趙洪俠　李發(fā)恩

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Trpm7下調(diào)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞游離Ca2+濃度影響的研究

趙洪俠李發(fā)恩

【摘要】目的TRPM7是心肌細(xì)胞內(nèi)一種陽離子通道，對(duì)Mg2+和Ca2+都具有通透性。為了深入研究TRPM7基因在心肌細(xì)胞的功能，本試驗(yàn)試圖研究下調(diào)TRPM7后大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。方法大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，心肌細(xì)胞存活度的測(cè)定，小干擾RNA(siRNA)技術(shù)，大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。結(jié)果經(jīng)過胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下調(diào)TRPM7后大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度無顯著變化。 結(jié)論調(diào)TRPM7后對(duì)心肌細(xì)胞鈣的代謝沒有顯著影響。

【關(guān)鍵詞】TRPM7siRNA胞內(nèi)游離Ca2+濃度心肌細(xì)胞

TRPM7(transient receptor potential melastatin 7)是一種具有離子通道和蛋白激酶雙重結(jié)構(gòu)的雙功能蛋白, 近年來主要研究TRPM7作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞內(nèi)Mg2+調(diào)控通道蛋白作用。TRPM7不僅僅是對(duì)Mg2+的通透不可或缺，其對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)也具有重要作用。目前大量的研究顯示TRPM7對(duì)細(xì)胞的生存有重要的功能，在細(xì)胞水平，TRPM7調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肥大細(xì)胞的存活[1～3]。在敲除鳥類B淋巴細(xì)胞TRPM7基因后，細(xì)胞對(duì)Mg2+的攝取發(fā)生障礙，失去生長(zhǎng)能力，存活期也大大縮短，而重新轉(zhuǎn)入TRPM7基因后異?，F(xiàn)象得以糾正[4]。研究顯示TRPM7成為氧糖剝奪神經(jīng)元損傷過程中引起非谷氨酸依賴性的鈣超載的重要分子[2]。本試驗(yàn)應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞上TRPM7，觀察下調(diào)TRPM7對(duì)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響，為深入研究心肌細(xì)胞中TRPM7的功能及心肌細(xì)胞中TRPM7與Mg2+關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為相關(guān)心臟疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供更多的試驗(yàn)依據(jù)。

1.材料和方法

1.1材料1天SD大鼠購(gòu)于南通大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心; TRPM7siRNA購(gòu)于上海吉瑪公司; siRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invirgen公司;calcium-Indo 1-AM購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2試驗(yàn)方法和步驟

1.2.1心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)：選擇10只出生1天左右的SD大鼠，在超凈臺(tái)內(nèi)消毒后取出心臟剪下心尖部分，剪碎心尖放于裝有胰酶和Ⅰ型膠原酶混合物的小瓶?jī)?nèi)，37℃震蕩消化后收集心肌細(xì)胞，反復(fù)幾次后將得到的心肌細(xì)胞移到培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后進(jìn)行心肌細(xì)胞存活度檢測(cè)。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)： 將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與siRNA充分結(jié)合，25分鐘后將混合液加入到培養(yǎng)24小時(shí)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，60小時(shí)后再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的檢測(cè)：將calcium-indo-1的終濃度用孵育液稀釋到3μM，然后孵育細(xì)胞30分鐘，重復(fù)一次后測(cè)量熒光強(qiáng)度。鎂離子熒光探針calcium-indo-1的熒光強(qiáng)度的變化代表胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)是應(yīng)用Image J軟件對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

2.結(jié)果

2.1大鼠心肌細(xì)胞存活度的檢測(cè)原代大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)完成后，接種前用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活度。將細(xì)胞懸液與1%的臺(tái)盼藍(lán)溶液以1:1的比例混合均勻滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，于3分鐘內(nèi)在顯微鏡下計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，無色透明狀的為活細(xì)胞，染成藍(lán)色的為死細(xì)胞。點(diǎn)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，著色細(xì)胞數(shù)量為26個(gè)，細(xì)胞存活率為374/400×100%=93.5%。

A為空白對(duì)照；B為NC siRNA對(duì)照組；C為trpm7 siRNA試驗(yàn)組；D為轉(zhuǎn)染trpm7 siRNA 48小時(shí)后心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖；E為轉(zhuǎn)染trpm7 siRNA 60小時(shí)后心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖。圖1　trpm7 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞48小時(shí)和60小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 變化圖

2.2大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的檢測(cè)用calcium-indo-1孵育細(xì)胞后測(cè)量熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示(圖1)，trpm7 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞48小時(shí)和60小時(shí)后，胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度分別升高3%(P>0.05)和降低5%(P>0.05)，即胞內(nèi)游離Ca2+濃度沒有顯著變化。

3.討論

Ca2+是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要的二價(jià)陽離子之一，Ca2+的代謝對(duì)機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)有著重要的作用，它是維持細(xì)胞各項(xiàng)功能所必需的。TRPM7是一種具有離子通道和蛋白激酶雙重結(jié)構(gòu)的雙功能蛋白，作為一種非選擇性陽離子通道，TRPM7可通透多種單價(jià)、二價(jià)陽離子，研究顯示Mg2+通過TRPM7通道流入細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+水平改變，并引起各種細(xì)胞應(yīng)答[2，5，6]，在多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)TRPM7作為鎂離子通道行使其功能。

本課題應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)大鼠心肌細(xì)胞的TRPM7后，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)游離Ca2+濃度沒有顯著變化，推測(cè)TRPM7在心肌細(xì)胞的功能受到Ca2+的影響不顯著。由于TRPM7優(yōu)先對(duì)Mg2+和Ca2+通透，那么本課題的研究為以后深入開展心肌細(xì)胞中TRPM7的功能與Mg2+關(guān)系的研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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作者單位：濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院261041

The study is to investigate the impacts of downregulation of TRPM7 on calcium homeostasis in rat cardiomyocytes

(ZHAOHongxia,LIFaen.Weifangnursingvocationalcollege,Weifang261041，China.)

【Abstract】ObjectivesTRPM7 is a magnesium and calcium permeable channel expressed in cardiac myocytes.In order tostudy the function of TRPM7gene in myocardial cells deeply，this study tried to determined the impacts of downregulation of TRPM7 on calciumhomeostasis in rat cadiocyte.MethodsPrimary culture of rat myocardial cells, determination of the degree of myocardial cells survive, siRNA technique, detection of the fluorescence intensity of intracellular free Ca2+concentration in rat myocardial cells. ResultsThe fluorescence intensity of calcium in rat cadiocyte were no significant change after downregulation TRPM7. ConclusionsThere was no significant effect on calcium metabolism in rat cadiocyte in culture after downregulation TRPM7.

【Key words】TRPM7, siRNA, intracellular free Ca2+concentration, cadiocyte

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2016.02.014

收稿日期：2016-3-11