西安交通大學第一附屬醫(yī)院(西安710061)　李福廣　徐　軍

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姜黃素對原發(fā)性肝癌組織中肝星狀細胞活性影響的實驗研究*

西安交通大學第一附屬醫(yī)院(西安710061)李福廣徐軍

摘要目的：探索姜黃素對肝星狀細胞增殖、侵襲能力及相關分子表達的影響。方法：取新切取的肝細胞癌組織,利用組織消化分離培養(yǎng)法,提取活化狀態(tài)的肝星狀細胞,鑒定細胞類型、評估細胞活性及純度。對新鮮提取的肝星狀細胞,經不同濃度的姜黃素干預后用MTT法檢測細胞增殖,用Transwell實驗檢測姜黃素對肝癌相關肝星狀細胞侵襲能力的影響。分別提取細胞總mRNA及總蛋白,運用Realtime-PCR檢測姜黃素對肝癌相關肝星狀細胞侵襲相關分子(MMP-2、TIMP-1、I 型膠原、層粘連蛋白)表達影響。結果：姜黃素可以抑制肝細胞癌相關肝星狀細胞的增殖,并呈現(xiàn)濃度及時間依賴效應；姜黃素處理可以降低肝細胞癌相關肝星狀細胞侵襲能力；姜黃素可以下調肝細胞癌相關肝星狀細胞侵襲相關分子MMP-2、I 型膠原的表達,上調TIMP-1、層粘連蛋白的表達。結論：姜黃素可以抑制肝細胞癌相關肝星狀細胞的增殖,并降低其侵襲能力,該作用可能與調控侵襲相關分子MMP-2、TIMP-1、I 型膠原、層粘連蛋白等的表達有關。

主題詞姜黃素癌,肝細胞細胞增殖@肝星狀細胞

我國是世界上原發(fā)性肝癌高發(fā)地區(qū)之一,肝癌標化發(fā)病率是25.7/10萬,為僅次于肺癌、胃癌的最常見惡性腫瘤[1]。間質化是原發(fā)性肝細胞癌重要特征，腫瘤微環(huán)境在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。肝星狀細胞(HSC)是肝細胞癌微環(huán)境中的重要組分,研究證實肝星狀細胞高度參與肝細胞癌的起源、發(fā)生、發(fā)展、轉移過程,是肝細胞癌細胞外基質的重要來源[2]。姜黃素是從天然植物姜科、天南星科等中提取的一種多酚類化學物質,近年來研究表明,姜黃素是一種優(yōu)良的抗腫瘤藥物[3]。研究證實其與纖維化肝組織內肝星狀細胞活性相關,但姜黃素對肝細胞癌相關性星狀細胞的作用尚不清楚。本研究擬探索姜黃素對肝細胞癌相關性星狀細胞增殖、侵襲能力的影響及其可能機制，從而為姜黃素用于肝癌的治療提供依據。

材料和方法

1材料本實驗所用原代肝星狀細胞(HSC)從西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術切除的肝癌組織標本中分離提取。標本獲取前獲得患者許可,并經我院倫理委員會批準。切取1.0～1.5 g肝癌組織,立即放置于4℃無菌的含有青霉素和鏈霉素的Hanks平衡鹽中,于無菌操作臺,在37 ℃含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中剪刀剪碎肝細胞癌組織至極微小的碎片組織,利用無菌PBS漂洗3次肝癌碎片組織后置于含0.05 %膠原酶P、0.02 %鏈霉蛋白酶以及0.1 %DNA酶的Gey平衡鹽消化液(GBSS)中,于37 ℃水浴振蕩45 min,以從肝癌碎片組織中分離HSC。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清為澳大利亞Hyclone公司產品。四甲基偶氮唑鹽MTT、青霉素、鏈霉素、鹽霉素為Sigma公司產品；Trizol購自美國Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒及Realtime PCR試劑盒購自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司；所需引物由上海生物工程技術服務有限公司負責設計合成；兔抗鼠MMP-2、兔抗β-actin及兔抗TIMP-1購自美國Santa Cruz公司；鼠抗I 型膠原、鼠抗層粘連蛋白、鼠抗GFAP及鼠抗α-SMA抗體購自美國Cell signaling公司；山羊抗兔及山羊抗鼠二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司；RIPA蛋白裂解液購自上海申能博彩生物科技公司。

2細胞培養(yǎng)原代HSC含10 %胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含青霉素、鏈霉素各100 ng/ml)培養(yǎng)于37 ℃含5 %CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),用0.25 %的胰酶消化傳代,選用處于對數(shù)生長期的細胞用于所有實驗。

3MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期的HSC制成細胞懸液,以每孔5×103個細胞于96孔板中接種HSC,待細胞貼壁后,加0.1 %FBS的DMEM培養(yǎng)基過夜饑餓處理。將饑餓后的HSC設立6個平行實驗孔,分別給以0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM等濃度的姜黃素進行干預,干預后繼續(xù)培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、48 h、72 h。上述干預時間點到底后,每孔加入MTT溶液10 μl(濃度5 mg/ml),繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去上清,每孔再加入DMSO溶液200 μl,當出現(xiàn)藍紫色顆粒結晶并充分溶解后,檢測OD(490 nm)值。實驗重復3次。按下列公式計算各實驗組細胞增殖率：細胞增殖率=1-(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。以OD值為縱軸，時間為橫軸，繪制細胞生長曲線圖。

4劃痕實驗檢測細胞遷移能力取2代以內的HSC種植到6孔板,分別給予0 μM、10 μM、20 μM的姜黃素進行干預48 h后,收集細胞，無血清培養(yǎng)基重懸單細胞，取8×104個細胞種植到包被有基質膠的Transwell小室內，下室為700 μl含20 %胎牛血清的培養(yǎng)基。放培養(yǎng)箱36 h后,固定染色,擦拭膜上細胞，隨機取10個視野，應用Nikan攝像系統(tǒng)200倍鏡下照相并計數(shù)。以穿過基質膠的下室細胞數(shù)作為觀察指標。

5Realtime-PCR檢測相關基因的mRNA表達將0 μM、10 μM及20 μM姜黃素干預24 h后的HSC按Trizol法提取細胞總RNA。用Taka逆轉錄試劑盒進行逆轉錄操作，得到的cDNA用于Real-time-PCR擴增。PCR反應體系為20 μl，其中含有：2 μl逆轉錄產物(cDNA),上游與下游引物各1 μl,2×SYBY green PCR Master 10 μl,用ddH2O水補足體積至20μl。PCR反應條件如下：95℃預變性5 min；95℃變性30 s,58 ℃退火30 s,74℃延伸30 min,共40個循環(huán)；74℃延伸10 min以終止反應。以GAPDH作為內參照,每組設置3個復孔。Realtime PCR反應完成后,待測基因的表達水平通過△△CT計算方法進行定量表達。△△CT =實驗組(CT目的基因- CTGAPDH)-對照組(CT目的基因-CTGAPDH)。擴增用目的基因引物見表1。

附表　引物設計序列

結果

1肝星狀細胞的提取與鑒定本實驗成功提取到肝細胞癌組織內的肝星狀細胞。在倒置光學顯微鏡下,觀察到由肝癌組織內提取、培養(yǎng)后第1天的肝星狀細胞呈多樣的星形狀(見圖1 A、B),提取后第1天行臺盼藍拒染實驗證實細胞活力達85 %以上。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是肝癌組織內肝星狀細胞的特有成分,常作為肝星狀細胞的鑒定標志物；平滑肌肌動蛋白(a-SMA)則是活化的肝星狀細胞的關鍵標志,它的高表達常常提示肝星狀細胞具有活化表型[4]。對提取后第1～2天的肝星狀細胞行GFAP、a-SMA的免疫熒光實驗,證實由上述實驗方法提取的細胞為本實驗需要的活化狀態(tài)的肝星狀細胞(見圖1 C、D)。后續(xù)的實驗,我們選取經過2～3次傳代培養(yǎng)的肝星狀細胞進行藥物干預。

A、B：光鏡下,由肝癌組織中提取后第1天的肝星狀細胞(A圖放大倍數(shù)5×,B圖放大倍數(shù)20×)；C：提取后第1 天肝星狀細胞GFAP的免疫熒光圖(放大倍數(shù)20×)；D提取后第1天肝星狀細胞a-SMA的免疫熒光圖(放大倍數(shù)20×)

圖1肝星狀細胞的提取與鑒定

2姜黃素抑制肝星狀細胞的增殖將含有不同終濃度(0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)姜黃素的培養(yǎng)基分別干預融合度為30 % ～ 40 %的HSC至不同的時間點(12 h、24 h、48 h、72 h),采用MTT法評估姜黃素對肝星狀細胞增殖性的影響見附表。與0 μM對照組相比,姜黃素在5～40μmol/L濃度范圍內對HCS增殖能力均具有一定的抑制作用,呈現(xiàn)一定的濃度依耐性和時間依耐性。相比對照組，5 μM組可抑制HSC增殖,但強度并不大,連續(xù)干預72 h,抑制率僅(16.41±2.14)%；40 μM組則可明顯抑制其的增殖,干預48 h后抑制率即可達(36.72±2.26)%,同時,注意到相比20 μM組,40 μM組對肝星狀細胞增殖的抑制率提升并不明顯，此結果提示隨著姜黃素干預濃度的提高，其對HSC的抑制效率提升潛力下降，濃度依耐性特點逐漸消失。

3姜黃素抑制肝星狀細胞的侵襲見圖2。與0 μM的對照組相比,在給予10 μM、20 μM 姜黃素干預48 h后肝星狀細胞的侵襲能力明顯增強(P< 0.05),且20 μM的姜黃素干預濃度較10 μM抑制作用更為明顯(P< 0.05),提示姜黃素對肝星狀細胞侵襲性的抑制作用具有濃度依耐性。由于此實驗是在無血清培養(yǎng)基中進行的,故可有效排除肝星狀細胞增殖所產生的干擾。

附表　姜黃素對肝星狀細胞增殖的影響±s,n=3)

注：各組時間點與0 μM組比較，*P<0.05

與0 μM組比較,*P<0.05

A：姜黃素干預48h后肝星狀細胞Tanswell實驗的代表性圖；B：細胞侵襲實驗的統(tǒng)計分析結果,姜黃素對肝星狀細胞侵襲相關分子表達的影響

圖2姜黃素對肝星狀細胞侵襲性的影響

4姜黃素對肝星狀細胞侵襲相關蛋白表達的影響將肝星狀細胞種植到6孔板，分別給予0 μM、10 μM、20 μM的姜黃素進行干預36 h后，收集細胞，提取姜黃素干預后肝星狀細胞的總mRNA。通過Realtime-PCR(RT-PCR)技術檢測肝星狀細胞內侵襲相關基因(MMP-2、TIMP-1、I 型膠原及層粘連蛋白)的變化見圖3。結果顯示,姜黃素干預36 h后，相比0 μM對照組,10 μM組、20 μM組肝星狀細胞細胞內MMP-2及I 型膠原mRNA的表達水平明顯下調，TIMP-1及層粘連蛋白的mRNA水平明顯升高,且20 μM組的變化更為明顯,提示姜黃素對肝星狀細胞內侵襲相關基因表達水平的調節(jié)具有濃度依耐性。姜黃素干預48 h后,收集細胞并提取細胞總蛋白用于Western blot分析。與PCR檢測結果一致,姜黃素干預可以顯著降低肝星狀細胞MMP-2、I 型膠原蛋白的表達水平,并提高TIMP-1、層粘連蛋白的表達，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上實驗結果說明姜黃素抑制肝星狀細胞的侵襲能力可能是通過抑制侵襲相關基因MMP-2、I 型膠原的表達以及提高TIMP-1、層粘連蛋白的表達而實現(xiàn)的。

與0μM組比較,*P<0.05,** P<0.01

討論

近年來的研究證實肝星狀細胞通過合成分泌細胞因子、趨化因子、生長因子與ECM組分,高度參與肝細胞癌的起源、發(fā)生、發(fā)展、轉移過程[5]。Amann等[6]研究顯示,活化的肝星狀細胞還可以通過高表達血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素-1等促進肝癌生長。本實驗通過組織消化培養(yǎng)法提取了肝細胞癌組織內活化的HSC,經流式細胞術檢測分析提示新鮮提取的細胞純度達到75%～85%，臺盼藍拒染實驗證實細胞活力達85%以上,以此應用于后續(xù)的實驗研究。

由于植物藥的易獲取性、用藥安全性等因素,其抗癌作用越來越受到重視,姜黃素即為其中的典型代表,具有發(fā)展為臨床化療藥的潛力,近年來已有大量研究聚焦于姜黃素對肝細胞癌的抗腫瘤作用及其機制[7]。肝星狀細胞為肝細胞癌組織內尤為關鍵的間質成分,同時也為肝纖維化、肝硬化逐漸進展的核心促進因素。既往的研究結果提示姜黃素可抑制肝星狀細胞的增殖，促進其凋亡[8]，然而姜黃素對肝癌細胞相關性星狀細胞的影響及其分子機制研究卻鮮有報道。本實驗首先通過組織消化培養(yǎng)法，從新鮮切取的肝細胞癌組織內成功提取到活化的肝星狀細胞。對新鮮提取的肝細胞癌相關肝星狀細胞，分別給予不同終濃度姜黃素處理后發(fā)現(xiàn)，相較0 μM組，5 μM組、10 μM組、20 μM組、40 μM組的肝星狀細胞增殖性均明顯下降，并且呈一定的濃度依耐性和時間依耐性，以10 μM組、20 μM組的干預效率最佳。進一步利用Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，相較0 μM組，10 μM組、20 μM組的肝星狀細胞侵襲性顯著被抑制。既往已有大量研究證實MMP-2可顯著提高HSC、肝癌細胞等的侵襲力，相反TIMP-1、層粘連蛋白則抑制HSC的侵襲轉移能力。與此相吻合的是,本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)給予10 μM或者20 μM姜黃素處理后，比起0 μM處理組，肝星狀細胞內MMP-2表達下調,而TIMP-1、層粘連蛋白表達上調。I 型膠原為肝星狀細胞合成分泌的重要細胞外基質成分，本實驗中我

們注意到,相較對照組,姜黃素干預組HSC合成分泌的I 型膠原蛋白明顯增加；此實驗結果,提示姜黃素同樣可調節(jié)肝癌細胞組織內HSC合成分泌細胞外基質成分的功能,與姜黃素對肝纖維化、肝硬化組織內肝星狀細胞發(fā)揮的作用保持一致。綜上所述,本實驗結果顯示姜黃素可以抑制肝細胞癌相關肝星狀細胞的增殖,并降低其侵襲能力,該作用可能與調控侵襲相關分子MMP-2、TIMP-1、I 型膠原、層粘連蛋白等的表達有關。

參考文獻

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[8]趙景潤.姜黃素對肝星狀細胞增殖與凋亡的影響的初步研究[D] .暨南大學,2004.

(收稿：2015-12-18)

【中圖分類號】R737.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.003

*國家自然科學基金資助項目(30371398)