西安市第一醫(yī)院心內科(西安710002)　陸　艷　 郭　萱

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白藜蘆醇抑制血管緊張素Ⅱ誘導大鼠心臟成纖維細胞膠原合成的實驗研究

西安市第一醫(yī)院心內科(西安710002)陸艷 郭萱

摘要目的：觀察白藜蘆醇對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的大鼠心臟成纖維細胞(CFs)膠原合成的影響,并探索可能分子機制。方法：提取新生大鼠CFs,采用免疫熒光法檢測CFs纖維粘連蛋白(fibronectin)及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達以鑒定CFs；用100 nM AngⅡ或100 nM AngⅡ加白藜蘆醇(20 μM或50 μM)干預后，采用MTT法檢測細胞增殖變化；采用Realtime-PCR檢測各干預組CFs細胞I型膠原(Collagen I)、III型膠原(Collagen III)及TGF-β1的mRNA表達水平；Western Blotting法檢測各干預組CFs、 Collagen I、Collagen III及TGF-β1的蛋白表達變化。結果：AngⅡ干預可顯著促進CFs的增殖,而白藜蘆醇20 μM和50μM均可呈時間依賴性抑制AngⅡ誘導的CFs增殖；AngⅡ可以促進CFs、Collagen I、Collagen III及TGF-β1的mRNA及蛋白表達水平(P<0.05)；而當加入白藜蘆醇后,AngⅡ所誘導的上述分子的表達無論在mRNA水平還是蛋白水平均被明顯抑制(P<0.05)。結論：白藜蘆醇可以抑制AngⅡ誘導的CFs增殖及膠原合成,下調TGF-β1表達可能是白藜蘆醇抑制CFs膠原合成的關鍵機制。

主題詞血管緊張素Ⅱ成纖維細胞心肌纖維化高血壓@白藜蘆醇

長期的高血壓可以造成心臟結構重塑,導致心肌纖維化[1]。心肌纖維化病變中,由于重塑的心肌室壁僵硬,順應性下降,導致心室舒緩功能障礙。此外,過多的間質使心肌細胞分離,使心肌細胞間的電耦聯(lián)作用減弱,嚴重影響心臟的收縮功能。因此防治與逆轉心肌纖維化已是治療高血壓心臟病的重要目標之一。心臟成纖維細胞(Cardiac fibroblasts,CFs)是構成心肌組織的主要間質細胞,約占心臟細胞總數(shù)的60%～70%。目前的研究結果顯示,CFs過度活化增殖及細胞外間質(Extracellular matrix,ECM)過度沉積是造成各種心肌纖維化的主要原因[2]。在高血壓情況下,機體內的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Rennin-angiotensin system,RAAS)具有高度活性,其中,血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)的水平明顯增加。AngⅡ作用于心肌成纖維細胞表面的相應受體,促進轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)等細胞因子分泌增加,引起生長因子網絡平衡紊亂,進而促進CFs合成大量膠原蛋白,同時抑制膠原的降解,造成膠原在心肌間質的大量沉積,導致心臟結構重塑和心肌細胞纖胞維化[3]。白藜蘆醇是一種生物活性很強的天然多酚類物質,主要來源于虎杖、葡萄等植物,可通過降低急性脊髓損傷后的氧化應激水平,減輕脊髓炎癥程度而發(fā)揮對脊髓的保護作用[4]。近年來的研究表明,白藜蘆醇亦可以通過調節(jié)脂代謝、抗氧化、清除自由基、舒張血管、抗炎、抗血小板聚集等多種途徑發(fā)揮心血管保護作用[5]。然而,白藜蘆醇是否可以抑制高血壓狀態(tài)下AngⅡ誘導的心肌纖維化,目前鮮有報道。本研究中,我們擬觀察白藜蘆醇對AngⅡ誘導的CFs增殖及膠原合成的影響,并探索其可能的分子機制。

材料和方法

1材料①實驗動物：新生48 h內Wistar大鼠6只由西安交通大學動物實驗中心提供。雌雄不限，體重16.10 ±1.02 g。動物質量合格證號：陜醫(yī)動證08005號。②藥物與試劑：白藜蘆醇(純度> 99%)購自美國Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)將其溶解成50 mmol/L貯存液，置-20℃保存。 DMEM/F12培養(yǎng)基購自北京博奧森公司；胎牛血清為澳大利亞Hyclone公司產品；青霉素、鏈霉素、AngⅡ均購自美國Sigma公司；Trizol購自美國Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒及Realtime-PCR試劑盒購自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司；所需引物由上海生物工程技術服務有限公司負責設計合成；RIPA蛋白裂解液購自上海申能博彩生物科技公司；TGF-β1 ELISA試劑盒購自上海軒昊生物公司；兔抗鼠I型膠原(Collagen I)及III型膠原(Collagen III)多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗鼠TGF-β1、β-actin抗體購自美國Santa公司。

2方法 ①細胞培養(yǎng)：按照參考文獻[6]在無菌條件下提取大鼠原代心肌成纖維細胞。具體方法如下：將出生48 h內Wistar大鼠以頸椎牽引法處死后，酒精消毒后在無菌條件下取出乳鼠心室并剪碎成約0.5mm3大小，加入適量0.25%胰蛋白酶并吹打混勻后于37℃消化組織塊約30min，血清終止消化,200目篩網過濾。收集細胞懸液,于1000 r/min離心10 min,棄上清,將細胞重懸于含20%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基,接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,置入37 ℃,含5%CO2孵箱中培養(yǎng),每3 d換液1次,細胞生長近融合時傳代。用免疫熒光法檢測纖維粘連蛋白(fibronectin)及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達,經鑒定證實為CFs后用于后續(xù)實驗,本實驗所用CFs均為2～3代細胞。②細胞分組及干預：在mRNA及蛋白水平檢測,細胞處理按以下分組：正常對照組(Normal組)：未加干預；100 nM血管緊張素Ⅱ單獨干預組(AngⅡ組)； 100 nM血管緊張素Ⅱ加20 μM白藜蘆醇干預組(AngⅡ+ Res組)。③MTT檢測細胞增殖：取對數(shù)生長期的CFs細胞制成細胞懸液，以每孔3×103個細胞于96孔板中接種CFs細胞,待細胞貼壁后,加0.1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基過夜饑餓處理。將饑餓后的CFs分成以下4組：正常對照組(Normal組)、100 nM AngⅡ單獨干預組(AngⅡ組)、100 nM AngⅡ加20 μM白藜蘆醇干預組(AngⅡ+ 20 μM Res組)及100 nM AngⅡ加50μM白藜蘆醇干預組(AngⅡ+ 50μM Res組)干預后繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。上述干預時間點到底后,每孔加入MTT溶液10 μl(濃度5 mg/ml),繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔再加入DMSO溶液200 μl，當出現(xiàn)藍紫色顆粒結晶并充分溶解后，檢測OD(490nm)值。實驗重復3次，計算各組細胞平均OD490值。④Realtime-PCR檢測相關基因的mRNA表達：干預細胞24 h后按Trizol法提取細胞總RNA。用Taka逆轉錄試劑盒進行逆轉錄操作，得到的cDNA用于Realtime-PCR擴增。PCR反應體系為20 μl,其中含有：2 μl逆轉錄產物(cDNA)，上游與下游引物各1 μl，2×SYBY green PCR Master 10 μl，用ddH2O水補足體積至20 μl。PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30 s,58℃退火30 s,74℃延伸30 min,共40個循環(huán)；74℃延伸10 min以終止反應。以GAPDH作為內參照，每組設置3個復孔。Real-time PCR反應完成后，待測基因的表達水平通過??CT計算方法進行定量表達?！鳌鰿T =實驗組(CT目的基因- CTGAPDH)-對照組(CT目的基因-CTGAPDH)。擴增用目的基因引物見附表。⑤目的蛋白Western blot檢測：干預48h后用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白。獲得的樣品采用BCA法進行濃度測定。加入上樣緩沖液至樣品于70℃變性30min。取30 μg各組蛋白樣品上樣后進行SDS-PAGE電泳。電泳完成后，采用濕轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜；用含10%脫脂奶粉的PBST封閉液室溫封閉膜2h，隨后將膜用一抗稀釋液4℃孵育過夜。次日取出膜用PBS漂洗后加二抗稀釋液(1∶5000)將膜室溫孵育2 h。以PBS洗膜，膜上覆蓋發(fā)光液，利用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行照相。獲得的條帶密度利用Quantity One v4.61圖片分析軟件進行定量分析，以GAPDH為內參照，以各組細胞目的蛋白與自身GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對含量。⑥細胞免疫熒光實驗：將CFs細胞接種至6孔板于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長至合適密度,取出培養(yǎng)板,以4%多聚甲醛固定細胞。用含0.5% Triton X-100的PBS溶液孵育細胞5 min后用1%牛血清白蛋白封閉細胞1 h。再用0.5% Triton X-100溶液制備一抗孵育液(fibronectin,1∶200；α-SMA,1∶150)4℃孵育細胞過夜。次日吸出一抗孵育液,用PBS漂洗后加入0.5% Triton X-100溶液配制的熒光二抗溶液,避光條件下室溫孵育1 h。孵育結束后用1 μg/ml DAPI稀釋液孵育細胞5min,完成上述孵育過程的細胞用PBS漂洗后,于暗室內應用熒光顯微鏡以合適波長的光進行激發(fā),并照相,獲取實驗結果。

附表　引物設計序列

3統(tǒng)計學方法以上所有實驗均至少重復3次。全部實驗數(shù)據經均應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計算得到的所有數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用one-way ANOVA方差分析，以α=0.05為顯著性檢驗水準。

結果

1大鼠CFs鑒定提取的細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察，細胞呈梭形或多邊形，胞質透明，核呈橢圓形，內含2～3個核仁(圖1A)。免疫熒光染色顯示，提取的細胞呈現(xiàn)fibronectin染色陽性和α-SMA染色陰性(圖1D)，符合文獻所述CFs特征。

2白藜蘆醇抑制AngⅡ誘導的大鼠CFs增殖采用MTT法評估白藜蘆醇(Res)對AngⅡ誘導的大鼠CFs增殖性的影響。結果如圖2所示,加入AngⅡ(100nM)后,培養(yǎng)12h、24h、48h后,CFs細胞的增殖能力明顯增強，與正常對照組(Normal組)相比,差異顯著(P<0.05)。然而,當加入白藜蘆醇(20μM)后,各組細胞的OD490值明顯下降(P<0.05),說明白藜蘆醇對AngⅡ誘導的CFs增殖有抑制作用。隨著白藜蘆醇濃度增加,抑制作用越明顯,呈現(xiàn)劑量依賴性。這些結果說明,白藜蘆醇可以抑制AngⅡ對CFs增殖的促進作用。

A光學顯微鏡下，由大鼠心肌組織中提取后第3天的CFs；B 免疫熒光法檢測fibronectin表達；C 免疫熒光法檢測α-SMA表達；D 免疫熒光DAPI染色

圖1原代大鼠CFs的提取與鑒定(×200)

與各時間點Normal組比較, *P<0.05；與各時間點AngⅡ組比較,#P<0.05

圖2白藜蘆醇對AngⅡ誘導的大鼠CFs增殖的影響

3白藜蘆醇抑制AngⅡ誘導的大鼠CFs膠原合成用AngⅡ或AngⅡ加白藜蘆醇(AngⅡ+ Res)干預CFs細胞24 h,提取細胞總mRNA,通過Realtime-PCR技術檢測I型膠原(Collagen I)及III型膠原(Collagen III)mRNA的表達變化。結果如圖3所示,與未干預對照組(Normal)相比,100 nmol/L AngⅡ干預可以顯著促進CFs 的I型膠原和III型膠原的mRNA表達水平(P<0.05)。然而,加入白藜蘆醇(20 μM)后，I型膠原和III型膠原的mRNA表達水平顯著降低,與AngⅡ單獨干預組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與對照組比較，* P<0.05,與AngⅡ組比較，#P<0.05

圖3Realtime-PCR檢測白藜蘆醇對AngⅡ誘導的

大鼠CFs膠原mRNA表達的影響

4白藜蘆醇抑制AngⅡ誘導大鼠CFs TGF-β1表達Realtime-PCR技術檢測各組細胞TGF-β1的表達水平。結果如圖4所示，AngⅡ(100 nmol/L)干預可以增加CFs TGF-β1的mRNA表達水平，與未干預對照組相比差異顯著(P<0.05)。

與對照比較，*P<0.05

討論

正常心肌組織約2/3由非心肌細胞構成。而在非心肌細胞中,CFs占絕大多數(shù)。在正常生理情況下,CFs參與心臟ECM的產生,與心臟的發(fā)育、結構及功能密切相關。然而,在高血壓、心肌炎、風濕性心臟病、慢性心肌缺血等病理情況下,CFs受到損傷因素的刺激發(fā)生過度增殖,且ECM合成增加。CFs的過度增殖并產生大量膠原蛋白等ECM成分是導致各種心肌纖維化的主要原因[7]。在高血壓性心臟病中,一方面,心肌細胞代償性增生肥大,另一方面,心肌細胞周圍的CFs大量增殖活化,分泌過量的膠原到心肌間隙,且膠原等間質成分降解減少,以上兩方面原因造成心肌結構重塑及心肌纖維化,導致心臟的舒張和收縮功能障礙,最終導致心力衰竭。因此,抑制高血壓等病理情況下CFs的過度增殖及活化可能是治療或減緩心臟纖維化的有效治療策略。

高血壓患者體內的激素水平的主要變化體現(xiàn)為RAAS的過度激活。其中,AngⅡ的血漿水平增加是高血壓患者RAAS活化的主要標志之一,也是導致高血壓患者心臟、腎臟等器官相關并發(fā)癥的罪魁禍首[8]。越來越多的證據表明,Ang II參與了高血壓患者的心肌結構重塑[9]。有資料[10]顯示,Ang II可以誘導CFs的增殖，更為重要的是，在Ang II的作用下,CFs的MAPK信號通路發(fā)生活化,胞內DNA合成加速，TGF-β1等與組織纖維化密切相關的細胞因子的合成和分泌水平也增加,而纖溶酶原激活物阻滯因子等促進ECM降解的分子產生減少，以上幾方面因素共同促進心肌纖維化的發(fā)生。

TGF-β1屬于轉化生長因子-β超家族蛋白成員。TGF-β1已被認為是導致各種器官纖維化的共同細胞因子之一。在各種病理因素刺激下,心肌細胞及CFs長生大量的TGF-β1等細胞因子,并分泌到組織間隙中。TGF-β1通過與CFs表面相應的受體結合，磷酸化激活TGF-β1信號通路下游的Smad2/3，通過影響靶基因的表達最終促進CFs的增殖及活化。抑制CFs的TGF-β1信號通路則可以組織心肌纖維化,改善心肌的舒緩功能。我們的結果顯示,白藜蘆醇可以抑制CFs的增殖,并減少其膠原蛋白的合成。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以顯著下調CFs促纖維化細胞因子TGF-β1的表達,這可能是其發(fā)揮上述作用的重要機制。

總之,白藜蘆醇可能通過減少CFs TGF-β1的產生而抑制Ang II誘導的CFs的增殖和膠原合成。在體內實驗中,白藜蘆醇是否可以抑制高血壓所介導的動物心肌纖維化,值得進一步研究。

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(收稿：2015-12-09)

【中圖分類號】R542.23

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.006