陜西省安康市中心醫(yī)院普外科(安康 725000)　邱　偉　楊成琳　 劉　陽(yáng)

?

miR-210通過(guò)下調(diào)JAK-STAT信號(hào)通路抑制膽囊癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

陜西省安康市中心醫(yī)院普外科(安康 725000)邱偉楊成琳 劉陽(yáng)▲

摘要目的：探討miR-210抑制膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD增殖的機(jī)制是否與下調(diào)JAK-STAT通路有關(guān)。方法：Real-time PCR法檢測(cè)10例膽囊癌與癌旁組織中miR-210、STAT3、STAT5的表達(dá)；采用LipofectamineTM2000將miR-210-mimic轉(zhuǎn)染至膽囊癌GBC-SD細(xì)胞以及JAK-STAT信號(hào)通路特異性阻滯劑AG490處理GBC-SD細(xì)胞后，分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-210、STAT3、STAT5表達(dá)的變化,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-210對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響。結(jié)果：膽囊癌組織中miR-210的表達(dá)低于癌旁組織,STAT3、STAT5的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)；miR-210轉(zhuǎn)染、AG490處理后GBC-SD細(xì)胞內(nèi)STAT3、STAT5的表達(dá)下降；miR-210將GBC-SD細(xì)胞阻滯于G0/G1期并抑制細(xì)胞增殖。結(jié)論：miR-210下調(diào)GBC-SD細(xì)胞內(nèi)STAT3、STAT5的表達(dá),通過(guò)阻滯JAK-STAT信號(hào)通路從而抑制GBC-SD細(xì)胞增殖。

主題詞膽囊腫瘤/病理學(xué)微RNAsSTAT3轉(zhuǎn)錄因子 STAT5轉(zhuǎn)錄因子

膽囊癌是膽管系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,是一種早期診斷困難、生存期較短、病死率較高的惡性腫瘤[1]。中晚期膽囊癌的根治手術(shù)療效欠佳，輔助放化療的治療效果局限,5年生存率波動(dòng)于5%～10%[2]。因此,尋找膽囊癌特異性的診斷標(biāo)志物、有效的治療靶點(diǎn)是目前膽囊癌的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)多種microRNA(miRNA)在膽囊癌組織與正常膽囊組織或癌旁組織中存在差異表達(dá)[3],miRNA是由18～24個(gè)核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA,miRNA轉(zhuǎn)錄后參與調(diào)控血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[4]。已有研究證實(shí)miR-210可通過(guò)下調(diào)多種信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本課題旨在研究miR-210在膽囊癌組織和癌旁組織中表達(dá)的差異,并從細(xì)胞分子水探討miR-210抑制膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD增殖的機(jī)制與下調(diào)JAK-STAT通路的關(guān)系，為探索膽囊癌潛在的治療靶點(diǎn)提供理論支持。

材料與方法

1材料膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；JAK-STAT信號(hào)通路特異性阻滯劑AG490,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；miR-210-mimic、STAT3引物、STAT5引物、β-actin引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Trizol購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM,購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。10例膽囊癌與癌旁組織(距癌灶邊緣3 cm)均取自2012年1月至2014年12月我院普外科患者,所有組織標(biāo)本均為手術(shù)切除并經(jīng)過(guò)病理證實(shí),10例膽囊癌患者平均年齡58.2±7.35歲，其中男6例,平均年齡61.3±8.45歲；女4例,平均年齡56.8±7.21歲。

2方法①Real-time PCR法檢測(cè)膽囊癌與癌旁組織miR-210、STAT3、STAT5的表達(dá)：將膽囊癌與癌旁組織標(biāo)本研磨成粉(研磨過(guò)程中加入少量液氮)，使用Trizol法提取膽囊癌與癌旁組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃，15 min；95℃,2 min。利用 Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)目的基因引物,引物序列通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)均具有特異性,miR-210的上游引物序列為 CTGTGCGT-GTGACAGCGGCTGA,下游引物為通用引物Uni-miR real-time PCR引物；STAT3上游引物5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′,下游引物5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′；STAT5上游引物5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′,下游引物5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′；β-actin上游引物5′-CCAGGTCATCACCATCGG-3＇,β-actin下游引物5′- CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3′。以cDNA為模版,β-actin為內(nèi)參,使用SYBR Primix Ex Taq Ⅱ( TaKaRa試劑盒) 進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè),反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸40 s,總計(jì)40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式 Folds=2-△△Ct來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,其中△△Ct=(Ct檢測(cè)基因-Ctβ-actin)實(shí)驗(yàn)組-(Ct檢測(cè)基因-Ctβ-actin)對(duì)照組。②miR-210-mimic轉(zhuǎn)染 GBC-SD細(xì)胞：用DMEM完全培養(yǎng)基(含5 %胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 mg/L)培養(yǎng)GBC-SD細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件：5 %CO2、溫度37 ℃，pH7.2～7.4,濕度為95 %。經(jīng)過(guò)3～4次傳代后,選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GBC-SD細(xì)胞,胰酶消化后以1×105/孔的濃度接種6孔板,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞融合率達(dá)到30 %～50 %后棄去培養(yǎng)液。配制轉(zhuǎn)染試劑：將FAM熒光標(biāo)記的miR-210-mimic(20 pmol)溶于Opti-MEM配制成20 μmol/L的溶液,用Opti-MEM(50 μl)稀釋LipofectamineTM2000(1 μl)并充分混勻,室溫孵育5 min,將FAM熒光標(biāo)記的miR-210-mimic和LipofectamineTM2000混合,室溫孵育20 min。然后將miR-210-mimic和LipofectamineTM2000混合物加入到GBC-SD細(xì)胞6孔板中并輕輕搖晃混勻,置于培養(yǎng)箱孵育4～6 h,熒光顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算miR-210-mimic轉(zhuǎn)染效率，Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后miR-210、STAT3、STAT5的表達(dá)水平。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GBC-SD細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液，加入AG490，使其終濃度為40 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Real-time PCR法檢測(cè)AG490處理GBC-SD細(xì)胞后miR-210、STAT3、STAT5的表達(dá)水平。③MTT 法檢測(cè)miR-210-mimic轉(zhuǎn)染對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖的影響：按照上述方法將miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染后的GBC-SD細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔的濃度接種于96孔板并置于37℃、5 %的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后加入20 μl的MTT試劑,置于37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后,每孔加入150 μl的 DMSO溶解,小心振蕩10 min,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔光密度(OD)值；另取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GBC-SD細(xì)胞,加入JAK-STAT信號(hào)通路特異性阻滯劑AG490,使其終濃度為40 μmol/L,培養(yǎng)24、48、72、96 h后棄去培養(yǎng)液,加入20 μl的MTT試劑,繼續(xù)孵育4 h后,每孔加入150 μl的 DMSO溶解,小心振蕩10 min,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔OD值。另設(shè)對(duì)照孔(每孔加200 μl的GBC-SD細(xì)胞懸液)。以上各組均設(shè)置6個(gè)平行孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算各組的細(xì)胞抑制率,細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。④流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-210-mimic對(duì)GBC-SD細(xì)胞周期的影響：將GBC-SD細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,按照上述方法將miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞(miR-210-mimic組)，胰酶消化后，1000 rpm離心5 min,1 ml的PBS(4℃預(yù)冷)洗滌,1000 rpm離心5 min后棄去上清液，加入10 μl的Annexin Ⅳ-FITC和5μl的PI，避光室溫反應(yīng)15 min,加入300 μl結(jié)合緩沖液后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。另設(shè)未轉(zhuǎn)染組、AG490處理組(終濃度為40 μmol/L)，各組細(xì)胞檢測(cè)過(guò)程同miR-210-mimic組。

結(jié)果

1膽囊癌組織、癌旁組織中miR-210、STAT3、STAT5的表達(dá)見(jiàn)圖1。膽囊癌組織中miR-210的表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)，而STAT3、STAT5的表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)。結(jié)果提示，膽囊癌組織中，miR-210的低表達(dá)以及STAT3、STAT5的高表達(dá)可能與膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

2miR-210-mimic轉(zhuǎn)染、AG490處理GBC-SD細(xì)胞后STAT3、STAT5的表達(dá)變化見(jiàn)圖2。miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)91.07%±3.85%，miR-210表達(dá)較轉(zhuǎn)染前升高2.35±0.53(P<0.05)，說(shuō)明 miR-210-mimic已成功轉(zhuǎn)染至GBC-SD細(xì)胞。miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后STAT3、STAT5的表達(dá)分別為轉(zhuǎn)染前的0.35±0.062,0.23±0.044,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AG490處理GBC-SD細(xì)胞后STAT3、STAT5表達(dá)分別為轉(zhuǎn)染前的0.30±0.058,0.24±0.046,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),AG490處理與miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后STAT3、STAT5的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

與癌旁組織比較，* P<0.05

圖1膽囊癌組織、癌旁組織中miR-210、STAT3、STAT5表達(dá)

與轉(zhuǎn)染前比較，* P<0.05

圖2miR-210-mimic、AG490對(duì)GBC-SD細(xì)胞內(nèi)miR-210、STAT3、STAT5表達(dá)的影響

3miR-210對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖3。通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)染miR-210-mimic的GBC-SD細(xì)胞增殖曲線，發(fā)現(xiàn)miR-210可明顯抑制GBC-SD細(xì)胞的增殖，miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后24、48、72、96 h的增殖抑制率分別為34.2%±2.68%，55.3%±4.65%，64.8%±5.06%，82.1%±2.57%，與未轉(zhuǎn)染組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。AG490處理GBC-SD細(xì)胞后24、48、72、96h的增殖抑制率分別為38.7%±2.81%,60.2%±4.33%,68.3%±5.22%，85.5%±5.33%,與miR-210-mimic轉(zhuǎn)染組24、48、72、96 h細(xì)胞增殖抑制率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4miR-210對(duì)GBC-SD細(xì)胞周期的影響見(jiàn)圖4。miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后,處于G0/G1期的細(xì)胞百分比為71.16%±4.28%,較未轉(zhuǎn)染組明顯增多47.82%±2.37%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；處于S期的細(xì)胞百分比為11.95%±0.84%，較未轉(zhuǎn)染組減少34.81%±1.77%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞前后，處于G2/M的細(xì)胞百分比分別為15.73%±1.22%、13.95%±0.99%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；40 μmol/L的AG490處理GBC-SD細(xì)胞后處于G0/G1、S、G2/M期的細(xì)胞百分比分別為67.23%±1.84%、13.19%±1.08%、17.56%±0.88%，與miR-210-mimic轉(zhuǎn)染組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與未轉(zhuǎn)染組比較，* P<0.05

圖3 miR-210、AG490對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖的影響

與miR-210-mimic轉(zhuǎn)染前比較,* P<0.05

討論

膽囊癌占膽道系統(tǒng)腫瘤的80%～95%，占消化系統(tǒng)腫瘤第5位，由于早期癥狀不典型，缺乏有效的治療手段，因此預(yù)后極差[5]。Kiran等[6]報(bào)道膽囊癌患者的中位生存期為4個(gè)月。因此探索膽囊癌的發(fā)病機(jī)制以及潛在的有效治療靶點(diǎn)有著非常重要的臨床意義，有研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌細(xì)胞的增殖在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[7]。大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-210在胰腺癌、淋巴瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌中表達(dá)升高,起癌基因樣作用,在食管鱗癌組織中表達(dá)降低,可能具有抑癌基因樣作用[3]。袁源[7]通過(guò)miRNA芯片比較正常膽囊上皮細(xì)胞與GBC-SD細(xì)胞的miRNA差異表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),150個(gè)miRNA在GBC-SD細(xì)胞中存在差異表達(dá),其中上、下調(diào)的miRNA分別有89、61個(gè),miR-210在GBC-SD細(xì)胞中表達(dá)較正常膽囊上皮細(xì)胞低(比值為0.114)，但對(duì)miR-210在膽囊癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制并未闡述。我們通過(guò)檢測(cè)miR-210在膽囊癌與癌旁組織中的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)miR-210在膽囊癌組織中也呈低表達(dá)(與癌旁組織比較)。

有研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT 信號(hào)通路與癌細(xì)胞形成和增殖密切相關(guān)，JAK-STAT信號(hào)通路廣泛分布于各種腫瘤細(xì)胞中,STAT3、STAT5是JAK-STAT信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8]。我們利用Real-time PCR法檢測(cè)膽囊癌與癌旁組織中STAT3、STAT5的表達(dá),發(fā)現(xiàn)STAT3、STAT5在膽囊癌組織中呈高表達(dá)(與癌旁組織比較)。有學(xué)者依據(jù)TargetScan預(yù)測(cè)并證實(shí)了miR-210的下游靶基因是STAT3,我們的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，在miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后,STAT3、STAT5的表達(dá)明顯降低,與使用JAK-STAT信號(hào)通路特異性阻滯劑AG490后STAT3、STAT5的表達(dá)無(wú)明顯差異。AG490是人工合成的JAK-STAT信號(hào)通路特異性阻滯劑,分子結(jié)構(gòu)與酪氨酸類似,可通過(guò)與受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置從而抑制STAT磷酸化，是研究JAK-STAT信號(hào)通路的重要分子工具。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)miR-210能明顯降低肝癌細(xì)胞活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1期。我們通過(guò)miR-210-mimic轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖受到明顯抑制,細(xì)胞增殖曲線趨勢(shì)與使用AG490相似,與未轉(zhuǎn)染組的GBC-SD細(xì)胞增殖均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明miR-210可以抑制GBC-SD細(xì)胞的增殖,通過(guò)細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-210可將GBC-SD細(xì)胞阻滯于G0/G1期,這可能是miR-210抑制GBC-SD細(xì)胞增殖的主要原因。將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期可提高細(xì)胞對(duì)放療敏感性,這對(duì)膽囊癌根治手術(shù)后的輔助性治療極為關(guān)鍵。

總之，miR-210在膽囊癌組織中呈低表達(dá),miR-210的高表達(dá)可將GBC-SD細(xì)胞阻滯于G0/G1期從而抑制細(xì)胞增殖，其分子機(jī)制可能與下調(diào)JAK-STAT信號(hào)通路有關(guān)，然而對(duì)miR-210在膽囊癌發(fā)病機(jī)制中的具體作用仍有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳萬(wàn)青,張思維,鄭榮壽,等.中國(guó)腫瘤登記地區(qū)2007年腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國(guó)腫瘤,2011,20(3):162-169.

[2] 陳永亮,黃志強(qiáng),周寧新,等.原發(fā)性膽囊癌110例臨床分析[J].中華腫瘤雜志,2007,29(9):704-706.

[3] 李剛強(qiáng),濮亞斌.膽囊癌患者血漿中相關(guān)microRNA的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2015,17(8): 1200-1203.

[4] 方茜,郝崗平. miRNA-210在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展[J]. 泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,34(5)：396-400.

[5] 李暉,吳武軍,范志勇,等. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α在膽囊癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志,2015,44(5)：580-582.

[6] Kiran RP, Pokala N, Dudrick SJ. Incidence pattern and survival for gallbladder cancer over three decades-an analysis of 10301 patients[J]. Ann Surg Oncol,2007,14 (2):277-280.

[7] 袁源. miRNA-145在膽囊癌發(fā)病過(guò)程中的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D].中南大學(xué),2014.

[8] 洪璇,張艷橋. JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤中的研究進(jìn)展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,31(4):463-466.

[9] Yang W,Sun T. Downregulation of miR-210 expression inhibits proliferation，induces apoptosis and enhances radiosensitivity in hypoxic human hepatoma cells in vitro[J].Exp Cell Res,2012,318( 8) : 944-954.

(收稿：2015-12-25)

MiR-210 inhibits gallbladder carcinoma cell proliferation by blocking JAK-STAT signaling pathway Department of General Surgery, Ankang City Central Hospital (Ankang 725000)

Qiu WeiYang ChenglinLiu Yang

ABSTRACTObjective：To explore whether miR-210 inhibits gallbladder carcinoma cell proliferation by blocking JAK-STAT signaling pathway.Methods: The expressions of miR-210、STAT3、STAT5 were detected in 10 pairs of gallbladder cancer and paracancerous tissues by Real-time PCR; MiR-210 mimic was transfected into GBC-SD by LipofectamineTM2000 and GBC-SD was also disposed by JAK-STAT signaling pathway blocker AG490, and then the cell proliferation and cell cycle were tested by MTT and flow cytometry. Results: The down-regulation of miR-210 and up-regulation of STAT3, STAT5 were observed in the gallbladder cancer tissues (P<0.05); the expressions of STAT3、STAT5 was lower in GBC-SD disposed by MiR-210 mimic and AG490 than untransfected group; MiR-210 inhibited cell proliferation by blocking GBC-SD into G0/G1 phase. Conclusion: MiR-210 inhibits the expressions of STAT3, STAT5 and GBC-SD cell proliferation by blocking JAK-STAT signaling pathway.

KEY WORDSGallbladder neoplasm/pathologyMicroRNAsSTAT3Transcription factorSTAT5 Transcription factor

通訊作者：▲西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科

【中圖分類號(hào)】R735.8

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.004