西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科(西安 710077)　李武軍　 于　良　吳勝利

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白藜蘆醇對(duì)熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中HIF-1α和VEGF表達(dá)的抑制作用*

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科(西安 710077)李武軍 于良△吳勝利△

摘要目的：探討白藜蘆醇對(duì)熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中HIF-1α和VEGF表達(dá)的抑制作用。方法：選取24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組,模型組和白藜蘆醇處理組各8只,通過(guò)肝門動(dòng)脈阻斷1 h后再灌注1 h來(lái)建立缺血再灌注模型,白藜蘆醇處理組在缺血再灌注前進(jìn)行白藜蘆醇20 mg/kg預(yù)處理30 min。建模后檢測(cè)血清中ALT、ALP和TBIL的含量變化；肝臟中HIF-1α和VEGF表達(dá)通過(guò)RT-PCR和Western blot來(lái)檢測(cè)。結(jié)果：與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清中ALT、ALP和TBIL的含量及肝臟中HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)；與模型組相比,白藜蘆醇20 mg/kg預(yù)處理后大鼠血清中ALT、ALP和TBIL的含量及肝臟中HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：白藜蘆醇對(duì)熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中HIF-1α和VEGF表達(dá)具有抑制作用；因此，HIF-1α/VEGF可能是白藜蘆醇在肝臟腫瘤中起抗癌作用的一個(gè)藥物靶點(diǎn)。

主題詞再灌注損傷熱缺血 缺氧誘導(dǎo)因子1血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子@白藜蘆醇

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種最常見(jiàn)的惡性腫瘤,肝切除和肝移植是常用的治療手法，而治療后的腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍是目前面臨的一個(gè)主要問(wèn)題。肝臟缺血再灌注損傷(Hepatic ischemia/reperfusion injury,HIRI)是肝臟外科手術(shù)、休克復(fù)蘇、嚴(yán)重肝外傷、肝臟移植等過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)的病理過(guò)程；HIRI可能通過(guò)激活細(xì)胞入侵及血管生成等途徑來(lái)促進(jìn)肝臟腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[1]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxiainducible factor-1 alpha,HIF-1α)是缺氧/缺血的主要調(diào)節(jié)因子。研究表明,HIRI引發(fā)的肝腫瘤轉(zhuǎn)移可能與HIRI后HIF-1α的表達(dá)上調(diào)相關(guān)[2]。HIF-1α可以刺激血管內(nèi)皮生成因子(Angiogenic vascular endothelial growth factor,VEGF),已有研究證明HIF-1α/VEGF通路與多種腫瘤的發(fā)展相關(guān)[3]。白藜蘆醇(RES)是一種具有抗癌活性的多酚類植物抗毒素,通過(guò)影響與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞事件來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[4]；近期研究表明RES具有抑制血管生成的作用,但其機(jī)制有待進(jìn)一步探討[5]。本研究旨在探討RES是否可以抑制缺血再灌注損傷(I/R)誘導(dǎo)的HIF-1α和VEGF表達(dá),為RES成為HCC病人手術(shù)后減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新藥物提供理論依據(jù)。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)試劑RES和DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。RES用DMSO溶解后用RPMI-1640進(jìn)行稀釋,終濃度為4 mg/ml。SD大鼠由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(周齡9～10周,體重190～210 g)。

2動(dòng)物分組及模型建立24只大鼠隨機(jī)分為3組各8只，所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由進(jìn)水。戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉(50 mg/kg)。對(duì)照組，腹部切開(kāi)6 cm切口以充分暴露肝臟，整個(gè)切口保持60 min,不進(jìn)行肝缺血手術(shù),隨后關(guān)腹。模型組：腹部切開(kāi)6 cm切口以充分暴露肝臟，用動(dòng)脈夾夾閉肝門,1 h后開(kāi)放,隨后關(guān)腹,于1 h后取樣。RES預(yù)處理組：在建模前30 min通過(guò)尾靜脈注射RES(20 mg/kg);其余同模型組。模型組在建模前30 min通過(guò)尾靜脈注射生理鹽水(20 mg/kg)。

3樣品采集所有大鼠在再灌注1 h后注射戊巴比妥(100 mg/kg IV)處死，假手術(shù)組也同時(shí)處死，收集肝臟組織及下腔靜脈血。靜脈血經(jīng)4℃ 4000 r/min離心3 min取血清備用；肝臟組織在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

4血清中各指標(biāo)的檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AL)，膽紅素(TBIL)，堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)采用羅氏相關(guān)試劑盒,利用日立AU5400自動(dòng)生化分析儀(Hitachi Corp.,日本)進(jìn)行分析。

5RT-PCR采用TRozlo法提取肝臟中總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,β-actin作為內(nèi)參基因。HIF-1α的引物序列為：sense 5’-ACTGCACAGGCCACATTCAT-3’,antisense 5’-CGAGGCTGTGTCGACTGAGA-3’；VEGF的引物序列為：sense 5’-AGGCGAGGCAGCTTGAGTTA-3’antisense5’-CTGTCGACGGTGACGATGGT-3’；β-actin的引物序列為：5’-CCTAGGCACCAGGGTGTGAT-3’,antisense5’-TTGGTGACAATGCCGTGTTC-3’。RT-PCR的步驟為95℃預(yù)處理3 min；95℃變性10 s,55℃退火30 s,60 ℃延伸1 min,進(jìn)行39個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6Western blot利用試劑盒提取肝臟組織總蛋白并進(jìn)行定量,β-actin作為內(nèi)參,樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上,封閉60min后在一抗(1∶3000)中4℃孵化過(guò)夜,洗膜后與二抗(抗鼠IgG，1∶6000)中室溫孵化120 min；之后洗膜并利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(Amersham, Piscataway, NJ, USA),分析采用BioSpectrum500凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行(UVP, Upland, CA, USA)。本實(shí)驗(yàn)所用所有抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1肝功能檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表。與對(duì)照組相比，缺血再灌注后血清中ALT、ALP和TBIL含量均顯著上調(diào)(P均<0.05)；而經(jīng)過(guò)RES 20 mg/kg預(yù)處理后,與模型組相比,缺血再灌注誘導(dǎo)的這種血清中ALT、ALP和TBIL含量上升得到顯著抑制(P均<0.05)。

附表　各組生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組相比,*P<0.05；與模型組相比,#P<0.05

2HIF-1α表達(dá)變化情況見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，缺血再灌注后肝臟組織中HIF-1α的表達(dá)量在mRNA和蛋白水平上均顯著上調(diào)(P均<0.05)；而經(jīng)過(guò)RES 20 mg/kg預(yù)處理后，與模型組相比，缺血再灌注誘導(dǎo)的HIF-1α的表達(dá)量上升得到顯著抑制(P均<0.05)。

A：HIF-1α mRNA的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(與模型組相比,*P<0.05)；B：HIF-1α蛋白水平的Western blot檢測(cè)結(jié)果，β-actin作為內(nèi)參

圖1大鼠肝臟中HIF-1α的表達(dá)

3VEGF表達(dá)變化情況見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，缺血再灌注后肝臟組織中VEGF的表達(dá)量在mRNA和蛋白水平上均顯著上調(diào)(P均<0.05)；而經(jīng)過(guò)RES 20 mg/kg預(yù)處理后，與模型組相比，缺血再灌注誘導(dǎo)的VEGF的表達(dá)量上升得到顯著抑制(P均<0.05)。

A： VEGF mRNA的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(與模型組相比,*P<0.05)； B：VEGF蛋白水平的Western blot檢測(cè)結(jié)果，β-actin作為內(nèi)參

圖2大鼠肝臟中VEGF的表達(dá)

討論

HIRI可能會(huì)導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)性和代謝性的損傷，是肝移植和肝臟外科手術(shù)后所面臨的一個(gè)主要問(wèn)題。HIRI對(duì)機(jī)體造成的傷害可能與線粒體釋放、5-三磷酸腺苷損耗、電解質(zhì)平衡的改變、Kupffer細(xì)胞激活、氧化應(yīng)激及促炎癥因子表達(dá)的上調(diào)等多種因素相關(guān)[6]。在I/R引發(fā)的缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1的表達(dá)來(lái)保護(hù)肝臟。HIF-1家族包括HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞族，HIF-1α在1992年首次由Semenza發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，其研究結(jié)果顯示，低氧環(huán)境可調(diào)控HIF-1α的表達(dá)但對(duì)HIF-1β的表達(dá)無(wú)影響[7]；當(dāng)機(jī)體處于氧飽和狀態(tài)時(shí)，HIF-1α?xí)诩?xì)胞質(zhì)中通過(guò)泛素途徑降解。在缺氧條件下，HIF-1α降解受阻，使得細(xì)胞內(nèi)HIF-1α得到積累并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合形成同源復(fù)合體后與目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)的低氧應(yīng)答組件結(jié)合激活包括VEGF、促紅細(xì)胞生成素、糖酵解酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白等與缺氧條件下細(xì)胞自我保護(hù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

VEGF是HIF-1α下游的直接調(diào)控基因，通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)血管的形成等途徑在腫瘤血管再生中起重要作用，此外,VEGF還可以促進(jìn)一種公認(rèn)的可啟動(dòng)肝臟再生的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的表達(dá)。綜上,肝臟局部缺血后HIF-1α的表達(dá)可能存在雙重作用,一方面保護(hù)肝臟免受I/R帶來(lái)的損傷，另一方面可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管再生促進(jìn)HCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

RES是一種環(huán)氧化酶抑制劑,具有抗氧化、抗血小板活性及抗炎癥的作用[8]。研究表明，RES可以通過(guò)其抗氧化活性及清除再灌注后產(chǎn)生的自由基的方式來(lái)保護(hù)肝臟免受I/R帶來(lái)的損傷。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RES具有抗腫瘤血管生成的作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。有研究顯示RES可以通過(guò)NF-kappa B途徑抑制HepG2細(xì)胞中VEGF的表達(dá)；RES可通過(guò)抑制AKT和促分裂原活化蛋白激酶活性抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)及通過(guò)蛋白酶體途徑促進(jìn)HIF-1α的降解來(lái)抑制人卵巢癌的發(fā)生和血管生成[9]。

本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,缺血再灌注后血清中ALT,ALP和TBIL含量均顯著上調(diào)；而經(jīng)過(guò)RES 20 mg/kg預(yù)處理后,與模型組相比,缺血再灌注誘導(dǎo)的這種血清中ALT,ALP和TBIL含量上升得到顯著抑制。與對(duì)照組相比,缺血再灌注后肝臟組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)量在mRNA和蛋白水平上均顯著上調(diào)；而經(jīng)過(guò)RES 20 mg/kg預(yù)處理后,與模型組相比,缺血再灌注誘導(dǎo)的HIF-1α和VEGF的表達(dá)量上升得到顯著抑制。進(jìn)一步證實(shí)了RES在肝臟I/R后對(duì)肝臟的保護(hù)作用；除此以外，我們首次在體內(nèi)試驗(yàn)中證實(shí)了RES具有抗血管生成的作用；提示我們，RES抗血管生成的部分機(jī)制可能是抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)；但RES調(diào)控HIF-1α和VEGF表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，RES在熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中通過(guò)抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗血管生成的作用。HIF-1α/VEGF作為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子,可能是白藜蘆醇在肝臟腫瘤中起抗癌作用的一個(gè)藥物靶點(diǎn)。

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(收稿：2015-12-07)

The suppressive effects of resveratrol on HIF-1α and VEGF expression after warm ischemia and reperfusion in rats liver Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University(Xi’an 710077)

Li WujunYu Liang Wu Shengli

ABSTRACTObjective: The aim of the present study was to investigate the effects of resveratrol (RES) on the expression of ischemic-induced HIF-1α and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rats liver. Methods: Twenty-four rats were randomized into Sham, ischemia/reperfusion (I/R), and RES preconditioning groups. I/R was induced by portal pedicle clamping for 60 minutes followed by reperfusion for 60 minutes. The rats in RES group underwent the same surgical procedure as I/R group, and received 20 mg/kg resveratrol intravenously 30 min prior to ischemia. Blood and liver tissue samples were collected and subjected to biochemical assays, RT-PCR, and Western blot assays. Results: I/R resulted in a significant (P<0.05) increase in serum biochemical parameters and liver HIF-1α and VEGF at both mRNA and protein levels 60 minutes after reperfusion. The serum biochemical parameters and the mRNA and protein expressions of HIF-1α and VEGF decreased significantly in RES group when compared to I/R group (P<0.05). Conclusion: The inhibiting effects of RES on the expressions of HIF-1α and VEGF induced by I/R in rats liver suggested that HIF-1α/VEGF can be a promising drug target for RES in the development of an effective anticancer therapy for the prevention of hepatic tumor growth and metastasis.

KEY WORDSReperfusion injury Warm ischemiaHypoxia-inducible factor 1Vascular endothelial growth factors@Resveratrol

【中圖分類號(hào)】R735.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.002

*陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(11JK0710)

△西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院