL每管，苯酚-硫酸法顯色，紫外分光光度計(jì)在490 nm處監(jiān)測(cè)洗脫液吸光值，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集主峰多糖，反復(fù)上樣，直至洗脫曲線為單一對(duì)稱峰，收集該峰多糖，濃縮、醇沉、離心、干燥。

1.4 多糖純度鑒定與分子量測(cè)定

利用比旋光度法和SephadexG-100（15 mm× 600 mm）柱（Pharmacia公司）凝膠層析測(cè)定多糖的均一性［9］。稱取適量標(biāo)準(zhǔn)多糖（分子量分別為10，40，70，100和500 ku），配制5 mg·mL-1的溶液，于SephadexG-100柱中上樣洗脫，上樣0.1 mL，去離子水洗脫，流速0.5 mL·min-1。收集洗脫液，每管2 mL，苯酚-硫酸法顯色，紫外分光光度計(jì)490 nm處監(jiān)測(cè)洗脫液吸光值，待出現(xiàn)最大吸光值時(shí)，則該洗脫體積為標(biāo)準(zhǔn)多糖的洗脫體積。以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，洗脫體積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線V=-16.408logM +111.921（R2=0.999 3）。按上述條件，測(cè)出樣品洗脫體積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其分子量。

1.5 多糖的單糖組成分析

參照《中國藥典》（2010版）及參考文獻(xiàn)［10］的方法。稱取10 mg樣品多糖置50 mL小燒杯中，加入10 mL去離子水溶解。分別吸取1 mL溶液于3只10 mL具塞試管中，加入3.0 mol·L-1HCl溶液0.5 mL，封口，110℃烘箱中水解1 h，冷卻，用3.0 mol·L-1NaOH溶液調(diào)中性，吸取400 μL于干凈的10 mL具塞試管中，加0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液和0.3 mol·L-1的NaOH溶液各400 μL，混勻，70℃水浴100 min。后加0.3 mol· L-1HCl溶液500 μL，混勻，三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，離心，取上清液，進(jìn)HPLC，10 μL進(jìn)樣。

色譜條件。Agilent1200系統(tǒng)（Agilent公司），ZORBAXSB-18柱（4.6 mm×250 mm），柱溫為25℃，流速為1 mL·min-1，250 nm檢測(cè)。流動(dòng)相由乙腈與0.02 mol·L-1乙酸銨溶液以20∶80體積比構(gòu)成。

1.6 光譜分析

稱取多糖樣品配成5 mg·mL-1的溶液，以蒸餾水為空白對(duì)照，于190～500 nm波長(zhǎng)區(qū)域掃描。稱取10 mg多糖樣品，與KBr研磨混合，壓成透明薄片，紅外光譜儀掃描分析，KBr空白片作參比，掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.7 ABTS法測(cè)定總抗氧化能力

樣品組:在10 mL試管中加入200 μL不同濃度（0.2，0.4，0.6，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg·mL-1）的多糖溶液和3 mL的ABTS溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)；空白組用蒸餾水代替多糖溶液；對(duì)照組用蒸餾水代替ABTS溶液；以上3組在室溫避光放置1 h，于734 nm處測(cè)定其吸光值。按照上述方法，抗壞血酸（VC）作陽性對(duì)照。按以下公式計(jì)算多糖對(duì)ABTS自由基的清除率:

ABTS清除率/%=［A空白-（A樣品-A對(duì)照）］/A空白×100。

1.8 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH清除率/%=［A空白-（A樣品-A對(duì)照）］/A空白×100。

1.9 羥基自由基（·OH）清除能力的測(cè)定

·OH清除率/%=［A空白-（A樣品-A對(duì)照）］/A空白×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性多糖的分離純化

粗多糖經(jīng)DEAE-Cellulose-52柱分離，共得到7組分的多糖（圖1），前4個(gè)峰為主峰，收集前4組分多糖。其中去離子水洗脫部分為中性多糖，后3組分為酸性多糖。酸性多糖（DOAP1，DOAP2，DOAP3）在SephacrylS-200柱中上樣洗脫純化，發(fā)現(xiàn)3組洗脫圖中都存在一個(gè)主峰，分別是DOAP1-d，DOAP2-c，DOAP3-b；收集主峰多糖，反復(fù)上樣洗脫，直至洗脫曲線中有且只有一個(gè)單一對(duì)稱峰（圖2）；收集，得DOAP1-d，DOAP2-c，DOAP3-b多糖粉末800（白色），432（白色），257 mg（淡黃色），分別占粗多糖的2.7%，1.4%和0.8%。

圖1　粗多糖在DEAE-纖維素柱上的洗脫曲線

2.2 3種酸性多糖的純度鑒定與多糖分子量的測(cè)定

3種酸性多糖的比旋光度，DOAP1-d為［a］D20=11.2°（C=0.03，H2O），DOAP2-c為［a］D20=90.0°（C=0.03，H2O），DOAP3-d為［a］D20=79.3°（C=0.03，H2O），其中，［a］代表比旋光度，D為D鈉光測(cè)定，20指20℃測(cè)定，C為濃度（g·100mL-1）。SephadexG-100柱上樣洗脫顯示，3種多糖洗脫曲線均為單一對(duì)稱峰型，可以認(rèn)定其為均一組分（圖3）。

DOAP1-d，DOAP2-c，DOAP3-b 3種酸性多糖洗脫體積分別為18，44和28 mL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（V=-16.480logM+111.921）計(jì)算其分子量分別為530，13.8和130.2 ku。

2.3 單糖組成分析

DOAP1-d和DOAP2-c共水解得到4種單糖，分別是葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖（圖4）；DOAP3-b則水解多得到2種單糖，分別是半乳糖醛酸、鼠李糖（表1）。

表1　酸性多糖的單糖組成及摩爾分?jǐn)?shù)

2.4 多糖的光譜分析

多糖溶液在波長(zhǎng)在190～500 nm進(jìn)行紫外掃描發(fā)現(xiàn)，在240～290 nm均無吸收峰，表明均不存在蛋白質(zhì)和核酸分子。

紅外光譜檢測(cè)結(jié)果如圖5所示: 3種多糖的紅外光譜較相似。在3 600～3 200 cm-1的峰（DOAP1-d: 3 401.871 cm-1，DOAP2-c: 3 399.943 cm-1，DOAP3-b: 3 399.943 cm-1）是由—O—H的伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)引起。2 950～2 800 cm-1的峰（DOAP1-d: 2 925.532 cm-1，DOAP2-c: 2 929.389 cm-1，2 890.819 cm-1，DOAP3-b: 2 929.389和2 890.819 cm-1）是—C—H鍵伸縮振動(dòng)引起的特征峰。1 650～1 600 cm-1出現(xiàn)的峰（DOAP1-d: 1 648.866 cm-1，DOAP2-c: 1 641.152 cm-1，DOAP3-b: 1 641.152 cm-1）是羰基的伸縮振動(dòng)峰。另外，在1 735 cm-1附近的峰（DOAP1-d: 1 733.720 cm-1，DOAP2-c: 1 733.720 cm-1，DOAP3-b: 1 733.720 cm-1）和1 248 cm-1附近的峰（DOAP1-d: 1 249.667 cm-1，DOAP2-c: 1 249.667 cm-1，DOAP3-b: 1 253.524 cm-1）分別是糖醛酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán)的特征吸收峰，表明這3種多糖為酸性多糖［14］。而1 200～1 000 cm-1所產(chǎn)生的峰是由糖環(huán)的C-O-C伸縮振動(dòng)所引起，DOAP1-d出現(xiàn)了2個(gè)強(qiáng)吸收峰（1 066.460和1 031.747 cm-1），表明DOAP1-d多糖存在呋喃糖苷，DOAP2-c產(chǎn)生了3個(gè)峰（1 149.385，1 062.603 和1 029.818 cm-1），DOAP3-b也出現(xiàn)3個(gè)吸收峰（1 151.384，1 087.673和1 027.890 cm-1）說明DOAP2-c和DOAP3-b存在吡喃糖環(huán)［15］。

圖2　酸性多糖在SephacrylS-200色譜柱上的洗脫曲線

圖3　酸性多糖在SephadexG-100色譜柱上的洗脫曲線

在870 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰（DOAP1-d: 877.466 cm-1，DOAP2-c: 879.395 cm-1，DOAP3-b: 879.395 cm-1）表明這3種多糖具有a-型糖苷鍵［16］；同時(shí)，在810 cm-1（DOAP1-d: 808.040 cm-1，DOAP2-c: 809.969 cm-1，DOAP3-b: 809.969 cm-1）附近出現(xiàn)的吸收峰表明，糖基中存在甘露糖，而在890 cm-1處無吸收峰也表明這3種多糖不存在β構(gòu)型的糖基鍵結(jié)構(gòu)［17］，與上述結(jié)果吻合。

2.5 3種酸性多糖體外抗氧化活性

ABTS法測(cè)定結(jié)果如圖6中A所示。3種酸性多糖與中性多糖的總抗氧化能力隨著多糖濃度增加明顯增強(qiáng)，當(dāng)增加到一定程度，其增強(qiáng)程度慢慢減弱。比較發(fā)現(xiàn)，3種酸性多糖的總抗氧化能力非常接近，均高于中性多糖，略低于VC，以DOAP2-c活性最強(qiáng)。在濃度為5 mg·mL-1時(shí)，各組分多糖清除率由高到低分別是99.0%，82.6%，76.3%，70.8%和32.6%。

DPPH自由基清除能力結(jié)果如圖6中B所示。各組分多糖的清除率同樣隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)，且增強(qiáng)程度逐漸減弱。中性多糖的清除率依舊最低。在濃度為5 mg·mL-1時(shí)，清除率由高到低分別是98.1%，77.1%，67.6%，53.7%和45.8%。

羥基自由基（·OH）清除能力結(jié)果如圖6中C所示。活性最強(qiáng)為VC，最弱的為中性多糖，DOAP2-c活性最強(qiáng)。值得注意的是，低濃度（0.2和0.4 mg· mL-1）時(shí)，DOAP1-d的清除率甚至高于VC，達(dá)到了55.9%和61.0%。在濃度為5 mg·mL-1時(shí)，DOAP2-c的清除率為97.3%，與VC的99.0%接近。

圖4　酸性多糖水解衍生物的HPLC色譜

圖5　酸性多糖的紅外光譜

3 討論

本試驗(yàn)通過陰離子交換劑纖維素柱和丙烯葡聚糖凝膠柱分離純化得到鐵皮石斛3種主要酸性多糖DOAP1-d，DOAP2-c和DOAP3-b。通過凝膠色譜、液相色譜、紫外光譜和紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，這3種酸性多糖的分子量大小、單糖構(gòu)成、比旋光度均不同于以往所分離的石斛多糖。

ABTS總抗氧化、清除DPPH自由基、清除羥基自由基等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種酸性多糖抗氧化活性大大強(qiáng)于中性多糖，在高濃度時(shí)，其活性甚至接近于VC活性。大量研究顯示，多糖的生物活性與其組成結(jié)構(gòu)存在緊密聯(lián)系，其中包括分子量、單糖組成、官能團(tuán)以及構(gòu)型。本試驗(yàn)中，中性多糖與酸性多糖的巨大活性差異可能與酸性多糖所特有的糖醛酸與磷酸基團(tuán)有關(guān)。對(duì)比3種酸性多糖的活性與分子量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，分子量最低的DOAP2-c在ABTS總抗氧化活性試驗(yàn)和清除羥基自由基試驗(yàn)中活性最強(qiáng)，分子量介于DOAP1-d和DOAP2-c之間的DOAP3-b的DPPH清除自由基活性最強(qiáng)，表明抗氧化活性與分子量存在密切關(guān)系，且分子量越小活性相對(duì)越強(qiáng)。另外DOAP1-d具有的呋喃糖環(huán)、DOAP2-c和DOAP3-b具有的吡喃糖環(huán)也可能是影響多糖活性的因素。

目前，多糖含量和甘露糖與葡萄糖的比值是評(píng)價(jià)鐵皮石斛品質(zhì)的重要指標(biāo)，雖然該指標(biāo)測(cè)定方便快捷，但是根據(jù)上述結(jié)果分析，酸性多糖相比中性多糖具更強(qiáng)的活性，是鐵皮石斛抗氧化的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，我們認(rèn)為可以考慮將酸性多糖的含量作為一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究分離純化得到的3種酸性多糖的理化性質(zhì)與體外抗氧化活性的相互關(guān)系，將為鐵皮石斛多糖藥理藥效研究和藥材質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。

圖6　不同組分多糖的總抗氧化能力（A）、對(duì)DPPH自由基的清除能力（B）和對(duì)羥基自由基（·OH）的清除能力（C）

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（責(zé)任編輯：侯春曉）

中圖分類號(hào)：S567.239

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0528-9017（2016）06-0838-06

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160613

收稿日期:2015-03-17

基金項(xiàng)目:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院地方科技合作項(xiàng)目（WZ20130006）；浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（N20100016）

作者簡(jiǎn)介:陳松林（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊换衔锓蛛x及純化，E-mail: 694452053@qq.com。

通信作者:陶正明（1970—），男，副研究員，從事中藥栽培技術(shù)、品種選育與藥材質(zhì)量研究，E-mail: 312633768@qq.com。