謝一泓，黎丹戎

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適用于多細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)孔板的研制

謝一泓，黎丹戎

作者單位：122000 遼寧，朝陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（謝一泓）；530021南寧，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)學(xué)院（黎丹戎）

細(xì)胞微環(huán)境即細(xì)胞生長所處的內(nèi)環(huán)境，由多因素組成，對細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能起重要作用，不僅影響細(xì)胞的正常生理過程，也影響細(xì)胞的病理過程。

體外細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)的重要途徑，但單一細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)環(huán)境相差很大［1-2］，因此會影響細(xì)胞的生長狀態(tài)、功能特性等，使體內(nèi)外研究結(jié)果不一致。細(xì)胞共培養(yǎng)即將不同種類細(xì)胞混合共同培養(yǎng)，主要有兩種方法：直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)。直接共培養(yǎng)體系［3］是將 2 種或2 種以上的細(xì)胞按一定比例同時(shí)接種于同一培養(yǎng)器材內(nèi)，不同類型的細(xì)胞之間直接接觸培養(yǎng)。間接共培養(yǎng)體系，即將2 種或 2 種以上的細(xì)胞分別接種于不同的載體上，然后將這兩種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，即不同種類的細(xì)胞共用同一種培養(yǎng)系統(tǒng)而不直接接觸，如 Transwell 小室共培養(yǎng)皿［4］。

現(xiàn)有的共培養(yǎng)技術(shù)存在一定的不足及局限性，直接共培養(yǎng)體系的多種細(xì)胞培養(yǎng)后無法分離進(jìn)行后續(xù)研究，不能滿足實(shí)驗(yàn)需求。間接共培養(yǎng)體如 Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)，只能進(jìn)行兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，無法實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞共培養(yǎng)，且兩種細(xì)胞中有一種生長在膜上，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)不便。為使體外研究能夠更好地反映體內(nèi)情況，滿足實(shí)驗(yàn)需求，研制適用于多細(xì)胞共培養(yǎng)孔板成為當(dāng)務(wù)之急。該孔板有利于細(xì)胞間信號傳遞和細(xì)胞因子相互作用，為細(xì)胞的生長及生物學(xué)功能的發(fā)揮提供適宜的微環(huán)境，可更加準(zhǔn)確模擬體內(nèi)環(huán)境。

1　材料與方法

1.1材料

細(xì)胞共培養(yǎng)孔板，包括若干個(gè)相互連接的培養(yǎng)孔、活塞、聚碳酸酯隔膜，活塞采用硅膠或與培養(yǎng)板材質(zhì)相同材料制作，細(xì)胞共培養(yǎng)孔板材質(zhì)采用國際通用的具有較好光學(xué)性能、透明性和生物相容性的聚苯乙烯制作。

1.2方法

本細(xì)胞共培養(yǎng)孔板包括若干個(gè)相互連接的培養(yǎng)孔，相鄰的培養(yǎng)孔之間設(shè)有通孔，通孔可由活塞密封，活塞上設(shè)有手柄方便裝卸，使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可卸下 1 個(gè)或多個(gè)活塞，使培養(yǎng)孔之間互通，達(dá)到培養(yǎng)液互通，從而各細(xì)胞分泌或代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)相互影響，相互作用；同時(shí)通孔處還可安裝隔膜進(jìn)行懸浮細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。用于開展多細(xì)胞共培養(yǎng)后分泌或代謝產(chǎn)物的變化研究或針對某一特定靶細(xì)胞生物學(xué)變化的研究。

圖1　細(xì)胞共培養(yǎng)六孔板模型圖

2　結(jié)果

圖1 為細(xì)胞共培養(yǎng)六孔板，通過活塞的開閉或聚碳酸酯膜的作用實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)目的，用于研究人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（HLEC）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的不同微環(huán)境對卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞（SKOV3-PM4）的影響，為闡明卵巢癌轉(zhuǎn)移發(fā)展機(jī)制提供理論依據(jù)［5-6］。以細(xì)胞共培養(yǎng)六孔板為例，A 細(xì)胞為 HLEC 細(xì)胞，C 細(xì)胞為 SKOV3-PM4 細(xì)胞，E 細(xì)胞為 HUVEC細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中，如需要觀察 HLEC細(xì)胞對 SKOV3-PM4 細(xì)胞的影響，可打開 A、C 細(xì)胞培養(yǎng)孔的通孔，實(shí)現(xiàn)兩者的共培養(yǎng)；如需要觀察 HUVEC 細(xì)胞對 SKOV3-PM4 細(xì)胞的影響，可打開 C、E 細(xì)胞培養(yǎng)孔的通孔，實(shí)現(xiàn)兩者的共培養(yǎng)；如需要觀察 HLEC 和 HUVEC細(xì)胞對 SKOV3-PM4 細(xì)胞的共同影響，可打開 A、C 和 C、E 細(xì)胞培養(yǎng)孔的通孔，實(shí)現(xiàn)三者的共培養(yǎng)。共培養(yǎng)一定時(shí)間后，可顯微鏡下觀察 SKOV3-PM4 的形態(tài)變化，提取其RNA 和蛋白質(zhì)進(jìn)行基因及蛋白水平表達(dá)變化的研究，提取其培養(yǎng)基上清與單獨(dú)培養(yǎng)的癌細(xì)胞培養(yǎng)基上清相比，測其分泌蛋白的變化情況；還可加入成纖維細(xì)胞等進(jìn)行共培養(yǎng)。同時(shí)可進(jìn)行多組實(shí)驗(yàn)的觀察比較，如 A、C、E 培養(yǎng) HLEC 細(xì)胞，B 培養(yǎng) SKOV3-PM4 細(xì)胞，D 培養(yǎng)過表達(dá) SPARC 基因的 SKOV3-PM4 細(xì)胞［7］，F(xiàn) 培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞 SKOV3 （SKOV3-PM4 細(xì)胞的親本細(xì)胞），共培養(yǎng)一定時(shí)間后，可做集落形成、劃痕實(shí)驗(yàn)等測定癌細(xì)胞增殖、遷移能力變化，可用于研究基因干預(yù)對癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。在共培養(yǎng)環(huán)境下，進(jìn)行藥物干預(yù)、研發(fā)、減毒增效研究，比藥物對單一細(xì)胞的研究實(shí)驗(yàn)更貼近體內(nèi)環(huán)境，提高準(zhǔn)確性。同理，通孔處安裝隔膜可進(jìn)行懸浮細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞共培養(yǎng)孔板可進(jìn)行多細(xì)胞在同一培養(yǎng)體系、同一時(shí)間培養(yǎng)，并實(shí)現(xiàn)對其分泌或代謝產(chǎn)物的功能及作用機(jī)制的后續(xù)研究，對靶細(xì)胞可達(dá)到由點(diǎn)及面，有針對性的研究。同時(shí)，還可進(jìn)行體外單藥或多藥相關(guān)作用的研究。

3　討論

本細(xì)胞共培養(yǎng)孔板可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需求，組裝為不同類型和規(guī)格。可實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)，有利于細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)交換，相互影響，相互作用，從而實(shí)現(xiàn)模擬體內(nèi)環(huán)境的作用。同時(shí)，不會造成不同細(xì)胞之間的污染與混雜，易于收獲細(xì)胞，有助于后續(xù)進(jìn)行相關(guān)功能機(jī)制的研究，并可用于體外細(xì)胞藥物研究，具有準(zhǔn)確、可控及方便使用等優(yōu)勢。

經(jīng)市場調(diào)查分析顯示，本培養(yǎng)孔板屬新產(chǎn)品，功能及優(yōu)勢符合科研實(shí)驗(yàn)需求，因此有廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景。但此技術(shù)尚不成熟，還存在一些問題，如培養(yǎng)液的流動性等方面，還需進(jìn)一步的優(yōu)化探索及實(shí)踐。

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·協(xié)會之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.016

通信作者：謝一泓，Email：xieyihongxyh@sina.com

收稿日期：2015-10-19