孫　平，付帥才，肖　樂，龔昆梅*

1.昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650000；2.云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650000

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*通信作者

白藜蘆醇對脂多糖誘導體外小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響

孫平1，付帥才1，肖樂2，龔昆梅2*

1.昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650000；2.云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650000

[摘要]目的探討白藜蘆醇(RES)對脂多糖(LPS)誘導體外小鼠腹腔巨噬細胞(PMA)活化的影響。方法制備腹腔巨噬細胞，分為陰性對照組、LPS組和(RES+LPS)Ⅰ～Ⅵ組，培養(yǎng)24 h后，分別進行中性紅染色觀察細胞活性。應用酶聯(lián)免疫吸附法和硝酸還原法實驗，用酶標儀檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、一氧化氮(NO)和超氧陰離子水平。結果對照組細胞活性比較低，LPS誘導后，腹腔巨噬細胞大量活化，細胞上清液中TNF-α、NO、超氧陰離子水平顯著增高，加入RES治療的PMA細胞活性逐漸減弱，并且相應的細胞上清液中TNF-α、NO、超氧陰離子水平明顯降低。結論RES可以抑制PMA的細胞活化，從而減少TNF-α、NO和超氧陰離子的過度分泌。

[關鍵詞]巨噬細胞(PMA)；白藜蘆醇(RES)；脂多糖(LPS)；TNF-α；NO；超氧陰離子

0引言

白黎蘆醇(Resveratrol，RES)是從虎杖中提取的多酚類化合物[1-3]，其化學結構為3,5,4′-三羥基苯二烯。近年研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗血小板凝聚、改善微循環(huán)、保護血管內(nèi)皮、保護神經(jīng)系統(tǒng)、增強免疫力、延緩衰老等作用[4-5]。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是引起傳染性疾病的主要原因。炎癥過程中巨噬細胞的活化能夠引起白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧陰離子(O2-)、血小板活化因子(PAF)和一氧化氮(NO)等大量炎癥介質釋放[6-9]，這些炎癥介質具有多種活性，介導多種生理作用，并且許多作用能夠相互疊加，出現(xiàn)協(xié)同效應，從而促使炎癥過程的發(fā)生和發(fā)展[10-12]。本研究旨在探討白藜蘆醇對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞(PMA)活化產(chǎn)生炎癥損傷的抑制作用，探討其對細胞保護作用的可能機制，為治療炎癥、保護細胞活力、延緩細胞衰老提供新的有效思路和臨床治療方法。

1材料與方法

1.1材料ICR品系小鼠，雌雄不拘，體重(25±3)g，購于昆明醫(yī)科大學動物實驗室，SPF級；脂多糖、白藜蘆醇(Sigma公司)；10%小牛血清(BI)；中性紅及臺盼藍染液，檢測TNF-α、超氧陰離子、NO試劑盒(南京建成生物制品公司)；蒸餾水、乙醚等為國藥集團化學試劑分析純；酶標儀(Multiskan G0美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(ZXZ-SLP，OLYMPUS)；二氧化碳培養(yǎng)箱(水套式，上海一恒科學儀器有限公司)；液氮罐YDS-10型(成都金鳳液氮容器有限公司)；雪花制冰機；電子天平(FA2004N型)；-80 ℃冰箱；手術器械、一次性無菌注射器等。

1.2方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細胞的制備取2只6～8周、體型相仿、體重接近相等(22 g)的小鼠(飼養(yǎng)條件：室溫20～26 ℃；相對濕度：45%～60%；光照時間：每天12 h；提供充足的食物和飲水，以便小鼠隨意進食飲水)，乙醚下處死，75%乙醇消毒3～5 min，在無菌條件下給每只小鼠腹腔液注射10%的小牛血清培養(yǎng)基(引發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量巨噬細胞) 2.5 mL，灌洗適當時間后，取2.8 mL腹腔液加入培養(yǎng)基稀釋至9 mL，鋪到96孔板，每孔為200 μL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁細胞培養(yǎng)24 h。

1.2.2用RES、LPS處理小鼠腹腔巨噬細胞用體積分數(shù)10%的小牛血清培養(yǎng)基調整PMA濃度約為2×106個/mL，隨機分為對照組、LPS組、RESⅠ～Ⅵ組。對照組PMA加雙純水(2 μg/mL)；LPS組PMA加入LPS (2 μg/mL)；RES組PMA加入LPS (2 μg/mL)培養(yǎng)30 min后，分別加入濃度為1、1.2、1.5、1.8、2、5 μg/mL的RES。各組均在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3中性紅檢測細胞活力繼“1.2.2”項用RES、LPS處理小鼠腹腔巨噬細胞，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除細胞培養(yǎng)液，用PBS液沖洗未貼壁的細胞，向孔內(nèi)加入新鮮配制的中性紅工作液200 μL，在37 ℃、5% CO2條件下，孵育2 h，立即用倒置熒光顯微鏡拍照。棄去上清，用PBS洗滌1遍，加入萃取液(乙醇∶水∶醋酸=50∶49∶1)，酶標儀540 nm檢測光吸收值(D540值)。

1.2.4TNF-α、NO、抗超氧陰離子含量的檢測經(jīng)2 μg/mL LPS預處理PMA細胞損傷，加入不同濃度Res對PMA細胞進行24 h治愈保護作用。①TNF-α的檢測：收集細胞的上清液，96孔板，每孔樣本量100 μL，采用雙抗體夾心法測定標本中小鼠TNF-α水平，按試劑盒使用說明進行，酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(D450值)，根據(jù)標準品繪制成的標準曲線，得出回歸方程，根據(jù)回歸方程計算樣品中小鼠TNF-α的濃度。②收集細胞的上清液，根據(jù)Griess法測定培養(yǎng)液中的NO，具體按照試劑盒使用說明，每孔樣本量100 μL，實驗后用酶標儀進行NO檢測；③收集細胞的上清液，根據(jù)試劑盒的實驗步驟，每孔加樣樣本量為50 μL，酶標儀檢測出超氧陰離子OD值，然后根據(jù)試劑盒中的計算公式，計算出抗超氧陰離子的活力單位(U/L)。

1.2.5統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)進行單向方差分析，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義的再進行多重比較。實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件包GraphPad Prism5進行統(tǒng)計分析，檢驗顯著水準α=0.05。

2結果

2.1RES、LPS對腹腔巨噬細胞活性的影響見圖1。中性紅檢測細胞活力(應用倒置熒光顯微鏡拍照)，見圖2。

圖1　酶標儀檢測各組細胞的OD值

由圖2可見，培養(yǎng)24 h后，對照組腹腔巨噬細胞大量貼壁生長，形狀呈不規(guī)則的菱形，多數(shù)被中性紅染成紅色，說明腹腔巨噬細胞大量存活生長良好。LPS組腹腔巨噬細胞只有很少的細胞染成紅色，形狀多為圓形，說明腹腔巨噬細胞貼壁生長較少，且大量死亡，表明LPS誘導腹腔巨噬細胞衰老死亡。RESⅠ～Ⅵ組，隨著白藜蘆醇藥量的加大，腹腔巨噬細胞被染成紅色且貼壁生長，形狀呈不規(guī)則菱形的腹腔巨噬細胞數(shù)量越來越多，說明白藜蘆醇抑制LPS引起的細胞衰老死亡。但是白藜蘆醇藥量較大的RESⅤ組的腹腔巨噬細胞的貼壁生長，形狀呈菱形的腹腔巨噬細胞數(shù)量有變小的趨勢，說明濃度過大的白藜蘆醇對細胞有毒副作用。

2.2RES對LPS誘導后巨噬細胞TNF-α的影響見圖3、表1。

圖2　中性紅染色PMA活性觀察(200×)

圖3　白藜蘆醇對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α的影響

組別TNF-α(ng/L)NO(μmol/L)抗O-2(U/L)對照組1.30±0.021.42±0.81228.00±3.44LPS組1.57±0.01#66.10±11.30#259.10±1.18#RESⅠ組1.56±0.0251.50±5.62*258.40±0.74RESⅡ組1.42±0.01*41.10±2.60**256.10±0.68RESⅢ組1.35±0.01*23.20±6.07**254.10±0.78RESⅣ組1.31±0.02*14.70±0.59**231.70±0.86*RESⅤ組1.26±0.03*5.39±0.28**243.80±0.78*RESⅥ組1.23±0.01*1.96±0.89**258.10±0.74

注：*與LPS處理組比較，P<0.01；#與對照組比較，P<0.01

由圖3、表1可見，LPS組PMA經(jīng)過LPS誘導產(chǎn)生的TNF-α含量明顯高于對照組(P<0.01)；RES組中，隨著RES量的增加，對LPS致巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的抑制更加明顯。

2.3RES對LPS誘導后的巨噬細胞生成NO的影響酶標儀NO檢測結果見圖4、表1。由圖4、表1可見，LPS組的PMA經(jīng)過LPS誘導產(chǎn)生的NO含量明顯高于對照組(P<0.01)；RES組中，隨著RES量的增加，對LPS致巨噬細胞產(chǎn)生NO的抑制更加明顯。

圖4　白藜蘆醇對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞NO的影響

圖5　白藜蘆醇對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞

3討論

研究表明，當前白藜蘆醇已經(jīng)成為有效遏制和治療腫瘤和癌變的最有前途的藥物之一，被美國著名雜志《抗衰老圣典》列為100種最有效的抗衰老藥物之一，被譽為新的抗癌綠色藥物[13-16]。研發(fā)富含白藜蘆醇的食品、藥物及抗皮膚衰老的化妝品具有非常廣闊的市場前景。隨著分子調控機制、蛋白通路研究的完善，越來越多的白藜蘆醇相關研究涉及基因調控、蛋白調控方面，運用高通量技術探尋在RES保護治療下有關miRNA、LncRNA差異表達譜，篩選在RES保護下關鍵miRNA、LncRNA，對其相關功能進行研究，探索出一系列轉錄翻譯、蛋白修飾表達通路。本研究體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞，探討對小鼠腹腔巨噬細胞有保護作用的RES給藥濃度，為后續(xù)小鼠體內(nèi)實驗提供可靠的用藥劑量方面的實驗數(shù)據(jù)，同時也為之后用藥動物建模篩選的關鍵基因提供依據(jù)。

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Effect of resveratrol on oxidative activity of murine abdominal peritoneal macrophage induced by lipopolysaccharideinvitro

SUN Pin1,FU Shuai-cai1,XIAO Le2,GONG Kun-mei2*

(1.Medical College of Kunming University of Science and Technology,Kunming 650000,China;2.First People′s Hospital of Yunnan Province,Kunming 650000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of resveratrol on oxidative activity of murine peritoneal macrophages induced by lipopolysaccharied stimulated with lipopolysaccharide (LPS) in vitro.MethodsPeritoneal macrophages were prepared and divided into control group,LPS group and (RES+LPS) Ⅰ～Ⅵ group.After incubation for 24 h,the activity of neutral red stained cell was observed.Enzyme-linked immunosorbent method and nitrate reduction method were used.The tumor necrosis factor-α (TNF-α),nitric oxide (NO) and superoxide anion levels of cell supernatants were detected by microplate reader.ResultsThe cell activity in control group was lower.A large number of peritoneal macrophages were activated after being induced by LPS,and the TNF-α,NO and superoxide anion levels were significantly higher in cell supernatant;the cell activity of PMA was weakened gradually after RES treatment,and the TNF-α,NO,superoxide anion levels decreased significantly.ConclusionRES can inhibit the cell activation of PMA and reduce the excessive secretion of TNF-α,NO and superoxide anion.

Key words：Macrophages(PMA);Resveratrol (RES);Lipopolysaccharides (LPS);TNF-α;NO;Superoxide anion

收稿日期：2015-11-17

基金項目：云南省應用基礎研究(2012FB089、2013FB199)，國家自然科學基金(81260066)

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604002