秦　波, 潤　丹， 徐衛(wèi)華

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科， 貴州 貴陽　550004)

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大鼠下頜持續(xù)前導(dǎo)后髁突軟骨骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)*

秦波, 潤丹， 徐衛(wèi)華*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討大鼠下頜持續(xù)功能前導(dǎo)后髁突軟骨各部位骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的表達(dá)。方法： 40只35 d齡雄性SD大鼠均分為實驗組和對照組，實驗組大鼠24 h戴自制功能性矯治器引導(dǎo)下頜前伸，對照組不做處理；于實驗后第3、7、14及28天時處死大鼠，采用免疫組化方法觀察髁突軟骨前、中、后各部位骨組織中BMP-2的表達(dá)。結(jié)果： 隨著觀測時間點(diǎn)后移，對照組中髁突軟骨前、中、后部的BMP-2陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，實驗組BMP-2陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各時點(diǎn)同組大鼠髁突軟骨后部BMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)高于中部和前部(P<0.05)；從第7天起，實驗組BMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)高于同時間點(diǎn)同部位對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、0.01)。結(jié)論： BMP-2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程；但對不同部位軟骨的改建可能不同。

[關(guān)鍵詞]髁突軟骨； 下頜前導(dǎo)； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2； 免疫組化； 大鼠，Sprague Dawley

髁突的生長改建直接影響下頜的形態(tài)和功能，髁突軟骨與關(guān)節(jié)盤直接接觸，其改建直接反映了外力對髁突的影響。。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)能夠誘導(dǎo)人或動物間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織, 是骨組織形成過程中最為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。在結(jié)構(gòu)正常的組織中，BMP-2處于較低水平；在創(chuàng)傷、機(jī)械力刺激的情況下， BMP-2濃度增高，參與促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。吳拓江等研究表明髁突軟骨BMP-2的表達(dá)強(qiáng)弱與機(jī)械應(yīng)力大小有關(guān)，髁突軟骨中BMP-2來自成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，通過檢測軟骨中BMP-2的表達(dá)可以反映成骨的活躍程度。本研究通過模擬臨床功能矯治器，建立大鼠下頜持續(xù)前導(dǎo)的動物模型，造模后檢測不同時間點(diǎn)大鼠髁突軟骨前、中和后部骨組織中BMP-2的表達(dá)，探討B(tài)MP-2對髁突不同部位軟骨骨改建的影響。

1材料與方法

1.1動物與材料

選擇健康雄性35 日齡 SD大鼠(貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)40只，隨機(jī)均分為實驗組和對照組。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2抗體 (武漢博士德生物工程有限公司)，增強(qiáng)型(Polink-1)檢測試劑盒、PV-6001 兔兩步法檢測試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)及濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

按照參考文獻(xiàn)制作大鼠咬合前導(dǎo)裝置，實驗組模擬臨床功能矯治器引導(dǎo)下頜前伸。對照組不做處理，所有動物自由飲水、飲食，同環(huán)境下飼養(yǎng)直至實驗結(jié)束。分別于實驗后第3、7、14及28天時，給予0.3%戊巴比妥鈉10 mL/g劑量腹腔注射全麻下處死大鼠，5只/組，分離組織，整塊取下髁狀突。10%福爾馬林溶液固定24 h，EDTA液脫鈣4周，常規(guī)脫水，石蠟包埋。石蠟縱向切片，脫水 ，抗原修復(fù)，去離子水孵育10 min(阻斷內(nèi)源性過氧化物酶)，PBS液洗3次，3 min/次，加一抗后 4 ℃過夜，次日，PBS液洗3次，2 min/次，加入兔IgG抗體-HRP多聚體工作液37 ℃孵育 30 min ，PBS液洗3次，2 min/次，DAB顯色，ddH2O終止顯色，蘇木素染色處理30 s，ddH2O沖洗，酸酒精處理10 s，氨酒精脫水透明1 min，樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，大鼠氣管軟骨組織作為陽性對照，細(xì)胞胞漿顯示特異黃色或棕黃色為染色陽性。在光學(xué)顯微鏡下應(yīng)用Pixera PVC100C系統(tǒng)采圖，Photoshop 8.0軟件分別選取髁突軟骨前、中、后部進(jìn)行觀測，每部分選擇連續(xù)3個100 px×100 px區(qū)域，計數(shù)各區(qū)域棕色深染的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

隨著觀測時間點(diǎn)后移，對照組中髁突軟骨前、中、后部的BMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，實驗組逐漸增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；同組內(nèi)，大鼠髁突軟骨后部BMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)高于中部和前部(P<0.05)；從第7天起，實驗組BMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)高于同時間點(diǎn)同部位對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、0.01)。見表1。

表1　大鼠下頜持續(xù)前導(dǎo)后髁突軟骨各部位及不同時間BMP-2陽性細(xì)胞數(shù)±s)

(1)與同組內(nèi)后部比較，P<0.05；與對照組同時點(diǎn)同部位比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01

3討論

髁突具有較強(qiáng)的生長改建能力，是整個下頜骨生長發(fā)育的中心。髁突軟骨位于髁突表面，是一種特殊形式的結(jié)締組織，不含血管、淋巴管及神經(jīng)纖維。髁突軟骨是直接接觸關(guān)節(jié)盤的部位，因而其改建直接反映了外力對髁突的影響。覆蓋于下頜髁突關(guān)節(jié)表面的纖維軟骨，是髁突改建能力的基礎(chǔ)，研究表明顳頜關(guān)節(jié)具有終生改建能力, 尤其是在幼年期及青少年改建能力較強(qiáng)。髁突的改建易受環(huán)境因素影響，張紅梅等通過升高后牙咬合，增加了垂直向的距離，改變了下頜的位置，從而改變了髁突的位置及負(fù)荷，髁突進(jìn)行了適應(yīng)性改建。髁突的生長過程即為軟骨細(xì)胞不斷分化成熟的軟骨內(nèi)骨化過程，BMP-2在軟骨細(xì)胞分化過程中起著重要的誘導(dǎo)作用。有研究報道在小鼠ATDC 5細(xì)胞系中，BMP-2可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞跳躍早期細(xì)胞的聚集階段而直接促進(jìn)軟骨的形成。體內(nèi)外實驗研究都已證實BMP-2可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)的合成和維持。

在本研究中，實驗組大鼠下頜后髁突軟骨BMP-2的表達(dá)在第7、14、28天強(qiáng)于對照組，特別是在增殖層，同時在初期伴有該層的增厚，提示BMP-2在促進(jìn)未分化的細(xì)胞向前軟骨細(xì)胞的分化過程中起著重要作用，大量的未分化細(xì)胞分化成前軟骨細(xì)胞，從而為軟骨成熟提供足夠的細(xì)胞來源；同時BMP-2在過渡層和肥大層表達(dá)的增強(qiáng)說明下頜前導(dǎo)加快了軟骨細(xì)胞成熟，促進(jìn)了髁突軟骨的增生，提示BMP-2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程。實驗組BMP-2表達(dá)第28天時較第14天時減少可能是局部組織改建已逐漸適應(yīng)了外界力的刺激所致。趙志河等的研究結(jié)果顯示髁突軟骨表面的前部為壓應(yīng)力集中區(qū)，后上部則為張力區(qū)，髁突發(fā)生向前向下的位移，認(rèn)為前伸下頜能促進(jìn)下頜髁突的生長，與本實驗結(jié)果相符。本研究實驗組在同一時間點(diǎn)BMP-2表達(dá)在髁突后部要強(qiáng)于前部和中部，提示BMP-2的表達(dá)可能與下頜前導(dǎo)后髁突不同部位所產(chǎn)生的應(yīng)力不同有關(guān)。綜上，BMP-2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程，但對不同部位軟骨的改建可能不同。

4參考文獻(xiàn)

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(2016-02-15收稿，2016-04-07修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

The Expression of BMP-2 in the Condyle of Rat during Mandibular Advancement

QIN Bo, RUN Dan, XU Weihua

(DepartmentofOrthodontics,TheAffiliatedStomatologyHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang, 550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the expression of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in the condylar cartilage of rats during mandibular advancement. Method: Forty 35-day-old male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into experimental group and control group. In experimental group the rats were treated with self-made functional appliance which caused mandibular protrusion while in control group the rats received no treatment. 5 rats in each group were sacrificed on the day 3, 7, 14 and 28 after experiment respectively. The expressions of BMP-2 in anterior, middle and posterior region of condyle cartilage were examined by immunohistochemical staining. Results: With the observation time extended, the number of BMP-2 expression positive cells in anterior, middle and posterior region of condyle cartilage in control group decreased gradually while the number of BMP-2 positive cells increased gradually, but the differences between two groups were not statistically significant(P>0.05). At different time points, the number of BMP-2 expression positive cells in posterior region was higher than that of anterior or middle region in experimental group (P<0.05). From 7th day, at the same time point, the number of BMP-2 expression positive cells in experiment group was significantly higher than that of control group (P<0.05).Conclusions: BMP-2 may participate in the remodeling activities of condylar cartilage. Its effect on mandibular cartilage remodeling may be different in different region of condyle cartilage.

[Key words]condyle cartilage; mandibular advancement; bone morphogenetic protein 2; immunohistochemical staining; rats, Sprague-Dawley

*通信作者E-mail:29574748@qq.com

[中圖分類號]R783.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0570-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.019

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2013.004.html