唐德智

南寧食品藥品檢驗所，廣西　南寧　530001

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UPLC波長切換法測定玉葉清火片中3種成分的含量

唐德智

南寧食品藥品檢驗所，廣西南寧530001

【摘要】目的：建立UPLC波長切換法測定玉葉清火片中梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。方法：采用Agilent ZORBAX RRHD C18(2.1 mm×100mm, 1.8μm)色譜柱；流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)系統(tǒng)梯度洗脫，流速為0.2 ml/min，柱溫：30℃，波長切換時間序列采樣: 0～6 min 為238 nm，6～16min為225 nm，16～25 min為254 nm。結(jié)果：梔子苷進樣量在0.026～0.232 μg范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9997，n=5)，平均回收率為99.95%，RSD為1.05%(n=9) ；穿心蓮內(nèi)酯進樣量在0.025～0.222μg范圍內(nèi)線性關系良好(r=0. 999 8，n=5)，平均回收率為99.92%，RSD為1.19%(n=9)；脫水穿心蓮內(nèi)酯進樣量在0.015～0.137 μg范圍內(nèi)線性關系良好 (r=0. 999 8，n=5)，平均回收率為99.12%，RSD為1.52%(n=9)。結(jié)論：該方法簡便、快捷、準確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

【關鍵詞】玉葉清火片；梔子苷；穿心蓮內(nèi)酯；脫水穿心蓮內(nèi)酯；UPLC；波長切換法

玉葉清火片是由玉葉金花、穿心蓮、梔子、墨旱蓮、倒扣草等5味中藥制成的中藥制劑，為國家中成藥標準匯編收載品種，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，臨床用于喉痹，暴喑，急性咽喉炎以及其他風熱癥的治療。方中穿心蓮為臣藥，具有清熱解毒、涼血、消腫的功效，2010年版《中國藥典》一部將穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯作為穿心蓮藥材的質(zhì)量控制指標[1]；梔子為臣藥，具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒的功效，2010年版《中國藥典》一部將梔子苷作為梔子藥材的質(zhì)量控制指標[2]。玉葉清火片質(zhì)量標準中含量測定項為用HPLC測定穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。制劑中另一主要藥味梔子只有薄層鑒別項目，無含量測定方法[3]。HPLC分別測定梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯含量含量的方法已有報道[4-5]，但同時測定方法尚未見。實驗參考相關文獻道[6-8]，建立超高效液相色譜波長切換法同時測定玉葉清火片中梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的方法。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1290 Infinity 超高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；UV-2550型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；S180H型超聲波清洗器(德國Elma公司)；XS205DU型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。1.2試藥對照品梔子苷(批號：110749-201115)、穿心蓮內(nèi)酯(批號：110797-201108)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(批號：110854-201308)均購自中國食品藥品檢定研究院；玉葉清火片(批號：20130326、20130513、20130718、20131007、20131028，廣西純正堂制藥廠)。甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品儲備液精密稱取梔子苷對照品19.43 mg、穿心蓮內(nèi)酯對照品18.71mg和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品11.41mg，置50ml棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得含有梔子苷0.3874mg/ml、穿心蓮內(nèi)酯0.3694mg/ml、脫水穿心蓮內(nèi)酯0.2276mg/ml的混合對照品儲備溶液。

2.1.2供試品溶液取本品10片，除去包衣，研細，混勻，取約1.5g，精密稱定，置50ml棕色量瓶中,加入甲醇約45ml，浸漬30min，超聲處理(功率300W，頻率33kHz)30min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液,用0.22μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3陰型樣品溶液按處方比例分別稱取除穿心蓮、梔子外其他藥材適量，按玉葉清火片的制備工藝制得缺穿心蓮的陰性樣品及缺梔子的陰性樣品，按照供試品溶液制備項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2色譜條件色譜柱: Agilent ZORBAX RRHD C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相:A為甲醇，B為0.1%的磷酸水溶液，0～5 min，27%A、5～8 min，27%～50%A、8～25 min，50%A；檢測波長：0～6min為238 nm(梔子苷)、6～16min為225 nm(穿心蓮內(nèi)酯)、16～25min為254 nm(脫水穿心蓮內(nèi)酯)；流速為0.2 ml/min；柱溫30℃；進樣量：1μl。2.3檢測波長的選擇用紫外分光光度計分別對對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，梔子苷在238 nm波長處有最大吸收，穿心蓮內(nèi)酯在225 nm波長有最大吸收，脫水穿心蓮內(nèi)酯在254 nm波長有最大吸收，與《中國藥典》梔子 、穿心蓮2味中藥有效成分標注的檢測波長一致，由此確定梔子苷的檢測波長為238 nm，穿心蓮內(nèi)酯的檢測波長為225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯的檢測波長為254 nm。

2.4專屬性試驗分別精密吸取供試品溶液、對照品混合溶液的稀釋液、缺“穿心蓮”和缺“梔子”的陰性樣品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣。結(jié)果，在供試品溶液色譜圖中，分別有與穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷保留時間一致的特征峰，陰性樣品無此特征峰，表明陰性樣品對所測成分無干擾。色譜圖見圖1。

2.5線性關系考察精密吸取“2.2”項下混合對照品儲備溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL置15 ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成標準系列溶液。按照“2.2”項下色譜條件測定，分別進樣1μl，測得峰面積的積分值。以對照品的進樣量為橫坐標 (x)，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。梔子苷回歸方程及相關系數(shù)為Y=1.516×103x-13.25，r=0.9997(n=5)，進樣量在0.026～0.232 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性；穿心蓮內(nèi)酯回歸方程及相關系數(shù)為Y=1.989×103x-2.78，r=0.9998(n=5)，進樣量在0.025～0.222 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性；脫水穿心蓮內(nèi)酯回歸方程及相關系數(shù)為Y=1.337×103x-2.65，r=0.9998(n=5)，進樣量在0.015～0.137 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性。

2.6精密度試驗精密吸取“2.5”項下混合對照品溶液1μl，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下重復進樣6次，以梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮的峰面積計算相對標準偏差(RSD )，分別為 0.9%、0.7%、1.2%，結(jié)果表明儀器的精密度符合要求。

2.7穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液 (批號：20130718)，分別在1、2、4、6、8、10、12 h內(nèi)進樣分析，進樣量1μl，梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的相對標準偏差(RSD )分別為 1.6%、1.7%、1.4%。結(jié)果表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可滿足檢測時間的需要。

2.8重復性試驗取同一批樣品粉末(批號：20130718)1.5 g,精密稱定6份，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液, 進樣1μl，測得樣品中梔子苷平均含量為4.37 mg/g，RSD為1.5%；穿心蓮內(nèi)酯平均含量為4.18 mg/g，RSD為1.2%；脫水穿心蓮內(nèi)酯平均含量為2.47 mg/g，RSD為1.3%。結(jié)果表明本法重復性好。

2.9加樣回收率試驗精取稱取已測知含量的同一批號樣品粉末(批號：20130718)9份，每份 0.75g，精密稱定，置50 ml棕色量瓶中, 分別精密加入混合對照品溶液(梔子苷0.6628mg/ml、穿心蓮內(nèi)酯0.6272mg/ml、脫水穿心蓮內(nèi)酯0.3744mg/ml)4.0、5.0、6.0 ml，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣1μl測定，計算回收率。結(jié)果梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均回收率(n=9)分別為99.95%、99.92%、99.12%，RSD分別為1.05%、1.19%、1.52%，表明本方法的準確度良好。

2.10樣品測定取5批樣品粉末，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下上述色譜條件進樣進樣1μl，用外標法計算樣品中梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，見表1。

表1　樣品測定結(jié)果　(n=5)

3討論

3.1試驗中對供試品溶液的處理方法進行了考察。采用甲醇索氏提取、加熱回流及超聲振蕩提取，結(jié)果表明，超聲振蕩提取效果較好，故采用超聲振蕩法提?。辉俜謩e以乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇作為提取溶劑，采用超聲振蕩法對供試品進行提取，并對超聲振蕩時間進行考察。結(jié)果表明，以甲醇超聲提取30min效果最好。

3.2實驗考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)的分離效果，并優(yōu)化了流動相中磷酸的濃度，最終選擇甲醇-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫，此系統(tǒng)下3中指標成分的分離效果及峰形較好，分離時間適中。

3.3為達到檢測靈敏度高、干擾小的目的，利用Agilent 1290紫外檢測器可變波長功能，建立HPLC波長切換法同時測定玉葉清火片中3個有效成分的含量，以保證各成分在最大吸收波長處檢測，獲得最佳檢測效果。

3.4將超高效液相色譜用于玉葉清火膠囊中梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測定研究，與傳統(tǒng)HPLC法相比較，能更快速、精確地完成玉葉清火片的質(zhì)量分析。

參考文獻

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作者簡介：唐德智,副主任中藥師, 主要從事中藥制劑質(zhì)量控制研究。 E-mai:tangdz7497@163.com

【中圖分類號】R284.1

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)09-0026-02

(收稿日期：2016.03.03)