尹頌超，張云青，薛曉楊，李 歡

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科 廣東 廣州 510630；2.廣州市天河區(qū)冼村街社區(qū)服務(wù)中心 廣東 廣州 440100；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科 廣東 廣州 510080）

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不同劑量中波紫外線照射對角質(zhì)形成細胞的氧化損傷作用

尹頌超1，張云青1，薛曉楊2，李 歡3

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科 廣東 廣州 510630；2.廣州市天河區(qū)冼村街社區(qū)服務(wù)中心 廣東 廣州 440100；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科 廣東 廣州 510080）

［摘要］目的：觀察不同劑量中波紫外線（UVB）照射對角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）的氧化損傷作用。方法：體外培養(yǎng)人永生化角質(zhì)形成細胞，用5mJ/cm2、10mJ/cm2、20mJ/cm2、30mJ/cm2、40mJ/cm2UVB照射，24h后檢測細胞丙二醛（MDA）的含量、超氧化物歧化酶（SOD） 的活性、細胞上清乳酸脫氫酶（ LDH）的含量及角質(zhì)形成細胞的增殖活性。結(jié)果：UVB照射Hacat細胞后，細胞SOD活性降低、MDA含量增加、LDH漏出量增加及細胞增殖抑制均呈劑量依賴性。當劑量達到10mJ/cm2時，首先出現(xiàn)LDH漏出量增加及細胞增殖活性的抑制，20mJ/cm2時Hacat細胞的SOD活性降低，30～40mJ/cm2MDA含量才開始出現(xiàn)明顯增加。結(jié)論：30～40mJ/cm2的UVB照射角質(zhì)形成細胞能誘發(fā)氧化損傷作用，為今后體外光老化研究提供參考。

［關(guān)鍵詞］中波紫外線；角質(zhì)形成細胞；氧化損傷；光老化；光損傷

日光中的紫外線是導(dǎo)致皮膚曬傷、光老化及皮膚癌的重要因素。中波紫外線（Ultraviolet B，UVB）的生物學(xué)效應(yīng)強度是長波紫外線（Ultraviolet A，UVA）的800～1 000倍，可直接作用于DNA或誘發(fā)氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基等機制作用于機體細胞，導(dǎo)致皮膚中自由基濃度增高，是引起皮膚光老化的主要誘發(fā)因素［1］。使用單一的UVB照射是構(gòu)建光老化細胞模型的常用方法，但是目前各研究者使用劑量不同。本文采用不同劑量中波紫外線照射人皮膚角質(zhì)形成細胞建立光老化模型研究其引起的氧化損傷作用，為皮膚光老化體外研究提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實驗細胞株

人永生化角質(zhì)形成細胞Hacat細胞（武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心）。

1.2試劑和儀器

胎牛血清（Gibco公司）； DMEM（dulbecco's modified eagle medium）-高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Amresco公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Amresco公司）；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒，（南京建成公司）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（南京建成公司）。紫外線治療儀（上海希格瑪高技術(shù)有限公司）；紫外線強度計（深圳市欣寶瑞儀器有限公司）；高速冷凍速離心機（德國Hettich公司）；SW-CJ超凈工作臺（上海錦昱科學(xué)儀器有限公司）；TC2123型二氧化碳培養(yǎng)箱（Sheldon公司）；MK3酶標儀（Thermo Fisher公司）

2　方法

2.1HaCaT細胞培養(yǎng)

HaCaT 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置CO2培養(yǎng)箱（培養(yǎng)條件5%CO2、飽和濕度、37℃）中培養(yǎng)。2.2 UVB誘導(dǎo)細胞老化

參考相關(guān)文獻建立細胞光老化模型的方法［2-3］。UVB照射前一天對細胞進行傳代，使其匯合度為50%～70%。照射前將培養(yǎng)液吸去，PBS緩沖液沖洗一次，再加入少量PBS緩沖液覆蓋照射細胞上層，以UVB光源照射，劑量為5mJ/cm2，10mJ/cm2，20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2。正常組細胞不經(jīng)UVB照射處理，作為對照。照射完后，吸棄PBS，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，獲細胞培養(yǎng)上清或細胞，用于后續(xù)實驗。

2.3MTT檢測

將HaCaT細胞以4×104個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，模型組及給藥組按2.2方法造模，對照組按常規(guī)培養(yǎng)。造模后各組給予培養(yǎng)液100μl，培養(yǎng)24h后，小心吸棄培養(yǎng)液，再向各孔加入MTT溶液（5mg/ml）100μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄上清，每孔加DMSO 150μl，振搖15min，使沉淀充分溶解，酶標儀570nm測定吸光度。細胞存活率=模型組OD值/正常組OD值×100%。

2.4SOD活性及LDH、MDA含量檢測

HaCaT細胞接種六孔板UVB照射處理24h后，取上清按照試劑盒說明書操作檢測LDH含量。同時將細胞培養(yǎng)板中加入裂解液150μl每孔覆蓋滿細胞，裂解30min，用移液器輕輕吹打，收集細胞裂解液，按照試劑盒說明書操作檢測細胞SOD活性和MDA 含量。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計，多組計量資料采用單因素方差分析方法進行檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1UVB照射對HaCaT細胞增殖活性的影響

不同劑量紫外線照射HaCaT細胞后，細胞增殖率減低，與正常對照組比，當UVB劑量達到10mJ/cm2時出現(xiàn)顯著差異P＜0.05，20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2有非常顯著差異（P＜0.01），見表1。

表1　UVB照射對Hacat細胞增殖活性的影響?。ā纒，n=6）

表1　UVB照射對Hacat細胞增殖活性的影響?。ā纒，n=6）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

UVB劑量（mJ/cm2） 　 吸光值 　 增殖率0 　 0.545±0.02 　 100% 5 　 0.548±0.02 　 100.55% 10 　 0.412±0.01*　 75.63% 20 　 0.385±0.04**70.67% 30 　 0.305±0.01**55.99% 40 　 0.248±0.01**45.53%

3.2UVB照射對HaCaT細胞氧化損傷的作用

UVB照射HaCaT細胞，隨著照射劑量的不同，細胞受到不同程度的氧化損傷作用，細胞SOD活性降低、MDA含量增加及上清中的LDH含量增加均呈劑量依賴性。當劑量達到10mJ/cm2時，首先LDH漏出量增加明顯（P＜0.05），20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2增加更顯著（P＜0.01）。照射劑量為20mJ/cm2，30mJ/cm2，40mJ/cm2的UVB能使Hacat細胞的SOD活性降低（P＜0.01）。而當劑量達到30～40mJ/ cm2MDA含量才開始出現(xiàn)明顯增加（P＜0.01），見表2。

表2　 UVB照射對HaCaT細胞SOD及MDA、LDH含量的影響?。ā纒，n=6）

表2　 UVB照射對HaCaT細胞SOD及MDA、LDH含量的影響?。ā纒，n=6）

與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

UVB劑量（mJ/cm2） 　 SOD活性（U/mgprot） 　 MDA含量（nmol/mgprot） 　 LDH含量（U/L）0 　 6.15±0.77 0.58±0.05 601±65.07 5 　 6.02±0.74 0.56±0.08 700±95.10 10 　 5.83±0.46 0.61±0.06 792±80.02*20 　 4.74±0.57**0.68±0.08 1020±104.31*30 　 4.08±0.47**　 0.81±0.09**1581±96.44**40 　 3.81±0.34**0.87±0.08**1640±90.63**

4　討論

紫外線照射人及動物的皮膚后，能夠產(chǎn)生較多的活性氧（reactive oxygen species， ROS）［4-5］。正常情況下，細胞內(nèi)存在一系列抗過氧化物酶，如超氧化物歧化酶（SOD）等，可以清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，活性氧與抗氧化酶之間存在一個動態(tài)平衡。當細胞內(nèi)ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力減弱時可致細胞氧化損傷［6-7］。UVB造成的氧化性應(yīng)激還可引發(fā)一系列細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 或轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（AP-1）激活下游基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix Metalloprotease，MMP） 等基因的表達［8］。導(dǎo)致了MMP mRNA 的含量和表達增加，出現(xiàn)光老化的皮損［9］。本文采用不同劑量UVB照射Hacat細胞結(jié)果顯示UVB照射處理Hacat細胞，隨著照射劑量的不同，對細胞產(chǎn)生不同的影響。當照射劑量為5mJ/cm2時，UVB對細胞的影響不明顯。當劑量達到10mJ/cm2時，LDH漏出量增加明顯，說明細胞膜穩(wěn)定性下降，受到一定程度損傷。同時MTT方法觀察到細胞的增值活性受到抑制，說明UVB 可損傷線粒體膜，使琥珀酸脫氫酶活性降低，抑制成角質(zhì)形成細胞的增殖［10］。當劑量達到20mJ/cm2，出現(xiàn)SOD活性明顯下降，與細胞受到UVB照射產(chǎn)生過多自由基導(dǎo)致SOD受到消耗有關(guān)［11］。當照射劑量達到30～40mJ/cm2出現(xiàn)MDA含量明顯增加。生物膜是氧自由基重要的靶組織，氧自由基攻擊膜上磷酯中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物之一［8］，是評價脂質(zhì)過氧化常用的指標之一［12］，表明30～40mJ/cm2的UVB對細胞產(chǎn)生了氧化損傷。以上結(jié)果說明UVB照射角質(zhì)形成細胞在低劑量時即可產(chǎn)生一定程度的損傷，但是無明顯氧化損傷，需要較高劑量的照射才能進一步打破細胞本身自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，導(dǎo)致細胞的氧化損傷。這也解釋了本文結(jié)果中MDA的變化相對于SOD需要更高的照射劑量原因，與石瀟報道一致［13］。

近年來很多學(xué)者致力于光老化的研究，隨著環(huán)境污染的加重，照射到地球表面的UVB越來越多，加速了皮膚衰老［14］。光老化的防護更是其中的熱點。目前的光老化研究中模型的構(gòu)建方法缺乏統(tǒng)一性，不同的研究者即使對同樣的研究對象采用的光損傷方法和光老化評價標準也并不完全相同。光源的選擇，目前多數(shù)研究者使用單一的UVB照射［15］。國內(nèi)外評價皮膚光老化的客觀標準主要是檢測衰老皮膚與正常皮膚中的與氧化相關(guān)物質(zhì)（ 包括測定SOD、谷胱甘肽、過氧化物酶和過氧化氫酶活性，谷胱甘肽含量和MDA 水平） 是否存在差異［5，13］。本文試驗結(jié)果顯示30～40mJ/cm2UVB照射角質(zhì)形成細胞使細胞SOD活性及MDA含量均出現(xiàn)明顯下降，使細胞出現(xiàn)明顯氧化損傷，進一步證實一定劑量UVB照射角質(zhì)形成細胞作為光老化模型的可行性。所得出的照射劑量點可用于制備體外細胞紫外線UVB光老化模型，為研究皮膚光老化和紫外線防護藥物的作用機理和生物效應(yīng)提供理論依據(jù)。

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編輯/張惠娟

The oxidative damage on keratinocytes from UVB at different doses

YIN Song-chao1， ZHANG Yun- qing1， XUE Xiao-yang2， LI Huan3
（Department of Dermatology， The Third Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， Guangdong， China；2.Tianhe District Xiancun Street Community Health Service Centre， Guangzhou 440100，Guangdong，China； 3. Department of Dermatology， The First Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080，Guangdong，China）

Abstract:Objective To investigate the oxidative damage effect on keratinocytes from UVB at different doses. Methods Human keratinoctes were exposed to UVB at different doses of 5mJ/cm2，10mJ/cm2，20mJ/cm2，30 mJ/cm2，40mJ/cm2. After 24h，the content of cellular malond-ialdehyde （MDA）， the LDH in culture solution， the activity of cellular superoxide dismutase （SOD） and the cellular viability were measured. Results The decrease of SOD activity and the cellular viability， and the increase of MDA and LDH were induced by UVB in a dose-dependent manner. Irradiation of keratinocytes with UVB at 10mJ/ cm2resulted in a significant decrease of cellular viability and a significant increase of LDH in culture solution. The decrease of SOD activity and the increase of MDA were induced at 20mJ/cm2and 30～40mJ/ cm2， respectively. Conclusion The oxidative damage on keratinocytes can be induced by UVB irradiation at 30～40mJ/cm2.

Key words:Ultraviolet B； keratinocyte； oxidative damage； photoaging； photo damage

［中圖分類號］R758

［文獻標志碼］A

［文章編號］1008-6455（2016）05-0057-03

基金項目：廣東省科技計劃項目（2013B021800187）

通信作者：張云青，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科副主任醫(yī)師，主要研究方向：皮膚美容治療；地址：廣東省廣州市天河路600號，郵編：510630；E-mail：zyq01@163.com

［收稿日期］2016-02-26 ［修回日期］2016-04-27