項(xiàng)振飛，方建晨，林麗，陸妙珍，許權(quán)

（1.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院　放療科，浙江　寧波　315040；2.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院　病理科，浙江　寧波　315040；3.寧波市鄞州區(qū)人民醫(yī)院 血液科，浙江　寧波　315040）

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鼻咽癌組織中XIAP的表達(dá)與放療預(yù)后的相關(guān)性

項(xiàng)振飛1，方建晨2，林麗3，陸妙珍1，許權(quán)1

（1.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院放療科，浙江寧波315040；2.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院病理科，浙江寧波315040；3.寧波市鄞州區(qū)人民醫(yī)院 血液科，浙江寧波315040）

［摘 要］目的：觀察放療后鼻咽癌（NPC）組織中X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（XIAP）的表達(dá)，評(píng)估XIAP 在NPC患者放療預(yù)后的診斷價(jià)值。方法：回顧性分析2010年1月至2012年12月收治的94例NPC患者的臨床及病理資料，所有患者均接受放療。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)患者鼻咽部病理標(biāo)本中XIAP蛋白表達(dá)，臨床隨訪并分析其與放療預(yù)后關(guān)系。結(jié)果：XIAP在NPC組織中總的陽(yáng)性表達(dá)率為69.15%（65/94）。XIAP陽(yáng)性表達(dá)率與p-TNM分期和腫瘤分化呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）。單因素生存分析表明，XIAP高表達(dá)、高p-TNM分期以及腫瘤低分化程度均與NPC患者存活率下降明顯相關(guān)（均P＜0.05）。多因素Cox回歸分析顯示XIAP表達(dá)、p-TNM分期以及腫瘤分化程度是影響NPC患者放療生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論：XIAP在放療的NPC組織中高表達(dá)，XIAP表達(dá)、p-TNM分期以及腫瘤分化程度是影響NPC患者放療生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

［關(guān)鍵詞］X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白；鼻咽癌；放療；蛋白表達(dá)；預(yù)后；免疫組織化學(xué)

鼻咽癌（nasopharyngeal cancer，NPC）是一種發(fā)生在頭頸區(qū)域的癌癥，主要位于鼻咽表面的鱗片狀表皮細(xì)胞，以及咽腔部分的細(xì)胞組織［1］。NPC在中國(guó)的發(fā)病率和死亡率分別為3.16/10萬(wàn)和1.53/10萬(wàn)［2］。因疾病早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，且病變位置隱蔽，早期腫瘤較難發(fā)現(xiàn)，NPC患者的5年生存率僅有47.96%［3］。對(duì)于NPC的治療，傳統(tǒng)的放療治療法是較為常見(jiàn)的。然而放療也容易產(chǎn)生不良反應(yīng)，需要對(duì)其放射強(qiáng)度等細(xì)節(jié)進(jìn)行控制才能達(dá)到較好的腫瘤治療效果［4］。因此，確定一些與NPC相關(guān)的因子作為判斷NPC放療預(yù)后效果的診斷指標(biāo)，將能夠更主動(dòng)且有效地治療NPC。

近年來(lái)，有研究報(bào)道［5-7］顯示，下調(diào)X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apop-tosis protein，XIAP）表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，XIAP與癌細(xì)胞的增殖情況具有相關(guān)性，推測(cè)XIAP可能可以作為評(píng)估NPC患者放療預(yù)后的效果的重要診斷依據(jù)［8］。然而，到目前為止，并沒(méi)有直接證據(jù)證明此觀點(diǎn)，因此，本研究通過(guò)檢測(cè)NPC患者γ射線照射后XIAP的表達(dá)水平，來(lái)探討XIAP與NPC臨床病理特征關(guān)系以及療效評(píng)價(jià)中的作用，以期為臨床決策及預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。

1　資料和方法

1.1一般資料 研究對(duì)象為寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院2010年1月至2012年12月接受放射治療的NPC患者94例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織學(xué)確診為局部晚期NPC，病理類型均為非分化型非角化性NPC，并可獲取病理組織標(biāo)本進(jìn)行XIAP表達(dá)檢測(cè)；②活檢前均未進(jìn)行放化療；③體能狀態(tài)評(píng)分（ECOG PS）≤1分，預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月；④至少有1個(gè)可經(jīng)CT或MRI測(cè)量的腫瘤病灶；⑤無(wú)明顯的主要器官功能損害；⑥無(wú)其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療前即有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②合并嚴(yán)重內(nèi)科疾??；③雙重癌；④曾接受放化療。NPC分期按UICC（2003年）和AJCC聯(lián)合制定的TNM分期分類進(jìn)行［9］；NPC腫瘤病理分類參考WHO（1991年）的腫瘤組織學(xué)分類法［10］進(jìn)行。

1.2放療方法 所有患者均采用模擬定位機(jī)定位，面罩固定頭頸肩部，均進(jìn)行常規(guī)分割劑量的放療，每次2 Gy，每周5次。第1段采用面頸聯(lián)合左右對(duì)穿野和下頸前切線野，照射DT 36 Gy；第2段避脊髓，照射DT 50 Gy；第3段避腦干，照射DT 66 Gy；第4段照射至根治量，鼻咽部劑量70～76 Gy，陽(yáng)性淋巴結(jié)劑量66 Gy，復(fù)查有殘留再加量至70 Gy。

1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) 兔抗人多克隆抗體XIAP IgG由美國(guó)Upstake公司生產(chǎn)。采用EnVision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，EnVisionTM檢測(cè)試劑盒由丹麥DAKO公司生產(chǎn)。石蠟標(biāo)本先做成3 μm厚的組織切片，常規(guī)脫蠟水化。滴加過(guò)氧化物酶阻斷液，室溫下孵育10 min。蒸餾水漂洗，置于PBS中10 min。組織抗原微波修復(fù)。滴加非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min。滴加X(jué)IAP一抗（工作濃度為1︰200），濕盒中37 ℃孵育60 min，PBS漂洗10 min。EnVisionTM孵育10 min，PBS漂洗10 min。色源底物溶液孵育10 min，蒸餾水漂洗。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用±s表示并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。2組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以Fisher’s精確檢驗(yàn)。對(duì)可能影響預(yù)后的因素進(jìn)行Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)，并通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型將NPC患者的臨床病理因素納入進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1XIAP在NPC組織的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性 XIAP染色陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒彌漫分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。XIAP在NPC組織中總的陽(yáng)性表達(dá)率為69.15%（65/94）。Spearman相關(guān)性分析提示XIAP陽(yáng)性表達(dá)率與p-TNM分期和腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.235，r=-0.337；均P＜0.05），而與性別、年齡、雙側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、T-分期和N-分期無(wú)明顯相關(guān)性（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2NPC患者放療預(yù)后及其影響因素的單因素與多樹(shù)膠封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 在光學(xué)顯微鏡下觀察，XIAP在NPC組織中免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，結(jié)果評(píng)分用雙盲法，在高倍鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)癌細(xì)胞，結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分率及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度2個(gè)方面計(jì)算XIAP免疫組織化學(xué)染色評(píng)分：①陽(yáng)性細(xì)胞百分率：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分；陽(yáng)性細(xì)胞0%～24%為1分；陽(yáng)性細(xì)胞25%～49%為2分；陽(yáng)性細(xì)胞50%～74%為3分；陽(yáng)性細(xì)胞75%～100%為4分。②陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱：無(wú)色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。2項(xiàng)的乘積為該患者的免疫組織化學(xué)評(píng)分：乘積0～1分為陰性（-）；乘積≥2分為陽(yáng)性，2～4分為弱陽(yáng)性（+），5～7分為中等陽(yáng)性（++），≥8～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5隨訪 采用門診記錄、電話隨訪或信訪的方法進(jìn)行隨診，每3個(gè)月復(fù)查1次，復(fù)查內(nèi)容包括間接或直接鼻咽鏡、鼻咽和上頸CT或MRI檢查，以及胸片、B超、全身骨掃描等。取得有效數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)NPC放療預(yù)后的價(jià)值?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為從放療開(kāi)始至死亡或最后隨訪的時(shí)間，隨訪截止時(shí)間為2015年1月，隨訪時(shí)間5～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為45個(gè)月，失訪3人，隨訪率為96.81%。死亡40例，病死率為43.96%。存活51例，生存率為56.04%。因素生存分析 Kaplan-Meier分析計(jì)算臨床病理特征和XIAP表達(dá)對(duì)NPC患者生存情況的影響，見(jiàn)表2和圖2。單因素生存分析表明，XIAP高表達(dá)、高p-TNM分期以及腫瘤低分化程度均與NPC患者存活率下降明顯相關(guān)（均P＜0.05），而其他臨床病理變量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。多因素Cox回歸分析顯示XIAP表達(dá)、p-TNM分期以及腫瘤分化程度是影響NPC患者放療生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖1　XIAP在NPC組織中的免疫組織化學(xué)特征

表1　XIAP表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

表2　NPC患者放療預(yù)后及其影響因素的單因素分析（±s）

表2　NPC患者放療預(yù)后及其影響因素的單因素分析（±s）

變量　n　OS　P XIAP低表達(dá)　29　54.75±2.12?。?.003高表達(dá)　65　40.10±2.75性別男61　45.62±2.64?。?.247 女33　42.79±3.58年齡（歲）＜60　56　45.74±2.67?。?.817 ≥60　38　42.93±3.49雙側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0+單側(cè)轉(zhuǎn)移　61　48.60±2.35?。?.082雙側(cè)轉(zhuǎn)移　33　37.17±3.92腫瘤大小（cm）＜5　49　48.22±2.64?。?.182 ≥5　45　40.73±3.29 T-分期T3　55　43.44±257　＜0.307 T1-2　39　47.28±3.75 N-分期N0　37　48.86±3.25?。?.054 N1　57　41.87±2.74 p-TNM分期I-II　39　54.21±2.20　＜0.001 III　55　37.77±2.96腫瘤分化程度良好/中等　36　50.79±2.95?。?.022 低58　40.64±2.13

圖2　Kaplan-Meier生存分析

3　討論

目前研究表明XIAP具有較強(qiáng)的抑制凋亡能力，特別在癌細(xì)胞中高表達(dá)，其可能是癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要原因之一［11-13］。本研究通過(guò)觀察NPC患者放療后XIAP的蛋白表達(dá)水平變化，旨在探討XIAP與鼻咽癌臨床病理特征關(guān)系以及放療療效評(píng)價(jià)中的作用。

表3　NPC患者放療預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

本研究結(jié)果顯示，XIAP在放療的NPC組織中高表達(dá)，在NPC組織中總的陽(yáng)性表達(dá)率為69.15%，且XIAP的陽(yáng)性表達(dá)率與NPC患者的p-TNM分期和腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)。此外，單因素生存分析表明，XIAP高表達(dá)、高p-TNM分期以及腫瘤低分化程度與NPC患者存活率下降明顯相關(guān)，且多因素Cox回歸分析結(jié)果表明XIAP表達(dá)、p-TNM分期以及腫瘤分化程度是影響NPC患者放療生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。作為抗凋亡蛋白家族的重要成員，XIAP通過(guò)抑制Caspases酶原的激活以及成熟Caspases的催化活性，從而抑制細(xì)胞的凋亡［14-15］。研究［16］表明，在癌細(xì)胞接受放射治療后，XIAP的表達(dá)量都有較為明顯的增加，與本研究結(jié)果相一致。我們推測(cè)可能是由于細(xì)胞內(nèi)的XAF1（XIAP associated factor 1）以及DIABLO （direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pl）的表達(dá)量減少所導(dǎo)致的［17-18］。此外，XAF1及DIABLO均可對(duì)XIAP的表達(dá)及其功能產(chǎn)生抑制作用，是調(diào)節(jié)細(xì)胞正常凋亡代謝的重要因子［19-20］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變的情況下，XAF1及DIABLO的表達(dá)量都會(huì)相應(yīng)的減少［11，21］，其主要原因可能是癌變影響了這些因子的轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程。其中，XAF1在腫瘤細(xì)胞中，常因?yàn)槠鋯?dòng)子區(qū)域甲基化導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄水平的減少［19，21］。XIAP的表達(dá)水平增加，會(huì)抑制癌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致NPC的發(fā)生發(fā)展。此外，有研究［20］表明XIAP能夠通過(guò)促進(jìn)NF-kB的表達(dá)而增強(qiáng)炎癥因子的產(chǎn)生，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖以及侵襲等過(guò)程，從而影響患者預(yù)后。同時(shí)，XIAP的表達(dá)量往往與高p-TNM分期與腫瘤低分化程度成負(fù)相關(guān)。因而，XIAP高表達(dá)可能與NPC患者的預(yù)后相關(guān)。對(duì)此，XIAP的蛋白表達(dá)水平是影響NPC患者預(yù)后的重要因素，對(duì)患者的預(yù)后判斷有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，XIAP在放療的NPC組織中高表達(dá)，且XIAP的蛋白表達(dá)水平與NPC患者的p-TNM分期和腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，表明XIAP的高表達(dá)與NPC患者放療預(yù)后相關(guān)。同時(shí)，XIAP表達(dá)、p-TNM分期以及腫瘤分化程度是影響NPC患者放療生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

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（本文編輯：吳昔昔）

Relationship between XIAP expression and radiotherapy prognosis in nasopharyngeal carcinoma

XIANG Zhenfei1， FANG Jianchen2， LIN Li3， LU Miaozhen1， XU Quan1. 1.Department of Radiotherapy，Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital， Ningbo， 315040； 2.Department of Pathology， Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital， Ningbo， 315040； 3.Department of Hematology， Ningbo Yinzhou People’s Hospital， Ningbo， 315040

Abstract：Objective： To investigate the relationship between X-linked inhibitor of apoptosis protein （XIAP） expression and prognosis of patients with nasopharyngeal cancer （NPC） that received radiotherapy. Methods： A retrospective analysis was performed with the data of 94 NPC patients from January 2010 to December 2012. The expression of XIAP in NPC tissues was detected with immunohistochemistry （IHC）， and analyzed the prognosis relevance after radiotherapy. Results： The overall XIAP positive expression rate in NPC tissues was 69.15% （65/94） and the XIAP positive expression rate was negatively correlated with the p-TNM staging and the tumor differentiation （all P＜0.05）. Kaplan-Meier analysis showed that the high XIAP expression， high p-TNM staging and poorly differentiated were signifi cantly correlated with decreased survival rate of NPC patients （all P＜0.05）. Multivariate Cox regression analysis showed that XIAP expression， p-TNM staging and degrees of differentiation were independent risk factors for the survival of NPC patients after radiotherapy. Conclusion： The high XIAP expression， p-TNM staging and degree of differentiation are independent risk factors for the survival of NPC patients after radiotherapy.

Key words：X-linked inhibitor of apoptosis protein； nasopharyngeal cancer； radiotherapy； protein expression；prognosis； immunohistochemistry

［中圖分類號(hào)］R762

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.007

收稿日期：2015-11-20

作者簡(jiǎn)介：項(xiàng)振飛（1981-），男，浙江寧波人，主治醫(yī)師。