莫朝倫， 張軍梅**， 賈　瑩， 王藪馨， 楊夏晴， 馮安琪

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔正畸學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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丹參酮Ⅱ-A對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMP-2表達(dá)的影響*

莫朝倫1， 張軍梅1**， 賈瑩1， 王藪馨1， 楊夏晴2， 馮安琪1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔正畸學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 觀察丹參酮Ⅱ-A(TsⅡ-A)對(duì)大鼠大鼠成骨細(xì)胞(OB)中骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA 表達(dá)的影響。方法: 培養(yǎng)原代大鼠OB并傳代接種后采用Cell Counting Kit-8試劑盒比色法檢測(cè)5×10-3、5×10-2以及5×10-1mg/L 3個(gè)濃度的TsⅡ-A(統(tǒng)稱實(shí)驗(yàn)組)和對(duì)照組(0 mg/L TsⅡ-A)在第1、3、5、7天對(duì)OB的促增殖作用；RT-qPCR 檢測(cè)各組OB BMP-2 mRNA 的表達(dá)。結(jié)果： 不同濃度TsⅡ-A對(duì)OB均有促增殖的作用(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最大；在各時(shí)間段中，組間比較OB BMP-2 mRNA表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組(P<0.05)；各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)比較，OB BMP-2 mRNA表達(dá)趨勢(shì)為第7天>第5天>第3天>第1天(P<0.05)。結(jié)論： TSⅡ-A在一定的作用時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)OB增殖，并上調(diào)OB中BMP-2 mRNA表達(dá)水平。

[關(guān)鍵詞]丹參酮Ⅱ-A； 成骨細(xì)胞； 骨形成蛋白-2； 大鼠，Sprague-Dawley； 信使RNA

丹參屬于經(jīng)典活血化瘀類中藥,是中醫(yī)骨傷科方劑中的常用藥，可促進(jìn)骨的鈣化，在骨折治療中應(yīng)用丹參后成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)在數(shù)量及分布部位均明顯增多[1-4]。丹參酮Ⅱ-A(tanshinone Ⅱ-A，TsⅡ-A)屬于丹參的有效活性成分，具有雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[5]。近年來(lái)，有學(xué)者應(yīng)用TsⅡ-A于正畸治療的實(shí)驗(yàn)研究中，表明了TsⅡ-A對(duì)牙周組織、頜骨改建和調(diào)節(jié)具有一定的影響作用[6-7]。至今，有關(guān)TsⅡ-A對(duì)OB增殖分化等方面的研究甚少，其中的相關(guān)機(jī)制研究不多且不夠深入。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠OB，觀察TsⅡ-A對(duì)大鼠OB增殖影響，并采用實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR)方法，測(cè)定TsⅡ-A對(duì)大鼠OB骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)mRNA表達(dá)的影響，探討TsⅡ-A在OB增殖中可能存在的作用機(jī)制,為T(mén)sⅡ-A的藥理學(xué)作用提供理論參考。

1材料和方法

1.1材料

TsⅡ-A購(gòu)于Aladdin-阿拉丁試劑(上海)有限公司。新生1～ 2 d SD大鼠乳鼠，體質(zhì)量7～8 g，清潔級(jí) ,由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(黔)2012-0001]提供。DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，青/鏈霉素雙抗(北京索寶萊生物科技有限公司)，0.1%Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國(guó))，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國(guó))，Cell counting Kit8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁)，ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)，茜素紅指示劑(北京索寶萊生物科技有限公司)。Trizol總RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen)，引物序列設(shè)計(jì)及合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo)，熒光mix(瑞士ROCH)。超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-18AIC型，Sanyo，日本)，離心機(jī)(HC-2062)，核酸蛋白分析儀(Beckman coulter DU 640型,Beckman，美國(guó))，梯度PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf,美國(guó))，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX ConnectTM Real-time System,BIO-Rad,美國(guó))。

1.2方法

1.2.1OB分離、培養(yǎng)及傳代純化取1～2 d SD大鼠6只，取其顱蓋骨于完全培養(yǎng)基中修剪成1 mm3的碎骨片，將碎骨片移至15 mL離心管中，通過(guò)2次酶消化法提取原代OB，并于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),每2～3 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上后進(jìn)行傳代并利用差速貼壁法純化OB至第三代[8]。

1.2.2OB增殖情況采用CCK-8試劑盒比色法檢測(cè)OB增殖情況。第3代OB以2×104個(gè)/mL密度的細(xì)胞懸液接種于96孔板(100 μL/孔),各組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。依據(jù)TsⅡ-A濃度梯度分組(0、5×10-3、5×10-2以及5×10-1mg/L)，0 mg/L TsⅡ-A為對(duì)照組，其余濃度為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)1、3、5、7 d 4個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。各孔待測(cè)細(xì)胞均用CCK-8溶液10 μL孵育2 h后，酶標(biāo)儀450 nm處讀取OD值。1.2.3BMP-2mRNA表達(dá)RT-qPCR法檢測(cè)BMP-2mRNA表達(dá)。細(xì)胞處理：將0和5×10-2mg/L的TsⅡ-A分別處理第三代OB至1、3、5、7 d后，用TRizol試劑提取細(xì)胞總RNA。核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA濃度、純度，采用逆轉(zhuǎn)錄酶和 Oligod(T)18，dNTP將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA產(chǎn)物為模板Real-time PCR，采用RT-qPCR Sybr Green法測(cè)定，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以BMP-2為目的基因，β-actin 為內(nèi)參照，引物序列設(shè)計(jì)及合成委托于上海捷瑞生物工程有限公司(表1)。反應(yīng)體系20 μL，含有cDNA 5 μL，熒光mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。mRNA擴(kuò)增條件95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。ABI step one plus型熒光定量PCR儀采集待測(cè)基因及內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，以Applied Biosystems SDS 14.0軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果由熒光定量分析儀自動(dòng)采集并給出目的基因和參比基因的CT值，用2-ΔΔCT法對(duì)基因表達(dá)的CT值分析，其中ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)-ΔCT對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組ΔCT=CT目的-CT內(nèi)參，以目的基因的相對(duì)表達(dá)量用于統(tǒng)計(jì)分析。

表1　RT-qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1CCK-8檢測(cè)結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組TsⅡ-A均可促進(jìn)OB增殖；5×10-2和5×10-1mg/L濃度組在第1、3、5天對(duì)OB的促增殖作用顯著(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最為顯著(P<0.05)；5×10-3mg/L濃度組在第3、5天對(duì)OB的促增殖作用顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各實(shí)驗(yàn)組在第7天時(shí)間點(diǎn)對(duì)OB的促增殖作用與對(duì)照組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2總RNA鑒定及BMP-2 mRNA表達(dá)

所提取的總RNA純度在 1.8～2.0，電泳條帶清晰，28 S∶18 S帶亮度約為2∶1,5 S帶較模糊，無(wú)明顯降解，完整性好,見(jiàn)圖1。在各時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組BMP-2 mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)BMP-2 mRNA表達(dá)趨勢(shì)為第7天>第5天>第3天>第1天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

表2　不同濃度TsⅡ-A對(duì)OB增殖的影響(OD值，

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05

圖1　瓊脂凝膠電泳鑒定總RNAFig.1　Agarose gel electrophoresis of total RNA

(1)實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05圖2　OB中BMP-2 mRNA的表達(dá)Fig.2　Comparison of BMP-2 mRNA expression of osteoblast among groups

(1)不同時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05圖3　實(shí)驗(yàn)組OB中BMP-2 mRNA的表達(dá)Fig.3　Intro-group comparison of BMP-2 mRNA expression of osteoblast in experiment group

3討論

骨骼具有可塑特性,頜骨是骨骼中可塑性很強(qiáng)的組織，頜骨的可塑性是正畸治療的生物學(xué)基礎(chǔ)，其主要體現(xiàn)在破骨與成骨平衡的生理過(guò)程，OB是骨塑建的物質(zhì)基礎(chǔ)，是骨組織更新活動(dòng)中最重要的功能細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞[9]。OB可通過(guò)分泌一些細(xì)胞因子參與骨形成過(guò)程，同時(shí)控制骨基質(zhì)的礦化過(guò)程，其中BMPs是目前比較受關(guān)注的與骨誘導(dǎo)有密切關(guān)系的一種骨生長(zhǎng)因子，表現(xiàn)為誘導(dǎo)成骨作用[10]。其中，BMP-2屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β) 超家族成員，是研究和應(yīng)用最廣泛的生長(zhǎng)因子，是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)OB分化最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一，可上調(diào)多種基因表達(dá)，并通過(guò)與多種細(xì)胞因子形成BMP-2 信號(hào)通路[11-13]。BMP-2信號(hào)通路參與OB分化和骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌，促進(jìn)骨形成，形成骨塑建，維持骨量。

丹參作為中醫(yī)常用的活血化瘀類中藥,具有促進(jìn)骨折愈合、強(qiáng)骨補(bǔ)腎的功效，已被廣泛應(yīng)用于骨折的實(shí)驗(yàn)研究和治療中，其不僅能改善骨折處血供，還能促使OB數(shù)量及分布部位相應(yīng)增多，促進(jìn)骨的鈣化。相關(guān)研究證明，丹參能夠提高成骨樣細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性，促進(jìn)OB功能，從而促進(jìn)新骨形成，丹參還可通過(guò)提升破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的數(shù)量，促進(jìn)牙槽骨塑建，加快正畸牙的移動(dòng)等作用[14]。TsⅡ-A是丹參中最為豐富、結(jié)構(gòu)最具有代表性的丹參酮，為丹參的主要脂溶性成分，其不僅具有心血管系統(tǒng)相應(yīng)藥理作用，還具有雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[5]。相關(guān)研究表明，TsⅡ-A在OB-OC共育體系中可明顯提高OB增殖和ALP活性[15]。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)在不同濃度TsⅡ-A的作用下對(duì)大鼠乳鼠顱蓋骨OB體外增殖的影響，結(jié)果顯示，5×10-3、5×10-2和5×10-1mg/L 3個(gè)濃度TsⅡ-A均可促進(jìn)OB增殖，其中5×10-2mg/L濃度組促細(xì)胞增殖作用最明顯，提示該藥物濃度為本實(shí)驗(yàn)藥物濃度范圍內(nèi)相對(duì)最佳值，說(shuō)明適宜濃度TsⅡ-A對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠顱蓋骨OB具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，這與夏金鑫等[15]研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5×10-2mg/L濃度TsⅡ-A對(duì)OB中BMP-2 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)BMP-2 mRNA表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明本實(shí)驗(yàn)采用的TsⅡ-A可上調(diào)OB中BMP-2 mRNA的表達(dá)水平，提示了TsⅡ-A可能存在促進(jìn)骨形成的作用。各濃度TsⅡ-A組內(nèi)比較，BMP-2 mRNA表達(dá)量隨時(shí)間推移呈上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示TsⅡ-A可能呈漸進(jìn)性影響B(tài)MP-2 mRNA表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的TsⅡ-A對(duì)體外培養(yǎng)OB具有一定的促增殖作用，以5×10-2mg/L濃度TsⅡ-A促進(jìn)作用最為顯著，且在一定的作用時(shí)間內(nèi)，可上調(diào)BMP-2 mRNA表達(dá)量，其表達(dá)量呈時(shí)間依賴性。TsⅡ-A可能通過(guò)上調(diào)BMP-2 mRNA表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)OB增殖，進(jìn)而可能影響著正畸矯治中頜骨改建過(guò)程。有關(guān)TsⅡ-A對(duì)OB增殖分化影響的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

[1] 張丁,傅民魁,傅嘉.丹參對(duì)離體破骨細(xì)胞的影響[J].口腔正畸學(xué), 1995(2):63-64.

[2] 史煒鑌,符詩(shī)聰,杜寧,等.丹參有效部位對(duì)骨折愈合過(guò)程中膠原基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2000(4):269-271.

[3] 林潤(rùn)臺(tái),王忠,劉立波,等.丹參促進(jìn)下頜骨骨折愈合的超微結(jié)構(gòu)研究[J].中華口醫(yī)學(xué)雜志, 1992(4):215-216.

[4] Liu YR,Qu SX,Maitz MF,et al.The effect of the major components of salvia miltiorrhiza bunge on bone marrow cells[J] .Ethnopharmacol, 2007(3):573-583.

[5] 張萌濤,錢(qián)亦華,唐安琪.丹參酮ⅡA藥理作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述， 2010(17)：2661-2664.

[6] 楊夏晴，張軍梅，王藪馨，等.局部注射丹參酮ⅡA對(duì)兔正畸牙移動(dòng)中破骨細(xì)胞的影響[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2015(10)：1054-1059.

[7] 張世英，劉繼光，趙剛.丹參酮ⅡA 局部注射正畸牙移動(dòng)后復(fù)發(fā)階段破骨細(xì)胞分化因子的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究， 2014(11):1730-1736.

[8] 胡澤兵，曹新生，張舒.成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志， 2014(11)：1276-1282.

[9] Song K,Zhao G,Liu T,et al. Effective of umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells by regulation of microencapsulated osteoblasts under hypoxic condition [J].Biotechnology Letters, 2009(7):923-928.

[10]De-Luca F，Barnes KM，Uyeda JA，et al．Regulationof growth platechondrogenesis by bone morphogenetic protein-2[J]. Endocrinology， 2001(1)：430-436．

[11]Grgurevic L，Macek B，Mercep M，et al．Bone morphogenetic protein ( BMP) 1-3 enhances bone repair[J].Biochem Biophys Res Commun， 2011(1)：25-31．

[12]Sato C，Iwasaki T，Kitano S，et al．Sphingosine 1 phosphate receptor activation enhances BMP-2-induced osteoblast differentiation[J]．Biochem Biophys Res Commun， 2012(1)：200-205．

[13]Mai Z，Peng Z，Wu S，et al．Single bout short duration fluid shear stress induces osteogenic differentiation of MC3T3E1 cells via integrin β1 and BMP2 signaling cross-talk[J]．PLoS One， 2013(4):e61600．

[14]梅銀生，賈玉龍，張麗娜.川續(xù)斷和丹參影響大鼠正畸牙移動(dòng)的比較[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版， 2010(8)：60-64.

[15]夏金鑫.丹參酮ⅡA對(duì)成骨-破骨共育體系中成骨細(xì)胞活性及IGF-ImRNA的影響[D].暨南大學(xué)， 2008.

(2016-01-03收稿，2016-04-30修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

The Expression of BMP-2 mRNA of Rat Osteoblast Cultured with Tanshinone Ⅱ-A

MO Chaolun1, ZHANG Junmei1, JIA Yin1, WANG Souxi1, YANG Xiaqing2, FENG Anqi1

(1.DepartmentofOrthodontics,theSchoolofStomatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effects of Tanshinone Ⅱ-A on expression of the bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) mRNA of rat osteoblasts. Methods: the original generation of rat osteoblasts were cultivated and passaged, and Tanshinone Ⅱ-A was supplemented into the culture medium of osteoblast at 5×10-3mg/L, 5×10-2mg/L, 5×10-1mg/L respectively．Cell Counting Kit-8 Kit colorimetry were used to detect the proliferation of osteoblast on the 1st, 3rd, 5th, 7thday, the expression of BMP-2 mRNA was checked by RT-qPCR. Results: All concentrations of Tanshinone Ⅱ-A were promoting proliferation of osteoblast (P<0.05), which 5×10-2mg/L demonstrated the greatest effect. The expression of BMP-2 mRNA of experimental group was higher than control group in each period through comparison (P<0.05), while the intra-group comparison displayed that the expression of BMP-2 mRNA showed an increasing trend with time went by(P<0.05). Conclusions: Tanshinone Ⅱ-A promoted the proliferation of osteoblasts in a certain time significantly, and which also could increase the expression level of BMP-2 mRNA .

[Key words]tanshinone Ⅱ-A； osteoblast； bone morphogenetic protein-2; rats，Sprague-Dawley； messenger RNA

*[基金項(xiàng)目]貴陽(yáng)市科技局基金筑科合同(20151001)

[中圖分類號(hào)]R285； R329.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0559-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.016

**通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2153.054.html