季慧娟，陳陶，江明華，王大文，王怡君，胡云良

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江　溫州　325027，1.檢驗(yàn)科；2.泌尿外科）

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凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)C＞T多態(tài)性與腎結(jié)石的相關(guān)性

季慧娟1，陳陶1，江明華1，王大文2，王怡君2，胡云良1

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江溫州325027，1.檢驗(yàn)科；2.泌尿外科）

［摘 要］目的：探討凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)C＞T多態(tài)性與浙南地區(qū)人群腎結(jié)石的相關(guān)性。方法：采用PCR-RFLP和測序技術(shù)分析102例腎結(jié)石患者（病例組）和年齡相匹配的95例健康人群（對照組）凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)，比較此位點(diǎn)2組間基因型頻率和等位基因頻率差異。結(jié)果：凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)CC、CT和TT基因型頻率在病例組為13.7%、50.9%和35.4%，對照組為24.2%、51.6%和24.2%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028）；等位基因C、T頻率在病例組和對照組分別為39.2%、60.8%和50.0%、50.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031）。結(jié)論：凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)多態(tài)性與浙南地區(qū)人群患腎結(jié)石具有關(guān)聯(lián)性，rs5896位點(diǎn)C＞T變異可能是腎結(jié)石的易感因素。

［關(guān)鍵詞］多態(tài)性；凝血酶原基因；腎結(jié)石

我國泌尿系結(jié)石發(fā)病率為1%～5%，復(fù)發(fā)率高達(dá)50%左右，發(fā)病率存在地區(qū)差異［1］。腎結(jié)石成因復(fù)雜，往往包含多種致病因素，主要由感染性因素、代謝性因素、遺傳性因素等造成。本研究通過分析浙南地區(qū)人群凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)多態(tài)性與腎結(jié)石的相關(guān)性，來了解凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)多態(tài)性是否對浙南地區(qū)人群腎結(jié)石的發(fā)病率有影響。

1　材料和方法

1.1一般資料 依據(jù)《歐洲泌尿外科學(xué)會(huì)2006年泌尿系結(jié)石診治指南》，收集2014年9月至2015年8月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院入院的腎結(jié)石病例102例。其中男55例，女47例，年齡18～80歲，平均（53.50±13.73）歲。選擇年齡、性別相匹配的健康體檢者95例作為對照組，其中男51例，女44例，年齡18～86歲，平均（59.19±17.41）歲。

1.2基因組DNA提取 收集以乙二胺四乙酸鉀（EDTA-K2）抗凝的血液2 mL，-20 ℃保存。采用人類基因組DNA提取試劑盒（RelaxGene Blood DNA System，TIANGEN）提取全血基因組DNA（嚴(yán)格按說明書操作），-20 ℃留存。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GeneBank NG_008953序列，采用Primer Premier 5.0分析軟件設(shè)計(jì)rs5896位點(diǎn)引物，上游引物（5’-3’）：CTCAGGGCCTTGGCCTG TGCGC，下游引物（5’-3’）：CTTGTGAGACAGCGAGGACG CC，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.4聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增及基因型檢測 體系總體積為30 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，10×loading buffer 3 μL，dNTP 2 μL，taq 酶0.2 μL（購自Takara公司），ddH2O 21.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增出大小為550 bp的DNA目的片段。然后采用特異性限制性內(nèi)切酶Ncol（Fermentas，ER0571）依據(jù)說明書反應(yīng)條件進(jìn)行酶切：ddH2O 7 μL，10×buffer tango 2 μL，DNA（0.5～1 μg）10 μL，Ncol 0.5 μL，取酶切后產(chǎn)物6 μL經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測序，所用測序儀器為ABIPRISM3720。

1.5氨基酸序列同源分析 使用ClustalW軟件（http︰//www.ebi.ac.uk/clustalw/）對來源于NCBI數(shù)據(jù)庫的蛋白序列進(jìn)行同源比對。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 各基因型、基因頻率在病例組和對照組人群分布差異采用chi-square檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1電泳圖 含凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)經(jīng)上述引物擴(kuò)增的目的片段為550 bp，利用Ncol酶對該片段的限制性酶切位點(diǎn)的識(shí)別不同，550 bp大小的目的片段可被切割成不同的小片段（見圖1）。

2.2測序圖譜 凝血酶原rs5896位點(diǎn)的多態(tài)性可表示為CC、CT和TT基因型（見圖2）。

2.3Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)各基因型（CC、CT和TT）分布符合Hardy-Weinberg定律（P＞0.05）（見表1），標(biāo)本具有群體代表性。

2.4基因型和等位基因頻率比較 凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)CC、CT、TT基因型頻率在病例組和對照組分別為13.7%、50.9%、35.4%和24.2%、51.6%、 24.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028）（見表2）；等位基因C頻率在病例組為39.2%，等位基因T在病例組分布頻率為60.8%，與對照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031）（見表3）。病例組TT基因型易感性O(shè)R值是對照組CC基因型的2.57倍（P=0.027，95%CI：1.104～5.990）。

圖1　凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)的PCR-RFLP電泳分析結(jié)果

圖2　凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)測序結(jié)果

表1　凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)基因型遺傳平衡性檢驗(yàn)

表2　不同組別間rs5896位點(diǎn)多態(tài)性基因型的比較?。踤（%）］

表3　不同組別rs5896位點(diǎn)的C、T等位基因頻率的比較（%）

圖3　凝血酶原165位氨基酸序列的保守性分析

2.5保守性分析結(jié)果 蛋白序列同源比對發(fā)現(xiàn)，凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)所編碼的氨基酸，在其他幾種維生素K依賴的凝血因子蛋白中高度保守；同時(shí)在不同物種間凝血酶原也具備高度的保守性（見圖3）。

3　討論

腎結(jié)石具有區(qū)域流行性的特征，是南方人群中常見的疾病，不僅給患者帶來痛苦，也給社會(huì)醫(yī)療增加了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腎結(jié)石是由遺傳易感性和環(huán)境因素共同作用的疾病。有文獻(xiàn)報(bào)道，骨橋素蛋白、維生素D受體、鈣敏感受體等基因異常都與結(jié)石具有一定關(guān)聯(lián)性。雖然臨床利用B超引導(dǎo)方式治療腎結(jié)石方法較為成熟［2］，但能盡早預(yù)防腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展和腎結(jié)石的再次復(fù)發(fā)更有利于減輕患者的痛苦。目前腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制仍未明，而具體的致病機(jī)制有待于進(jìn)一步研究［3］。大多數(shù)泌尿系結(jié)石與鈣鹽代謝相關(guān)［4］，據(jù)報(bào)道凝血酶原結(jié)構(gòu)異常與含鈣結(jié)石具有一定的相關(guān)性［5］，影響腎結(jié)石的成核、聚集和結(jié)晶的形成。凝血酶原主要由肝臟細(xì)胞合成和分泌，近年來在腎臟中也有表達(dá)。凝血酶原相對分子質(zhì)量（MW）為71 600，糖含量為8.2%，是由579個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈糖蛋白，分4個(gè)功能域區(qū)：1個(gè)γ羧基谷氨酸區(qū)（Gla）、2個(gè)環(huán)狀區(qū)（K1、K2）和1個(gè)催化區(qū)，其編碼基因定位于11p11-q12，由14個(gè)外顯子與13個(gè)內(nèi)含子組成，長約21 kb，其mRNA總長度約為2.1 kb。2個(gè)環(huán)狀功能區(qū)域由外顯子4～7編碼，K1、K2各含有約80個(gè)氨基酸，兩者均借助于二硫鍵分別形成三環(huán)狀結(jié)構(gòu)。凝血酶原經(jīng)過內(nèi)或外源凝血途徑激活，釋放出凝血酶原分子氨基末端的片段1+2（含分子的Gla區(qū)和2個(gè)K區(qū)）。尿凝血酶原片段1（urinary prothrombin fragment 1，UPTF1）是人類凝血酶原激活后的裂解片段，分子量31 kD，屬糖蛋白，可作為草酸鈣結(jié)石的抑制蛋白［6］；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)在該蛋白近N-終末端含Gla殘基，是該蛋白的鈣離子結(jié)合部位，在人體未稀釋的尿液中或無機(jī)環(huán)境下，它是含鈣結(jié)石晶體發(fā)生發(fā)展的抑制蛋白［7］。

凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)位于編碼區(qū)的第6外顯子，相應(yīng)編碼的氨基酸在凝血酶原K1區(qū)內(nèi)，而K1區(qū)被認(rèn)為在機(jī)體凝血過程中參與凝血酶（原）與其底物及輔因子的相互作用中扮演重要的角色［8-9］。通過蛋白序列進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)編碼的165位氨基酸在其他幾種維生素K依賴的凝血酶原中高度保守；同時(shí)在不同物種間凝血酶原該位點(diǎn)同樣具備高度的保守性，推測該165位的氨基酸殘基與凝血酶原功能的特異性密切相關(guān)（見圖3）。凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)上C＞T的基因突變可導(dǎo)致UPTF1片段165位氨基酸由極性不帶電荷的蘇氨酸被非極性的甲硫氨酸替代，由于165位的甲硫氨酸不能與180位的谷氨酸形成正常情況下的氫鍵，可引起蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象改變［10］。進(jìn)而也影響著UPTF1片段的糖基化及唾液酸化，UPTF1的糖基化可控制草酸鈣晶體的成核和聚集而唾液酸化在抑制草酸鈣結(jié)石晶體的形成過程中起關(guān)鍵作用［11-12］。

我們通過對浙南地區(qū)102例腎結(jié)石患者和95例健康人群凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，病例組TT基因型易感性是對照組CC基因型的2.57倍（P=0.027，95%CI：1.104～5.990），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。等位基因C頻率在病例組低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果提示，凝血酶原基因rs5896位點(diǎn)的C等位基因編碼的蘇氨酸可能是腎結(jié)石的保護(hù)基因，該位點(diǎn)的C＞T變異導(dǎo)致的165位的蘇氨酸被甲硫氨基酸替代，可減少UPTF1的糖基化和唾液酸化，從而影響UPTF1對草酸鈣晶體形成的抑制活性。然而關(guān)于UPTF1致使腎結(jié)石形成的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。由于本研究樣本量較少可能會(huì)帶來誤差，需要今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來研究驗(yàn)證。

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（本文編輯：吳昔昔）

Correlation between prothrombin gene polymorphism of rs5896 C＞T and kidney stone

JI Huijuan1，CHEN Tao1， JIANG Minghua1， WANG Dawen2， WANG Yijun2， HU Yunliang1. 1.Department of Clinical Laboratory， the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Department of Urinary Surgery， the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Abstract：Objective： To investigate the correlation between prothrombin rs5896 C＞T genetic polymorphism and kidney stone in the southern population of Zhejiang. Methods： Prothrombin gene polymorphism rs5896 was investigated in 102 patients with renal stone formation and 95 age-matched healthy volunteers without history of renal stone formation， using polymerase chain reaction-restriction fragment polymorphism （PCR-RFLP） and sequencing. The frequences of genetype and allele gene in the case and control were analyzed. Results： The frequencies of CC， CT， TT were 13.7%， 50.9%， 35.4% and 24.2%， 51.6%， 24.2% in kidney stone patients and healthy controls respectively. The difference between case and control was slight signifi cance （P=0.028）. The frequencies of C and T were 39.2%， 60.8% and 50.0%， 50.0% in kidney stone patients and heathy control. There was a different signifi cance （P=0.031）. Conclusion： It suggests that the rs5896 polymorphism of prothrombin gene is associated with the kidney stone in the southern population of Zhejiang， and it is possible that rs5896 C＞T acts as a risk factor for the development of renal stone disease.

Key words：polymorphism； prothrombin gene； kidney stone

［中圖分類號］R394.3

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.002

收稿日期：2015-10-26

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（2012 3321120002）；浙江省教育廳科研基金資助項(xiàng)目（Y201223619）。

作者簡介：季慧娟（1989-），女，江西撫州人，碩士生。

通信作者：胡云良，教授，Email：hyl@wmu.edu.cn。