宋玉光　馬宗琪　董　蔚　楊發(fā)斌　楊曉剛　邱念偉

（曲阜師范大學生命科學學院野生動植物保護與利用重點學科實驗室，山東　曲阜　273165）

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春季楊樹葉片發(fā)育過程的研究*

宋玉光馬宗琪董蔚楊發(fā)斌楊曉剛邱念偉**

（曲阜師范大學生命科學學院野生動植物保護與利用重點學科實驗室，山東曲阜273165）

摘要：楊樹葉片發(fā)育從葉片大?。ㄓ萌~面積表示）上看，其生長呈現(xiàn)出典型的“S”形曲線，在5月初葉面積達到最大；新生葉剛展開時葉綠素和類胡蘿卜素就已開始合成，在5月底達到相對穩(wěn)定的最大值；可溶性蛋白在葉片發(fā)育早期便達到成熟葉片水平。楊樹葉片的PSII最大光化學效率、光能吸收和傳遞效率、質(zhì)體醌庫大小和反應中心數(shù)目等在4月底逐步趨于穩(wěn)定，說明此時楊樹葉片光系統(tǒng)已發(fā)育完善。熒光參數(shù)中性能指數(shù)PI在葉片成熟過程中變化最為靈敏，可以作為量化楊樹葉片成熟度的指標。

關鍵詞：楊樹；葉片；發(fā)育；葉綠素熒光

*國家自然科學基金（31300220，31501328）；曲阜師范大學精品實驗及實驗室開放基金（SK201501，Jp2015018，sj201409）資助

楊樹是我國最為著名的速生用材林和綠化樹種，長期以來關于楊樹的研究主要集中在速生品種選育、品質(zhì)與抗性改良、基因資源挖掘等方面［3］，其葉片發(fā)育過程中的生理功能變化鮮有報道。

葉綠素熒光技術是檢測葉片光合功能的快速、靈敏、無損傷的探針，可以靈敏檢測激發(fā)能的傳遞、光系統(tǒng)Ⅱ（PhotosystemⅡ，PSⅡ）原初光化學反應、PSⅡ供體側及受體側的電子傳遞及光合效率等光合信息，為研究楊樹葉片發(fā)育過程中光合功能的變化提供了新方法［1-2］。本文首次利用葉綠素熒光技術對楊樹葉片發(fā)育過程進行了檢測，并結合葉面積、蛋白質(zhì)含量和光合色素含量等生理指標，系統(tǒng)揭示了楊樹葉片的生長發(fā)育規(guī)律。

1材料與方法

1.1試驗材料

植物材料為曲阜師范大學校園內(nèi)（35°36′N，116°58′E，海拔60.5m）生長健壯、樹齡在10年左右的毛白楊（Populus tomentosa）朝陽部分。從4月2日幼葉剛展開時開始收集樣本進行測定，每隔5天取樣1次，截止到5月2日（葉綠素和類胡蘿卜素的測定取樣延長至5月31日，從5月2日以后每10天取樣次）。每早晨8點摘取1年生枝條上的最大葉片，用濕紗布包裹，迅速帶回實驗室測定其葉面積、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和蛋白質(zhì)含量，晚上8點充分暗適應后，活體測定葉綠素熒光參數(shù)。葉片采自同一顆楊樹的下部枝條。

1.2葉面積的測定

楊樹葉片的葉面積用Li-3000A型葉面積儀（美國LI-COR）測定，每次采樣測定5個重復。

1.3葉綠素、類胡蘿卜素含量測定

取樣后，用打孔器打取3個葉圓片，切成0.1mm寬的細絲，用80％丙酮浸泡提取葉綠素和類胡蘿卜素，具體測定步驟參照張秀君等2011年的方法［3］。

1.4葉綠素快相熒光動力學參數(shù)的測定與解析

晚上楊樹葉片充分暗適應后，用植物效率分析儀（Handy PEA；Hansatech Instrument Ltd.，UK）活體測定不同時期葉片的葉綠素熒光動力學參數(shù)。測定光源的波長為650nm，光照強度為3000μmol·m-2·s-1，光束聚集在直徑為4mm2的葉片夾測試孔上，熒光信號的記錄時程為1s，每個時期的葉片測定10個重復。利用專業(yè)軟件可解析出以下熒光參數(shù)：標準化面積（Sm=Area/Fv），該參數(shù)與質(zhì)體醌庫的大小成正比；PSII最大光化學效率（Fv/Fm）；單位激發(fā)態(tài)面積被反應中心捕獲的能量（TRo/CSo）；單位激發(fā)態(tài)面積吸收的能量（ABS/CSo）；單位激發(fā)態(tài)面積的反應中心密度（RC/CSo）；單位激發(fā)態(tài)面積用于電子傳遞的能量比例（ETo/CSo）；單位激發(fā)態(tài)面積以熱能形式耗散的能量比例（DIo/CSo）；葉片的綜合性能指數(shù)（PI）。

1.5可溶性蛋白含量測定

葉片可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G250染色法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白，每個時期的樣品做5個重復，具體步驟參照邱念偉等2013年的方法［4］。

2結果與分析

2.1楊樹葉片發(fā)育過程中葉面積的變化

4月份楊樹葉片生長較快，葉面積的變化規(guī)律呈典型的“S”型，即早期（4月2日前后）生長較慢；隨后進入對數(shù)生長期（4月7日～4月22日），葉面積成倍增大；最后階段（4月27日～5月2日）葉面積達到最大值并趨于穩(wěn)定（圖1）。從每5天葉面積增大倍數(shù)上看，4月2日～12日的增大倍數(shù)最大，分別增大了2.53倍和2.41倍，之后依次為1.86、1.57、1.06和1.01倍，4月22日后葉面積趨于穩(wěn)定，楊樹葉片葉面積的增大大約只需要3周（4月2日至4月22日）。

圖1　楊樹葉片發(fā)育過程中葉面積的變化規(guī)律

2.2楊樹葉片發(fā)育過程中光合色素含量的變化

植物的光合色素主要有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，通過測定整個葉片發(fā)育過程中兩種色素的含量發(fā)現(xiàn)，楊樹葉片在4月2日剛展開時已合成了少量葉綠素和類胡蘿卜素，隨后兩者的含量均逐漸增高，到5月底時均達到最高值，并仍有微弱的增大趨勢（圖2）。從兩者的整體增長速率來看，葉綠素的增長速率遠遠高于類胡蘿卜素，在葉片發(fā)育早期（4月2日至4月17日），葉綠素和類胡蘿卜素的增長速率相似，但從4月17日開始，葉綠素的增長速率則明顯快于類胡蘿卜素，5月22日以后兩者的增長速率明顯變緩（圖2）。從葉綠素和類胡蘿卜素的含量上分析，無論初始含量還是最終含量，葉綠素均明顯高于類胡蘿卜素，為類胡蘿卜素的1.5～3.8倍；隨著葉片成熟，二者的比例逐漸增大，如葉片剛展開時葉綠素含量約為1.31mg/dm2，而類胡蘿卜素含量約為0.82mg/dm2；葉片發(fā)育成熟以后葉綠素含量達到8.34mg/dm2，而類胡蘿卜素含量僅為2.25mg/dm2。

圖2　春季楊樹葉片光合色素含量的變化規(guī)律

2.3楊樹葉片發(fā)育過程中可溶性蛋白的變化

可溶性蛋白質(zhì)含量是反映葉片活力的常用生化參數(shù)。通過測定楊樹葉片中可溶性蛋白含量發(fā)現(xiàn)，在楊樹葉片發(fā)育過程的前期階段（4月2日～12日），其可溶性蛋白含量快速增多，從最初的2.96mg/gFW增加到4.14mg/gFW。隨后其含量緩慢增大，并很快趨于穩(wěn)定，最終增大至約4.3mg/gFW（圖3）。表明在葉片發(fā)育過程中需要大量蛋白質(zhì)的參與，在葉片發(fā)育早期就需要大量合成蛋白質(zhì)。

圖3　春季楊樹葉片可溶性蛋白含量的變化規(guī)律

2.4楊樹葉片發(fā)育過程中光合功能的變化

葉綠素熒光技術不僅能夠測定葉片的光合活力，也能探測葉片光合結構和光合效率的變化，是研究葉片功能的高新技術。由表1可知，楊樹葉片的最大光化學效率（Fv/Fm）在葉片展開后便快速增大，在4月17日時已經(jīng)接近成熟葉片（所有高等植物的成熟健康葉片的Fv/Fm值均在0.830左右），說明此時PSII的結構已經(jīng)比較完善，葉片質(zhì)體醌庫的大小（Sm）隨著葉片的發(fā)育也呈逐漸增大趨勢，說明楊樹葉片的電子傳遞能力在逐漸增強；單位激發(fā)態(tài)面積的光能吸收和利用效率參數(shù)（ABS/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo）結果顯示，從4月12日開始楊樹葉片的光合效率逐漸趨于穩(wěn)定；單位激發(fā)態(tài)橫切面的熱能耗散比例（DIo/CSo）隨葉片的成熟稍有波動，但從4月7日開始便趨于相對穩(wěn)定；葉片的綜合性能指數(shù)（PI）是楊樹葉片發(fā)育過程中變化最為敏感的，隨著葉片的發(fā)育成熟呈逐漸增大趨勢，在5月2日時達到最大值，說明此時楊樹葉片的光合系統(tǒng)已基本完善。

表1　春季楊樹葉片光合功能變化規(guī)律

3討論

3.1楊樹春季葉片的發(fā)育是其后續(xù)一切發(fā)育的基礎，從其葉面積的測量數(shù)據(jù)來看，楊樹萌發(fā)的幼葉發(fā)育為成熟葉片僅需3周的時間，發(fā)育過程中葉面積的變化呈現(xiàn)出典型的“S”形曲線，這與我們前期測量的楊樹葉片發(fā)育模式一致［10］。楊樹葉片剛剛從葉芽萌發(fā)時（4月2日的葉片），其葉面積僅為成熟葉片的4.8％，但其葉綠素、類胡蘿卜素以及質(zhì)體醌庫大小已經(jīng)分別達到成熟葉片的15.6％、36.4％和43.0％，說明此時已經(jīng)具備了一定的光合能力，另外在葉片發(fā)育最初的5天內(nèi)（4月2日～7日），其光能吸收和利用效率的相關參數(shù)（ABS/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo）均快速增長并達到接近成熟葉片的水平，表明在葉片發(fā)育初期，其主要任務是盡快的建立成熟的光合系統(tǒng)，進行光合作用，為葉片后續(xù)的發(fā)育提供物質(zhì)和能量，這與其他物種葉片的發(fā)育模式是一致的［5］。在各個葉綠素熒光參數(shù)中，單位激發(fā)態(tài)面積以熱能形式耗散的能量比例（DIo/CSo）的變化比較特殊，在葉片發(fā)育前期其數(shù)值相對較低，而發(fā)育后期則逐漸升高，而后又稍有下降。推測這是由于葉片發(fā)育早期其吸收的光能較少，因此熱耗散較少；而前半期光合系統(tǒng)還未完全成熟，吸收光能中用于光合作用的比例較低，以熱能形式耗散的比例較大［6］；后期葉片光合功能完善，光合效率升高，熱耗散反而又有所下降。4月22日時，楊樹葉片的PSII最大光化學效率（Fv/Fm）已接近成熟葉片的正常值，此時PSII的結構已完整構建，且PSII反應中心的數(shù)量已經(jīng)達到成熟葉片的95.7％，此時光合效率顯著提高，DIo/CSo迅速下降。熒光參數(shù)中葉片綜合性能指數(shù)（PI）變化最為靈敏，4月7日至5月2日的PI值分別為4月2日的1.32、1.56、1.88、1.96、2.00、2.10倍，已有文獻證明PI與植物的光合速率呈正比［7］，因此可用PI來量化楊樹葉片的發(fā)育成熟程度。

3.2在4月22日時，楊樹的葉面積便接近成熟葉片，但其葉綠素含量僅為成熟葉片的50％，其葉片擴展速度遠快于葉綠素、類胡蘿卜素的增長速度。由于植物體內(nèi)葉綠素、類胡蘿卜素的合成受到了溫度和光照強度的嚴格調(diào)控，且兩種色素的合成非常復雜，整個生物合成過程需要十幾步反應以及幾十種酶的參與才能完成［8］，所以隨著光照強度和溫度的升高，葉片內(nèi)的葉綠素和類胡蘿卜素的合成才逐漸達到最高水平。

3.3葉片可溶性蛋白含量測定結果顯示，在楊樹葉片剛剛露出葉芽時其內(nèi)部的可溶性蛋白含量就比較高，說明楊樹嫩葉代謝比較旺盛。隨著葉片的繼續(xù)發(fā)育，在15天后便接近成熟葉片的含量。由于可溶性蛋白還是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗逆保護物質(zhì)，其含量的快速增大和積累能提高細胞的保水能力和抗冷能力，是植物抗寒性的重要指標之一［9-10］。因此推測在葉片發(fā)育早期，由于氣溫還普遍偏低，楊樹葉片中可溶性蛋白的快速積累除了為促進幼葉的代謝活動外，還具有保護葉片不會受到冷凍傷害的功能。

參考文獻

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（責任編輯：張亞楠）

Study on the Development Process of Populus tomentosa Leaf in Spring

SONGYuguang
（College of Life Science，Qufu Normal University，Shandong Qufu 115200）

AbstractPopulus tomentosa is the species which are widely distribute d，adaptable and often used as fast growing timber and urban afforestation.To acquire more information about Populus tomentosa's growth rule，the development process of its leaves were observed systematically.Looking from the size of leaf（expressed in leaf area），the growth curve of Populus tomentosa leaf clearly show a“S”shape，and leaf area reached a maximum size in early May.At last reached the relatively stable maximum content at the end of May.The accumulation of soluble protein in young leaves was very fast，then quickly reached the content of mature leaves.Performance index of plants（PI）is the most sensitive parameter among all the fluorescence parameters，which can be used to quantize photosynthetic function of Populus tomentosa leaf during the development process.

Key wordsPopulus tomentosa；Leaf；Development；Photosynthesis

中圖分類號：S792.11，S718.3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9499（2016）03-0020-04

作者簡介：第1宋玉光（1983-），男，講師，研究方向：表觀遺傳與植物的逆境脅迫響應。

收稿日期：2016-02-11