東　紅　杜改煥　李妍怡　邵　亞　周立文　崔　曉

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※為通訊作者

岷當歸提取物對血管性認知功能障礙模型大鼠海馬Bcl-2與Bax 蛋白表達的影響

東紅1※杜改煥1李妍怡1邵亞1周立文1崔曉2

【摘要】目的通過對岷當歸的主要有效成分的提取與分離，觀察不同岷當歸提取物對血管性認知功能障礙模型大鼠神經(jīng)凋亡細胞Bcl-2和Bax表達的影響，探討岷當歸提取物對模型大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響及可能的作用機制。方法采用雙側(cè)頸總動脈反復夾閉+單側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法制備慢性腦低灌注大鼠血管性認知功能障礙模型。選取雄性wistar大鼠60只，隨機分為假手術組(sham-operation group，S)、模型組(model group，M)、尼莫地平對照組(Nimodipine control group，N)、當歸揮發(fā)油組(Volatile oil from Angelica sinensis group，V)、 當歸多糖組(Angelica polysaccharide group，P)、岷當歸水煎劑組(Min angelicasinensis water decoction group，X)6 組。除假手術組S組外其余M組、N組、V組、P組、X組各組采用反復夾閉雙側(cè)頸總動脈+硝普鈉注射+單側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法，制備慢性腦低灌注大鼠血管性認知功能障礙模型。S組、M組給予生理鹽水灌胃，N組給予尼莫地平灌胃，V組給予當歸揮發(fā)油灌胃，P組給予當歸多糖灌胃，X組給予岷當歸水煎劑灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃治療4周。灌胃結(jié)束后第1天、第4天、第5天進行行為學試驗(水迷宮法)。斷頭處死大鼠，留取腦組織，光鏡下觀察HE染色病理切片，免疫組織化學方法檢測Bcl-2和Bax表達，高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)定量分析。結(jié)果Morris水迷宮試驗顯示：各干預組都有提高學習記憶能力的作用，尤以岷當歸水煎劑組記憶力改善明顯，優(yōu)于尼莫地平組、當歸多糖組和當歸揮發(fā)油組(P<0.01)；尼莫地平組、當歸多糖組、當歸揮發(fā)油組與岷當歸水煎劑組比較均能促進VCI模型大鼠Bal-2蛋白的表達、抑制VCI模型大鼠bax蛋白的表達(P<0.05)，尤以岷當歸水煎劑組效果最佳(P<0.01)。結(jié)論當歸揮發(fā)油、當歸多糖、岷當歸水煎劑均能降低血管性認知功能障礙模型大鼠腦組織細胞凋亡基因bax的表達，增加具有神經(jīng)元保護作用的bcl-2基因表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，加速神經(jīng)功能的恢復，共同發(fā)揮腦保護作用，但水煎劑作用更為明顯，體現(xiàn)了各種有效成分相互協(xié)調(diào)的優(yōu)勢。

【關鍵詞】血管性認知功能障礙Bcl-2Bax當歸提取物尼莫地平

隨著經(jīng)濟水平的加速，全球經(jīng)濟的高速發(fā)展，老齡化問題逐漸凸顯，伴隨著人口老齡化的發(fā)展，血管性疾病的發(fā)生率愈來愈高，由此導致的認知功能障礙發(fā)病率也呈增高的趨勢，已成為21世紀嚴重威脅老年人生存質(zhì)量的疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為，慢性腦缺血是血管性認知功能障礙(VCI)的重要病理基礎[1]，如果早期對VCI進行干預，可明顯改善生存質(zhì)量，避免其發(fā)展到癡呆的晚期階段[2]。隨著祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的發(fā)展，在對中藥的不斷研究中發(fā)現(xiàn)：中藥在VCI的預防和治療方面具有多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)等優(yōu)點。中藥預防和治療VCI的作用日益受到研究者的重視，并己成為治療VCI的重要手段。本研究通過雙側(cè)頸總動脈反復夾閉+單側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法制備慢性腦低灌注大鼠血管性認知功能障礙模型，用岷當歸提取物分別進行治療，觀察大鼠學習、記憶能力，免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax的表達，尋找岷當歸提取物治療與神經(jīng)保護之間的關系，探析其對神經(jīng)保護的作用機制，為岷當歸提取物制劑的市場化提供試驗依據(jù)及奠定理論依據(jù)，為VCI患者找到一種高效廉價的預防和治療藥物。

1.材料與方法

1.1動物SPF級健康雄性wistar大鼠60只，體重200±20g，由甘肅中醫(yī)學院科研試驗動物中心提供，試驗動物質(zhì)量合格證編號：SYXK(甘)2011-0001。

1.2岷當歸成分的分離與提取取岷當歸藥材粉碎后至超臨界萃取釜中，在萃取壓力25Mpa萃取溫度為40℃、解析壓力6Mpa、解析溫度為50℃，CO2流量為20L/h條件下萃取2小時，收集當歸揮發(fā)油。取超萃取后的當歸藥材，置不銹鋼鍋中煎煮3次，第一次加入6倍水煎90分鐘，第二次加入4倍水煎煮60分鐘，第三次加入4倍水煎煮40分鐘；過濾，合并濾液，加熱濃縮成稠膏，放冷，加入95%乙醇配成60%的醇溶液，放置過夜，過濾，分別收集濾液、沉淀物，濾液加熱濃縮至無醇味稱重，沉淀物稍微風干稱重。沉淀物為當歸多糖，濾液為黃酮、皂苷。

1.3岷當歸水煎劑的制備取岷當歸100g，加蒸餾水浸泡30分鐘，煮沸2次，每次2小時。合并水煎液，濃縮至水煎液濃度為1g(生藥)/ml，4℃保存。

1.4主要試驗試劑兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體(北京中杉金橋生物科技有限公司)，兔抗大鼠Bax多克隆抗體(北京中杉金橋生物科技有限公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)、兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)、多聚甲醛(天津科化)、二氧化鈦(天津光復精細化工研究所)。Bcl-2(兔抗人多克隆抗體)濃縮型，工作濃度1:150，購自北京中杉生物技術有限公司；Bax(兔抗人多克隆抗體)濃縮型，工作濃度1:100，購自北京中杉生物技術有限公司。

1.5分組及模型制備方法將所有大鼠稱重后，按隨機數(shù)字表法，隨機選取8只作為假手術組(S組)，其余大鼠制備慢性腦低灌注大鼠血管性認知功能障礙模型，造模方法采用雙側(cè)頸總動脈反復夾閉+單側(cè)頸總動脈結(jié)扎法。10%水合氯醛(0.3ml/100g體重)腹腔注射法麻醉后，將試驗大鼠仰臥位固定在手術臺上，頸部正中切口，剝離組織，暴露頸總動脈和迷走神經(jīng)，分離迷走神經(jīng)和頸總動脈，向腹腔內(nèi)注射硝普鈉2.5mg/kg，造成低血壓，隨后立即用無創(chuàng)微動脈夾，夾閉雙側(cè)頸總動脈，10分鐘后，放開微動脈夾，10分鐘后，再次夾閉，反復3次，之后結(jié)扎右側(cè)頸總動脈。假手術組只分離動脈不結(jié)扎，不注射硝普鈉。手術后適量青霉素抗感染，在完全縫合消毒后，觀察狀態(tài)，術后注意觀察傷口情況，常規(guī)飼養(yǎng)。動物蘇醒后出現(xiàn)眼瞼下垂，眼裂變小說明手術成功。造模過程中，1只死于腦水腫，2只死于出血過多，2只死于感染，1只肢體活動障礙，1只未達癡呆標準，1只死于喂養(yǎng)不當。剔除不合格大鼠后再次按隨機數(shù)字表法隨機將大鼠分為模型組(M組)、尼莫地平對照組(N組)、當歸揮發(fā)油組(V組)、 當歸多糖組(P組)、岷當歸水煎劑組(X組)5組，每組8只。

1.6灌胃給藥大鼠給藥劑量按人與大鼠體表面積進行換算。假手術組、模型組給予生理鹽水灌胃，尼莫地平組給予尼莫地平9mg/kg灌胃，當歸揮發(fā)油組給予當歸揮發(fā)油提取物75mg/kg 灌胃，當歸多糖組給予當歸多糖提取物0.1g/kg灌胃，岷當歸水煎劑組給予岷當歸水煎液1.08g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃治療4周。

1.7試驗檢測方法及指標

1.7.1行為學測試：采用Morris水迷宮[3]法分別于灌胃結(jié)束后第1天、4天、5天對大鼠進行定位航行試驗和空間探索試驗，并分別進行數(shù)據(jù)記錄。

1.7.2Bcl-2與Bax指標檢測：行為學試驗結(jié)束后，將大鼠脫頸處死，然后取下頭顱，并在冰盤上快速取出腦組織，棄去嗅球及小腦，沿矢狀線正中切開取腦并進行固定，選擇海馬區(qū)，標本固定后切片，進行HE染色，用免疫組織化學方法檢測Bcl-2和Bax的表達，光鏡下觀察組織病理學改變，采用對Bal-2，Bax平均光密度進行病理圖文定量分析。

2.結(jié)果

2.1大鼠Morris水迷宮檢測試驗數(shù)據(jù)①定位航行試驗：分別于給藥結(jié)束后第1 天和第4天對大鼠的學習成績與記憶成績進行測試，結(jié)果顯示：給藥后第1天、4天，M組、N組、P組、V組、X組各組與 S組相比，游全程時間延長，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與 M組比較，給藥結(jié)束后第1天，N組、V組無顯著性統(tǒng)計學意義(P>0.05)，P組、X組有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。給藥結(jié)束后4天，N組、P組、V組、X各組與 M 組比較，游全程時間延長，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。②空間搜索試驗 給藥結(jié)束后第5天，M 組大鼠的反應時間延長，撤除平臺后跨越原平臺次數(shù)明顯減少，與 S 組比較，有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。X組與M組比較，反應時間有所縮短，在撤除平臺后，大鼠跨越原平臺的次數(shù)明顯增加，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)；X組與N組、P組、V組各組比較,跨越原平臺次數(shù)明顯多于其他各組，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；M組、N組、P組、V組各組之間比較無顯著性統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1　逃避潛伏期時間和通過原平臺位置次數(shù)比較±s)

注：與假手術組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05，▲P<0.01，▽P>0.05。

2.2IPP圖像分析系統(tǒng)定量分析M組大鼠Bal-2，Bax平均光密度，與 S 組比較差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Bal-2平均光密度，N組、P組、X組各組與 M 組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)；Bax平均光密度值增高,N組、P組、X組各組與 M 組比較，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，X組Bal-2平均光密度較模型組顯著增加，Bax平均光密度較模型組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2　Bcl-2和Bax平均光密度比較

注：與假手術組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05，▲P<0.01，▽P>0.05。

2.3病理組織學觀察

2.3.1HE染色切片觀察：與假手術組相比，模型組神經(jīng)細胞排列出現(xiàn)紊亂，細胞界限不清晰，結(jié)構(gòu)欠清晰。細胞形態(tài)不規(guī)則，樹突減少。細胞周圍間隙增寬。核漿比例增加，核大，染色深，染色質(zhì)粗大，多見核內(nèi)空泡，間質(zhì)水腫明顯，膠質(zhì)細胞明顯增生。尼莫地平組結(jié)構(gòu)欠清晰，排列輕度紊亂，細胞數(shù)量相對減少，核大，核漿比例增加，可見核內(nèi)空泡。間質(zhì)內(nèi)可見膠質(zhì)細胞增生。當歸多糖組細胞結(jié)構(gòu)較清晰，排列輕度紊亂，細胞數(shù)量相對減少，可見核內(nèi)空泡。間質(zhì)內(nèi)可見膠質(zhì)細胞增生。當歸揮發(fā)油組細胞結(jié)構(gòu)清晰，排列較整齊，核漿比例正常，染色細膩，細胞數(shù)量相對減少，間質(zhì)內(nèi)可見膠質(zhì)細胞增生。岷當歸水煎劑組大多數(shù)細胞排列整齊，細胞數(shù)目減少，膠質(zhì)細胞增生。結(jié)果見圖1。

注：S組：假手術組，M組：模型組，N組：尼莫地平組，P組：當歸多糖組，V組：當歸揮發(fā)油組，X組：岷當歸水煎劑組 (海馬 HE×40)。圖1

2.3.2免疫組化染色觀察：Bcl-2蛋白主要表達于神經(jīng)細胞的胞漿和細胞膜，DAB顯色呈棕黃色者即為陽性細胞。假手術組有少量表達,模型組表達明顯增加(P<0.05)。與模型組比較, 尼莫地平組、當歸多糖組、當歸揮發(fā)油組和岷當歸水煎劑組Bcl-2表達顯著增加，且岷當歸水煎劑更優(yōu)于其他組(P<0.05)。 Bax蛋白分布在神經(jīng)細胞的胞漿、突起和核膜上，DAB顯色呈棕黃色著色為陽性細胞。假手術組僅有少量表達，模型組表達顯著增多(P<0.05)。與模型組比較, 尼莫地平組、當歸多糖組、當歸揮發(fā)油組和岷當歸水煎劑組Bax表達顯著降低，且岷當歸水煎劑組低于其他組(P<0.05)。結(jié)果見圖2、圖3。

3.討論

血管性認知功能障礙(VCI)是由腦部血管疾病所導致的一類精神障礙類疾病，已成為21世紀嚴重威脅老年人生存質(zhì)量的疾病。目前，對VCI的認識還很不足，對其病因、發(fā)病機制、藥物治療及預后仍未闡明，多數(shù)學者認為腦部血氧不足可以引起大腦神經(jīng)元和腦白質(zhì)神經(jīng)纖維的損害，受到損害的腦部組織由膠質(zhì)細胞替代進而逐漸出現(xiàn)認知功能障礙[4]，相關研究認為基底節(jié)、丘腦等重要部位梗死或出血導致認知障礙的概率明顯增加，且許多高級智能活動中樞主要存在左側(cè)大腦半球，其損傷病變導致認知障礙較右半球嚴重[5]。另外，反復短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)不但會引起認知障礙，還會導致腦梗死，在認知和記憶障礙上TIA的誘發(fā)率分別為23%和54%[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為，細胞的自然死亡是在受到內(nèi)外環(huán)境的刺激下，啟動控制細胞死亡的基因點，而由腦部缺血因素引起的梗死灶和神經(jīng)功能損傷在這一過程中起著負面影響。Bcl-2所包含的基因家族在細胞的凋落死亡過程中發(fā)揮著重要作用，主要表現(xiàn)在由它們的表達所生成的產(chǎn)物促使細胞的成活，而Bax則加速了所起作用的細胞凋落死亡[7]。袁敏[8]等通過研究顯示，血管性癡呆的大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點自噬相關蛋白Beclin-1表達數(shù)與凋亡相關蛋白Bcl-2表達數(shù)呈正相關，表明了血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)細胞自噬和凋亡同時發(fā)生，且表達趨勢一致，提示細胞凋亡參與了血管性癡呆的發(fā)病過程。如果早期對VCI進行干預，可明顯改善生存質(zhì)量，避免其發(fā)展到癡呆的晚期階段[2]。

注：S組：假手術組，M組：模型組，N組：尼莫地平組，P組：當歸多糖組，V組：當歸揮發(fā)油組，X組：岷當歸水煎劑組(免疫組化×40)。圖2　各組大鼠海馬Bcl-2表達比較

注：S組：假手術組，M組：模型組，N組：尼莫地平組，P組：當歸多糖組，V組：當歸揮發(fā)油組，X組：岷當歸水煎劑組(免疫組化×40)。圖3　各組大鼠海馬Bax表達比較

目前臨床上的治療藥物主要是膽堿酯酶抑制劑、改善腦部血流循環(huán)、腦部細胞激活劑、神經(jīng)細胞保護劑以及雌激素代替療法等。這些藥物雖有一定的療效但是存在缺點頗多，如療效不穩(wěn)定，藥品價格昂貴等這些弊端，患者多不能長期堅持服用，這大大影響了臨床的預后，因此，如何選擇更加經(jīng)濟且療效顯著的藥物成為現(xiàn)代醫(yī)學研究的一大熱點。隨著祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的發(fā)展，在對中藥的不斷研究中發(fā)現(xiàn)：中藥在VCI的預防和治療方面具有多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)等優(yōu)點。中藥預防和治療VCI的作用日益受到研究者的重視，并己成為防治VCI的重要手段。

中藥治療方面主要通過補腎、活血、祛痰等方法，大大改善神經(jīng)遞質(zhì)傳導，改善微循環(huán)，改善自由基代謝，抗細胞凋亡，調(diào)節(jié)基因表達的作用，在防治血管性癡呆的過程中起到了重要的作用。如：胡玉英[9]選用交泰丸，通過交通心腎來治療癡呆，發(fā)現(xiàn)交泰丸可降低VD大鼠腦MAO活性，提高NE，DA，5-HT 含量；王鵬[10]通過試驗得出：銀杏葉提取物可增加海馬中生長抑素(SS)和膽囊收縮素(CCK)的表達，在一定程度上改善VD小鼠的學習記憶能力；王瑩[11]指出紅景天苷能夠減輕反復腦缺血再灌注所致的神經(jīng)細胞層次不凊，突觸減少，核固縮等病理改變，從而達到改善血管性癡呆小鼠學習記憶能力的作用。徐新利[12]在對岷當歸水煎液對小鼠缺氧的試驗中發(fā)現(xiàn)，其水煎液可以使小鼠在非正常條件下的游泳和存活時間延長，也就是在缺氧的情況下，與模型組比較差異顯著(P<0.01)，驗證了岷當歸水煎液對疲勞和缺氧有良好的治療作用。李氏[13]通過試驗表明，對大鼠腦部血流缺失的再灌注可以使損傷的神經(jīng)起到保護作用。

本試驗結(jié)果顯示各干預組都有提高學習記憶能力的作用，且可明顯減少VCI大鼠細胞凋亡的趨勢，促進VCI模型大鼠Bal-2蛋白的表達，抑制VCI模型大鼠Bax蛋白的表達，起到保護神經(jīng)元的缺血、保護神經(jīng)細胞的作用，其機理可能是抑制細胞的凋落死亡。另外，岷當歸水煎劑組與尼莫地平組、當歸多糖組、當歸揮發(fā)油組相比(P<0.01)，驗證了中藥水煎劑組中各個有效成分的協(xié)調(diào)作用優(yōu)于有效成分組，體現(xiàn)了傳統(tǒng)醫(yī)藥的優(yōu)勢，臨床使用更為便利。

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作者單位：1.甘肅省中醫(yī)院7300502.甘肅中醫(yī)學院730000

作者簡介：東紅，女，本科，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腦血管病防治。

基金項目：甘肅省自然科學研究基金(1107RJZA224)

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2016.02.007

收稿日期：2016-3-10