亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        過表達(dá)microRNA-29a上調(diào)鋅脂蛋白91對大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響*

        2016-06-20 05:38:49劉永敏鄢文海
        關(guān)鍵詞:檢測

        劉永敏,段 萍,鄢文海,何 芳,唐 娜,鐘 華

        (1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,新疆石河子832002;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,河南鄭州450001;3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,河南鄭州450001)

        ?

        過表達(dá)microRNA-29a上調(diào)鋅脂蛋白91對大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響*

        劉永敏1,段萍2,鄢文海3,何芳1,唐娜1,鐘華1

        (1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,新疆石河子832002;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,河南鄭州450001;3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,河南鄭州450001)

        摘要:目的建立高感染效率、穩(wěn)定過表達(dá)microRNA-29a(miR-29a)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12),探索miR-29a對PC12細(xì)胞凋亡的影響。方法將miR-29a前體表達(dá)載體、空白對照載體進(jìn)行慢病毒包裝,用病毒上清感染PC12并進(jìn)行抗性篩選。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測miR-29a的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-29a穩(wěn)定過表達(dá)組、空質(zhì)粒對照組以及未感染組PC12細(xì)胞的凋亡情況,利用TargetScan 6.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-29a的關(guān)鍵靶點,RT-qPCR以及Western blot檢測預(yù)測的miR-29a下游靶基因mRNA以及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果經(jīng)抗性篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-29a的PC12細(xì)胞系,熒光顯微鏡下觀察各組PC12細(xì)胞的感染效率均達(dá)80%以上,miR-29a過表達(dá)組凋亡率為(5.1±0.92)%,空質(zhì)粒對照組為(1.832±0.26)%,未感染組為(1.667±0.185)%,miR-29a過表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡(P<0.01),空質(zhì)粒對照組與未感染組細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;RT-qPCR檢測miR-29a過表達(dá)時鋅指蛋白91(ZFP91)的表達(dá)量升高,miR-29a過表達(dá)組ZFP91 mRNA的表達(dá)量是空質(zhì)粒對照組的1.835倍(P=0.000),空質(zhì)粒對照組與未感染組ZFP91 mRNA的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;Western blot檢測的ZFP91蛋白表達(dá)量與空質(zhì)粒對照組比較也升高。結(jié)論在PC12中miR-29a過表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡,過表達(dá)miR-29a也促進(jìn)ZFP91表達(dá),其機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。

        關(guān)鍵詞:microRNA-29a;鋅指蛋白91;細(xì)胞凋亡;大鼠;嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞;實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

        微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的、長18~25 nt的非編碼小分子RNA。miRNA通過直接結(jié)合目標(biāo)基因的3'-非翻譯區(qū)(3'- untranslated region,3'-UTR)或編碼序列(coding sequence,CDS),調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄后水平,該調(diào)節(jié)可能通過抑制mRNA的蛋白質(zhì)翻譯或促進(jìn)降解mRNA。miR-29a是miR-29家族成員之一,于2001年Lagos-Quintana等[1]在人Hela細(xì)胞中克隆獲得的,定位于人染色體7q32.3的負(fù)鏈。目前,研究已確定人類miR-29廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。

        miRNA在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面作用顯著,已有很多研究表明miR-29a在很多腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)(如腦膠質(zhì)瘤[2],慢性淋巴細(xì)胞白血?。?]、急性髓性白血病等[4]),同時也有一些研究表明miR-29在心血管疾?。?]、神經(jīng)退行性疾?。?-7]、艾滋病[8-10]中也出現(xiàn)異常高表達(dá),通過調(diào)控下游靶基因促進(jìn)正常細(xì)胞凋亡,從而引起相關(guān)疾病。miR29a對大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(pheochromocytoma cells,PC12)凋亡的影響及其相應(yīng)靶基因的調(diào)控研究目前仍缺乏報道。本研究通過慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體表達(dá)載體感染PC12細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞凋亡的變化,用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、Western blot檢測下游靶基因鋅指蛋白91(zinc finger protein 91,ZFP91)表達(dá)的變化,進(jìn)一步豐富miR-29a促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)理論,為闡明miR-29在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù),為其防治提供新靶標(biāo)。

        1材料與方法

        1.1 實驗試劑

        miRNA-29a前體表達(dá)克隆RmiR6139-MR03、對照質(zhì)粒CmiR60001-MR03,均帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),以及Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit均購自廣州GeneCopoeia公司,無血清培養(yǎng)基Ⅰ購自美國Sigma公司,High glucose達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)均購自美國Hyclone公司,藻紅蛋白-Annexin Apoptosis Detection Kit以及異硫氰酸熒光素-Annexin Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司,總RNA提取試劑盒(Trizol)購自北京天根生化科技有限公司,cDNA第一鏈試劑盒、SybrGreen PCR Master Mix(2×)購自大連寶生生物工程有限公司,ZFP91及β-Actin抗體均購自美國Santa Cruz公司,嘌呤霉素購自北京Solabio公司。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

        大鼠嗜鉻瘤PC12細(xì)胞由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞中心饋贈,人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞株由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室陳萍老師饋贈,兩種細(xì)胞均用High-glucose DMEM和10%FBS培養(yǎng)。

        1.3 慢病毒包裝

        包裝前24 h,分別接種4×106~5×106個293T細(xì)胞到2個100 mm培養(yǎng)皿中。按照慢病毒包裝試劑盒(Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit)說明書,分別包裝miRNA-29a前體表達(dá)質(zhì)粒、對照質(zhì)粒,孵育過夜(8~14 h)換新鮮培養(yǎng)基,再培養(yǎng)48 h收獲病毒上清,500×g離心10 min去除細(xì)胞碎片。病毒上清可馬上用于感染,或分裝置于-80℃冰箱冷凍保存。

        1.4 慢病毒感染PC12細(xì)胞、抗性篩選以及計算感染效率

        感染前24 h接種2×105個/孔的PC12細(xì)胞于6孔板,病毒感染時細(xì)胞50%~70%融合。每孔分別加miR-29a前體表達(dá)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒的病毒上清液各200μl,并各加入終濃度為4μg/ml的聚凝胺。感染24 h后,吸出原培養(yǎng)基,換終濃度為1.5μg/ml嘌呤霉素培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。之后每3天更換抗性培養(yǎng)基,連續(xù)篩選14 d,分別命名這兩組細(xì)胞為miR29a-PC12和EGFP-PC12-control(空質(zhì)粒對照組)。計算感染效率有兩種方法:①通過流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比來計算感染效率,該方法得到的感染效率很精確;②通過4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核染色,熒光顯微鏡下選取同一個視野,分別數(shù)熒光細(xì)胞個數(shù),計算EGFP陽性細(xì)胞百分比=EGFP陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%,隨機(jī)選取幾個視野求均數(shù),該方法可以粗略計算感染效率。

        1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組細(xì)胞的凋亡率

        用0.25%的胰酶消化細(xì)胞,將細(xì)胞懸液移至流式管中,1 000 r/min離心5min,棄上清液,磷酸鹽緩沖溶液洗2遍,離心棄上清液。將細(xì)胞重懸于Annexin ⅤBinding Buff中,再各加入4μl PE-AnnexinⅤ和4μl 7-氨基放線菌素(7-AAD),輕柔混勻,室溫避光放置15 min,每管各加入200μl 1×AnnexinⅤBinding Buffer,混勻,1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

        1.6 RT-qPCR檢測miR-29a下游的靶基因

        引物序列:ZFP91正向引物:TGCGACATGCGAA ACATCATA,反向引物:GTGTACTGCCAGATTGTGG GAAC。各組細(xì)胞總RNA提取,cDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA,在冰上配置反應(yīng)體系(20μl):Sybr Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10μl,PCR Forward Primer(10μmol)0.5μl,PCR Reverse Primer (10μmol)0.5μl,Rox Reference Dyell(50×)0.4μl,cDNA模板(≤100 ng)2.0μl,ddH2O 6.0μl。兩步法PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火34 s。

        1.7 Western blot檢測miR29a下游靶蛋白的變化

        提取各組細(xì)胞的總蛋白并定量,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,調(diào)節(jié)電壓,使過分離膠120 V,基層膠60 V,以染料的前沿遷移至凝膠的底部為標(biāo)準(zhǔn)終止電泳。恒定電流70 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉封閉膜,一抗孵育4℃搖床過夜,加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG(1∶5 000)37℃孵育1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,顯影定影,沖洗膠片,對條帶進(jìn)行灰度分析。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 慢病毒包裝

        在倒置顯微鏡下觀察293T細(xì)胞,呈三角形,或多角形,貼壁生長,排列整齊。病毒包裝前細(xì)胞達(dá)到70%~80%匯合(見圖1包裝前),病毒包裝48 h后,293T細(xì)胞胞體略微回縮變圓,細(xì)胞狀態(tài)變差,培養(yǎng)皿內(nèi)漂浮著少量死細(xì)胞(見圖1包裝后),熒光顯微鏡下觀察,在慢病毒包裝后293T細(xì)胞發(fā)出大量綠色熒光(見圖1熒光顯微鏡下包裝后)。

        圖1 慢病毒包裝前后的293T細(xì)胞(×40)

        2.2 穩(wěn)定過表達(dá)miR-29a細(xì)胞株建立

        慢病毒感染后,經(jīng)過2周的嘌呤霉素篩選,分別篩選出穩(wěn)定過表達(dá)miR29a-PC12細(xì)胞株及EGFPPC12-control細(xì)胞株(見圖2),PC12細(xì)胞株的整個胞體都有綠色熒光蛋白表達(dá),通過DAPI核染色熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光,通過計算EGFP陽性細(xì)胞百分比,miR-29a-PC12的感染率為83.7% (72/84),空質(zhì)粒對照組感染率為88.4%(93/105)。

        圖2 中每一橫列為同一視野細(xì)胞在自然光下、熒光顯微鏡下DAPI核染色后藍(lán)色熒光以及熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白的表達(dá)情況圖2 穩(wěn)定過表達(dá)miR29a-PC12細(xì)胞株及EGFP-PC12-control細(xì)胞株(×40)

        2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率

        各組細(xì)胞凋亡率經(jīng)方差分析得出,各組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.099,P=0.008),進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn),MiR-29a過表達(dá)PC12細(xì)胞凋亡率顯著高于空質(zhì)粒對照組(P<0.01),說明MiR過表達(dá)可以促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡,而空質(zhì)粒對照組與未感染組比較,細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表1。

        圖3 過表達(dá)miR-29a對PC12細(xì)胞凋亡的影響

        表1 各組PC12細(xì)胞的凋亡率比較(n=3,%,±s)

        表1 各組PC12細(xì)胞的凋亡率比較(n=3,%,±s)

        注:1)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,計算方法:表達(dá)凋亡蛋白的細(xì)胞數(shù)(流式凋亡圖的Q4象限)/表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)× 100%;2)通過Dunnett(雙側(cè))兩兩比較,將EGFP- PC12-control設(shè)為對照組,將其與其他各組進(jìn)行兩兩比較

        組別  細(xì)胞凋亡率1)F值 P值 P值2)(兩兩比較)未感染組 1.667±0.185 12.099  0.008  0.972空質(zhì)粒對照組 1.823±0.26 1.000 miR-29a過表達(dá)組 5.1±0.92 0.011

        2.4 各組PC12細(xì)胞ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

        本研究前期利用Target Scan 6.0數(shù)據(jù)庫以及Pictar 5數(shù)據(jù)庫預(yù)測ZFP91可能是MiR-29a下游的靶基因,通過RT-qPCR及Western blot對各組PC12細(xì)胞的ZFP91 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測驗證,結(jié)果顯示,miR-29a過表達(dá)時ZFP91 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)升高,miR-29a過表達(dá)組ZFP91的表達(dá)量是空質(zhì)粒對照組的1.835倍(P=0.000),未感染組與空質(zhì)粒對照組相比ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖4、5。

        表2 各組ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)比較(n=3,±s)

        表2 各組ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)比較(n=3,±s)

        注:?與空質(zhì)粒對照組比較,P<0.05

        組別 ZFP91 mRNA ZFP91蛋白相對倍數(shù) F值  相對倍數(shù) F值 P值未感染組 1.113±0.048 14.320 0.000 0.941±0.211 21.990 0.000空質(zhì)粒對照組 1 1 P值miR-29a過表達(dá)組 1.835±0.211?2.17±0.47?

        圖4 各組PC12細(xì)胞的ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)

        圖5 Western blot檢測各組ZFP91蛋白的表達(dá)

        3 討論

        PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化細(xì)胞株,具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征。本實驗擬以PC12細(xì)胞為研究對象,通過慢病毒介導(dǎo)的miR-29a前體感染PC12細(xì)胞,使miR-29a在PC12細(xì)胞中過表達(dá),慢病毒感染后再經(jīng)過嘌呤霉素篩選,成功獲得穩(wěn)定過表達(dá)miR-29a的PC12細(xì)胞系,該細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代、凍存及復(fù)蘇,為后續(xù)實驗奠定良好基礎(chǔ)。

        miR-29a是miR-29家族中的一員,其存在于第7號染色體7q32上。已有很多研究證明miR-29a在腫瘤組織中低表達(dá),提示miR-29a可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡,其機(jī)制主要有miR-29a過表達(dá)可抑制NF-ΚB信號途徑[11],直接抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性[12]以及激活Caspase途徑[13],誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究也證實,miR-29a可促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡,而在細(xì)胞培養(yǎng)中本研究發(fā)現(xiàn)一些有意義的現(xiàn)象:①經(jīng)過相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)48 h后,miR-29a過表達(dá)組和對照組的培養(yǎng)基顏色明顯不同,miR-29a過表達(dá)組的培養(yǎng)基依舊為紅色,而空質(zhì)粒對照組和未感染組的培養(yǎng)基為橙黃色;②在相同的接種密度下,miR-29a過表達(dá)組細(xì)胞的增殖速度較空質(zhì)粒對照組慢?;谏鲜霈F(xiàn)象,筆者分析認(rèn)為由于培養(yǎng)液中有指示劑酚紅存在,故培養(yǎng)基顏色的變化可間接提示細(xì)胞生長的狀態(tài),miR-29a過表達(dá)可能抑制PC12細(xì)胞的增殖,使細(xì)胞生長狀態(tài)變差,產(chǎn)酸減少,所以在經(jīng)過48 h細(xì)胞培養(yǎng)后培養(yǎng)基還為紅色,這也從另一個角度印證miR-29a過表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。

        ZFP91是編碼63.4 kD的核蛋白,含有5個連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)域,屬于鋅指蛋白家族。ZFP91最早在人類急性髓性白血病模型中被發(fā)現(xiàn),認(rèn)為它在促進(jìn)細(xì)胞增殖以及抗細(xì)胞凋亡中起重要作用,抑制ZFP91的表達(dá)可顯著增加細(xì)胞凋亡率[14]。后續(xù)又有研究報道ZFP91在前列腺癌以及前列腺癌細(xì)胞系,例如前列腺淋巴結(jié)癌及人前列腺癌細(xì)胞、DU145、22Rv1中高表達(dá)[15],其機(jī)制可通過泛素化和激活絲裂原活化蛋白激酶3K14進(jìn)而主動調(diào)控非經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信號通路[15-16]。在結(jié)核桿菌感染子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系模型中ZFP91隨感染時間先升高后降低,這與結(jié)核桿菌感染后泛素蛋白酶體系統(tǒng)活化有關(guān)[17]。本研究前期利用Target Scan 6.0數(shù)據(jù)庫以及Pictar 5數(shù)據(jù)庫預(yù)測ZFP91的3'-非翻譯區(qū)有miR-29a的結(jié)合位點,ZFP91可能是miR-29a的靶基因,RT-qPCR 及Western blot驗證后發(fā)現(xiàn),miR-29a在PC12中長期、穩(wěn)定地過表達(dá)時ZFP91的表達(dá)是上調(diào)的,這與傳統(tǒng)意義上miRNA通過結(jié)合到靶基因的3'-UTR或編碼序列進(jìn)而下調(diào)靶基因mRNA或蛋白質(zhì)的經(jīng)典理論不相符,提示miRNA調(diào)控下游靶基因的方式可能不止靶向抑制這一種,還可以通過穩(wěn)定和上調(diào)靶基因進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡以及生物學(xué)特性。筆者推測可能的原因是:①由于miRNAs的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)特點,幾個miRNA可以共同調(diào)控一個基因的表達(dá),miR-29a在PC12細(xì)胞中過表達(dá),可能影響到其他miRNA或其他表觀遺傳學(xué)調(diào)控,進(jìn)而影響ZFP91的表達(dá);②外源性miR-29a過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖而促進(jìn)凋亡,而PC12細(xì)胞自身可能會產(chǎn)生應(yīng)激來抵抗這種作用。已有文獻(xiàn)報道,miR-29過表達(dá)可以抑制NF-κB信號通路的激活[11,18],而ZFP91作為一個抗凋亡基因,其也是NF-κB信號通路的一個重要的調(diào)控元件,ZFP91通過泛素化作用,激活和穩(wěn)定E3泛素連接酶[19]及MAP3K14來激活非經(jīng)典的NF-κB信號途徑,以削減miR-29a過表達(dá)對NF-κB信號通路的抑制作用,它的表達(dá)量增加可以有效對抗miR-29a促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,miR-29a可以促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡,并提示ZFP91與miR-29a及細(xì)胞凋亡有著必然的聯(lián)系,其機(jī)制可能是ZFP91作為一個抗凋亡蛋白激活非經(jīng)典的NF-κB信號通路來抵制miR-29a的促凋亡作用,進(jìn)一步豐富miR-29a促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)理論,為神經(jīng)退行性疾病的防治提供新思路。

        參考文獻(xiàn):

        [1]LAGOS-QUINTANA M,RAUHUT R,LENDECKEL W,et al. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science,2001,294(5543): 853-858.

        [2]XU H,CHEUNG I Y,GUO H F,et al. MicroRNA miR-29 modulates expression of immune based therapy of human solid tumors for immunoinhibitory molecule B7-H3: potential implication[J]. Cancer Res,2009,69(15): 6275-6281.

        [3]CALIN G A,F(xiàn)ERRACIN M,CIMMINO A,et al. A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J]. N Engl J Med,2005,353(17): 1793-1801.

        [4]GARZON R,HEAPHY C E,HAVELANGE V,et al. MicroRNA29b functions in acute myeloid leukemia[J]. Blood,2009,114(26): 5331-5341.

        [5]VAN ROOIJ E,SUTHERLAND L B,THATCHER JVAN ROOIJ E,et al. Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008,105: 13027-13032.

        [6]VERRIER J D,LAU P,HUDSON L,et al. Peripheral myelin protein 22 is regulated post-transcriptionally by miRNA-29a[J]. Glia,2009,57: 1265-1279.

        [7]HéBERT SS,HORRE K,NICOLA? L,et al. Loss of microRNA cluster miR-29a/b-1 insporadic Alzheimer's disease correlates with increased BACE1/β-secretase expression[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008,105: 6415-6420.

        [8]HARIHARAN M,SCARIA V,PILLAI B,et al. Targets for human encoded microRNAs in HIV genes[J]. Biochem Biophys Res Commun,2005,337: 1214-1218.

        [9]AHLUWALIA J K,KHAN S Z,SONI K,et al. Human cellular microRNA hsa-miR-29a interferes with viral nef protein expression and HIV-1 replication[J]. Retrovirology,2008,5: 117.

        [10]NATHANS R S,CHU C Y,SERQUINA A,et al. Cellular microRNA and P bodies modulate host-HIV-1 interactions[J]. Mol Cell,2009,34: 696-709.

        [11]ZHOU Q Q,COSTINEAN S,CROCE C M,et al. MicroRNA 29 targets nuclear factor-κB-repressing factor and claudin 1 to increase intestinal permeability[J]. Gastroenterology,2015,148(1): 158-169.

        [12]FABBRI M,GARZON R,CIMMINO A,et al. MicroRNA-29 family reverts aberrant methylation in lung cancer by targeting DNA methyltransferases 3A and 3B[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007,104: 15805-15810.

        [13]張振輝,黎佼,劉本榮,等.過表達(dá)miR-29a對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].中國動脈硬化雜志,2012,20(12): 1079-1082.

        [14]UNOKI M,OKUTSU J,NAKAMURA Y. Identification of a novel human gene,ZFP91,involved in acute myelogenous leukemia[J]. Int J Oncol,2003,22(6): 1217-1223.

        [15]PASCHKE L,RUCINSKI M,ZIOLKOWSKA A,et al. ZFP91-A newly described gene potentially involved in prostate pathology[J]. Pathol Oncol Res,2014,20(2): 453-459.

        [16]JIN H R,JIN X,LEE J J. Zinc-finger protein 91 plays a key role in LIGHT-induced activation of non-canonical NF-κB pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,400(4): 581-586.

        [17]MEENU S,THIAGARAJAN S,RAMALINGAM S,et al. Modulation of host ubiquitin system genes in human endometrial cell line infected with mycobac-terium tuberculosis[J]. Med Microbiol Immunol,2016,205(2): 163-171. DOI: 10.1007/s00430-015-0432-z.

        [18]ZHANG X Y,DONG C Y,SUN X N,et al. Induction of the cellular miR-29c by influenza virus inhibits the innate immune response through protection of A20 mRNA[J]. Biochem Biophys Res Commun,2014,450(1): 755-761.

        [19]JIN X J,JIN H R,JUNG H S,et al. An atypical E3 ligase zinc finger protein 91 stabilizes and activates NF-kappaB-inducing kinase via Lys63-linked ubiquitination[J]. J Biol Chem,2010,285(40): 30539-30547.

        (申海菊編輯)

        Overexpression of microRNA-29a up-regulates zinc finger protein 91 expression and regulates cell apoptosis in PC12*

        Yong-min Liu1,Ping Duan2,Wen-hai Yan3,F(xiàn)ang He1,Na Tang1,Hua Zhong1
        (1. Department of Pathophysiology,Medical College of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2. Department of Physiology,3. Department of Pathophysiology,College of Basic Medical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450001,China)

        Abstract:Objective To establish a rat adrenal pheochromocytoma cell line(PC12)with highly-infective efficiency and stable overexpression of miR-29a,and to explore the role of miR-29a in apoptosis of PC12. Methods The miR-29a precursors expressing viral vectors(Lvx-miR-29a-eGFP)and control vector(LvxeGFP-control)were packaged to Lentivirus respectively,and PC12 cells were infected by Lentivirus and underwent resistance screening. Flow cytometry(FCM)was used to detect the cell apoptosis,and then real time quantitative PCR(RT-qPCR)and Western blot were used to measure the levels of targets gene mRNA and protein of miR-29a. Results PC12 cell lines with high infection efficiency and stable overexpression of miR-29a were established,the EGFP-positive cell percentage was over 80%in the infected PC12 cells. miR-29aoverexpression significantly increased cell apoptosis rate in PC12 when campared to the eGFP-control group and non-infection group(P<0.01),and significantly up-regulated the mRNA and protein levels of zinc finger protein 91(ZFP91)in the PC12. Conclusions Our study demonstrated overexpression of miR-29a can effectively up-regulate ZFP91 expression and promote apoptosis of PC12. Its mechanism remains to be further elucidated.

        Keywords:microRNA 29a;zinc finger protein 91;cell apoptosis;PC12;RT-qPCR;rat

        中圖分類號:R736.6

        文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

        DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.004

        文章編號:1005-8982(2016)011-0018-06

        收稿日期:2015-12-28

        *基金項目:石河子大學(xué)優(yōu)秀青年科技人才培育計劃(No:2013ZRKXYQ25)

        猜你喜歡
        檢測
        QC 檢測
        “不等式”檢測題
        “一元一次不等式”檢測題
        “一元一次不等式組”檢測題
        “幾何圖形”檢測題
        “角”檢測題
        “有理數(shù)的乘除法”檢測題
        “有理數(shù)”檢測題
        “角”檢測題
        “幾何圖形”檢測題
        美女啪啪国产| 观看在线人视频| 九一九色国产| 人妻丰满多毛熟妇免费区| 夫妻一起自拍内射小视频| 国产一区二区av免费观看| 24小时日本在线视频资源| 正在播放国产对白孕妇作爱| 538亚洲欧美国产日韩在线精品 | 人妖与人妖免费黄色片| 久久人妻av无码中文专区| 久久亚洲精品11p| 国产精品亚洲片夜色在线| 国产三级一区二区三区在线观看 | 亚洲人妻av综合久久| 亚洲 欧美 偷自乱 图片| 99re热视频这里只精品| 无码一区二区三区在线在看| 国产精品国产三级农村妇女| 亚洲av中文无码乱人伦在线视色| 在教室伦流澡到高潮hgl视频| 免费一级国产大片| 久久国产精品免费专区| 无码一区二区三区中文字幕| 精品人体无码一区二区三区| 精品人妻av一区二区三区不卡| 一本色道久在线综合色| 在线观看精品视频网站| 天堂中文资源在线地址| 最新亚洲视频一区二区| 久久国产成人精品av| 国产zzjjzzjj视频全免费| 国产粉嫩高清| 免费播放成人大片视频 | 久久久精品2019免费观看| AV无码专区亚洲AVL在线观看 | 曰韩人妻无码一区二区三区综合部| 在线观看亚洲AV日韩A∨| 免费视频一区二区三区美女| 疯狂做受xxxx高潮视频免费| 99久久久无码国产精品9|