孔祥耀， 于世博， 黎小梅， 唐　毅， 倪　穩(wěn)， 陳明翠， 張金娟

(貴州醫(yī)科大學(xué) 化學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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有柄石韋水提物對(duì)小鼠皮膚全層切除傷的促愈合作用*

孔祥耀， 于世博， 黎小梅， 唐毅， 倪穩(wěn)， 陳明翠， 張金娟**

(貴州醫(yī)科大學(xué) 化學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究有柄石韋孢子葉(SPP)水提物對(duì)小鼠全層切除傷的影響。方法： 對(duì)75只昆明小鼠做背中線(xiàn)100 mm2的全層皮膚切除制作模型；隨機(jī)均分成空白組、云南白藥組和有柄石韋組，云南白藥組和有柄石韋組分別給予云南白藥粉末和有柄石韋提取物敷于傷口，連續(xù)給藥5 d；計(jì)算造模后第1～3天，第3～7天，第7～14天和第14～18天傷口縮小比例；于造模后第3、7及18天取處死小鼠，取背部皮膚組織行HE染色，觀(guān)察3組小鼠傷口皮膚肉芽組織生長(zhǎng)情況和再上皮化程度。結(jié)果： 云南白藥組和有柄石韋組在第1～3天、第3～7天、第7～14天和第14～18天時(shí)段的傷口縮小比例均大于對(duì)照組(P<0.05)；云南白藥組在第1～3天、第3～7天和第14～18天時(shí)段的傷口縮小比例高于有柄石韋組(P<0.05)；造模后第3天，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織較對(duì)照組組織規(guī)則厚實(shí)；第7天時(shí)，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織厚度增加，較為緊湊，無(wú)水腫現(xiàn)象，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增高；第18天時(shí)，3組小鼠組傷口基本愈合，但云南白藥組和有柄石韋組的傷口愈合后組織較對(duì)照組緊致，無(wú)水腫現(xiàn)象。結(jié)論： 有柄石韋能促進(jìn)小鼠傷口愈合，作用稍弱于云南白藥。

[關(guān)鍵詞]云南白藥； 傷口愈合； 肉芽組織； 小鼠; 有柄石韋

傷口愈合是一個(gè)進(jìn)化上相對(duì)保守、復(fù)雜、多細(xì)胞參與的過(guò)程，是皮膚屏障的重建過(guò)程。這個(gè)過(guò)程涉及了角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及血小板等多種細(xì)胞的共同作用。這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖、浸潤(rùn)和分化將會(huì)在炎癥反應(yīng)、新組織的形成以及傷口愈合中達(dá)到頂峰[1]。有柄石韋(Pyrrosiapetiolosa)是水龍骨科石韋屬下的蕨類(lèi)植物，《苗藥》中記載為黛口掌，銳貓棍，多用于治療肺癌、膀胱癌、腎炎、膀胱炎、腎結(jié)石、血尿、咳血、衄血以及哮喘。石韋屬植物主要成分為黃酮類(lèi)化合物，對(duì)常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌如金黃色葡萄球菌及革蘭陰性菌如大腸埃希菌等均有一定的抑菌效果[2-4]。貴州民間多把此藥用于止血和促進(jìn)傷口愈合，效果顯著。本文用有柄石韋孢子葉粉碎后粉末的水提物處理以小鼠皮膚全層切除傷，觀(guān)察有柄石韋對(duì)傷口愈合的作用。

1材料與方法

1.1試藥與試劑

試藥為有柄石韋，采摘于貴州當(dāng)?shù)?，并于貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定。取其孢子葉于貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室100目粉碎機(jī)粉碎，采用水提法進(jìn)行有柄石韋水提物制備；試劑有95%無(wú)水酒精、碘伏、3%戊巴比妥鈉溶液、10%中性甲醛固定液及HE染液；RM2015型石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)，DSHZ-300型恒溫水浴箱(江蘇太倉(cāng))，BX51T-PHD-J11型顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模健康SPF級(jí)昆明雄性小鼠75只，體質(zhì)量(20±3)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)為SCXK(黔)2014-001。隨機(jī)均分成對(duì)照組、云南白藥組和有柄石韋組，每組又隨機(jī)均分成第1、3、7、14及18天5個(gè)小組。造模：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部去毛，于每只小鼠背部脊柱正中線(xiàn)做100 mm2大小的全層皮膚切除(不損傷筋膜層)；術(shù)后對(duì)照組傷口不給于任何措施，云南白藥組給予云南白藥粉末，有柄石韋水提組給予有柄石韋水提物，將藥物敷于傷口上，并予清潔紗布包扎，每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d。

1.2.2傷口縮小比例的計(jì)算造模當(dāng)天設(shè)為第0天，于造模后第1、3、7、14及18天在傷口同一水平放置鋼尺以作為傷口實(shí)際面積大小的參照物，數(shù)碼相機(jī)拍攝。計(jì)算并記錄傷口縮小比例[如：]第n～(n+3)天傷口縮小比例=(第n天傷口面積-第n+3天傷口面積)/第n天傷口面積×100%〗。

1.2.3病理組織染色造模后第3、7及18天時(shí)取小鼠傷口及創(chuàng)緣皮膚組織，于10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水，二甲苯透明和包埋組織塊。5 μm切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察組織病理HE染色切片，以愈合區(qū)域再生表皮完整程度，肉芽組織緊致程度和出現(xiàn)水腫為指標(biāo)判斷傷口愈合質(zhì)量，愈合質(zhì)量較差為再生表皮不完整，肉芽組織松散，有水腫；愈合質(zhì)量一般為再生表皮部分完整，肉芽組織無(wú)明顯水腫；愈合質(zhì)量較好為再生表皮完整，肉芽組織緊致，無(wú)水腫[5]。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

2結(jié)果

2.1傷口縮小比例

云南白藥組和有柄石韋組在第1～3天、第3～7天、第7～14天和第14～18天時(shí)段的傷口縮小比例均大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而云南白藥組在第1～3天、第3～7天和第14～18天時(shí)段的傷口縮小比例高于有柄石韋組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第7～14天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　3組皮膚全層切除傷小鼠傷口縮小比例±s)

與對(duì)照組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05；與云南白藥組相比，(3)P<0.01,(4)P<0.05

2.2炎癥細(xì)胞數(shù)量、肉芽組織松緊程度和上皮化程度

造模后第3天，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織較規(guī)則且厚實(shí)(圖1A～B)，而對(duì)照組的肉芽組織顯得菲薄和不規(guī)則(圖1C)。造模后第7天，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織繼續(xù)生長(zhǎng)，相比造模后第3天，厚度有所增加，并且較為緊湊，無(wú)水腫現(xiàn)象，并且兩組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增高(圖1D～E)。而對(duì)照組相對(duì)無(wú)明顯變化(圖1F)。造模后第18天，3組傷口均基本愈合，與對(duì)照組相比，云南白藥組和有柄石韋組的愈合后組織在鏡下顯得更為緊致，無(wú)水腫現(xiàn)象；且云南白藥組有柄石韋組已出現(xiàn)較多的毛囊和皮脂腺(圖1G～H)，而對(duì)照組相對(duì)較少(圖1I)。

注：A、B、C分別為第3天云南白藥組、有柄石韋組和對(duì)照組(HE，×200)；D、E、F分別為第7天云南白藥組、有柄石韋組和對(duì)照組(HE，×400)；G、H、I分別為第18天云南白藥組、有柄石韋組和對(duì)照組(HE，×200)圖1　3組皮膚全層切除傷小鼠皮膚肉芽組織Fig.1　The HE dyeing of skin granulation tissue in three groups

3討論

皮膚創(chuàng)傷是一種常見(jiàn)的健康問(wèn)題，發(fā)生率較高，如處理不當(dāng)會(huì)引起皮膚感染潰爛，延期愈合，尋找一種快速促進(jìn)皮膚傷口愈合的藥物，是藥物研發(fā)領(lǐng)域最古老，也是最重要的挑戰(zhàn)之一。云南白藥作為我國(guó)傳統(tǒng)促愈良藥，可以顯著縮短傷口出血時(shí)間、凝血時(shí)間及凝血酶原時(shí)間，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于治療臨床創(chuàng)傷出血、消化道出血等各種出血性疾病[6]。有柄石韋是水龍骨科石韋屬下的蕨類(lèi)植物，產(chǎn)于中國(guó)東北、華北、西北、西南和長(zhǎng)江中下游各省區(qū)，具有重要的藥用價(jià)值，性甘、苦，微寒，歸肺、膀胱經(jīng)，有利尿通淋、清熱止血的作用?！睹缢帯分斜唤凶鲼炜谡啤J貓棍，全草被用于治療肺癌、膀胱癌、腎炎、膀胱炎、腎結(jié)石、血尿、咳血、衄血以及哮喘。石韋屬植物主要成分為黃酮類(lèi)化合物，如山奈酚槲皮素、異槲皮素、異槲皮苷、芒果苷類(lèi)等。在貴州民間，多作為刀口藥用于促進(jìn)傷口愈合，且效果顯著。因此對(duì)有柄石韋進(jìn)行促進(jìn)皮膚愈合研究，尋找其有效成分，為尋找皮膚創(chuàng)傷治療藥物提供了一個(gè)有效的研究途徑。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠皮膚全層切除傷模型研究有柄石韋水提物對(duì)傷口愈合的作用。傷口愈合過(guò)程伴隨肉芽組織增生及傷口面積縮小。肉芽組織中的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生肌動(dòng)蛋白，而形成肌成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械拉力，將創(chuàng)緣向中心牽拉，從而使傷口不斷收縮，因此傷口縮小比例反映了傷口愈合的速度；同一段時(shí)間內(nèi)傷口縮小比例越大，說(shuō)明傷口愈合的趨勢(shì)越明顯。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)云南白藥和有柄石韋治療的傷口縮小比例均大于同期的對(duì)照傷口，說(shuō)明有柄石韋在促進(jìn)傷口愈合上有積極作用。

上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞在傷口修復(fù)過(guò)程中均有重要作用[7-8]。本研究采用HE染色評(píng)估創(chuàng)緣肉芽組織的生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織較對(duì)照的肉茅組織緊致、厚實(shí)。云南白藥組和有柄石韋組第18天的切片相對(duì)對(duì)照的上皮化完整，皮下已有毛囊和皮脂腺。證明有柄石韋提取物對(duì)傷口的愈合較為完全，附件功能恢復(fù)較好，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-11]。本研究后續(xù)將考慮提取有柄石韋活性物質(zhì)及進(jìn)一步探明和闡述。

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(2016-01-03收稿，2016-04-20修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Effect of Promoting Healing ofPyrrosiapetiolosaWater Extract in Mice's Full-thickness Excision Wound

KONG Xiangyao, YU Shibo, LI Xiaomei, TANG Yi, NI Wen, CHEN Mingcui, ZHANG Jinjuan

(LaboratoryofChemistryandBiochemistry,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the effect of water extract of Pyrrosia petiolosa on mice's full-thickness excision wound. Methods: 75 Kunming mice received adaptive feeding for 3 days, and 100 mm2 full thickness skin resection model was established on mice's dorsal midline. Then the mice were randomly divided into blank control group, Yunnan baiyao group and Pyrrosia petiolosa group. In Yunnan baiyao group, the powder was applied to the wound while in Pyrrosia petiolosa group the water extract of Pyrrosia petiolosa applied to the wound, and both groups received continuous administration for 5 days, once per day. Wound's area and volume reduction ratio was calculated during 1～3 days, during 3～7 days, during 7～14 days and during 14～18 days, respectively. Mice were sacrificed 3th, 7th, 18thday after model establishment, HE dyeing was conducted for dorsal skin tissue. The growth of skin granulation tissue and the degree of re-epithelialization of wound skin in mice were observed in the three groups. Results: Compared with blank control group, the wound's area and volume reduction ratio in Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group during 1～3 days, 3～7 days, 7～14 days and 14～18 days was significantly higher(P<0.05). Compared with Pyrrosia petiolosa group, the wound's area and volume reduction ratio in Yunnan Baiyao group during 1～3 days, 3～7 days, and 14～18 days was significantly higher(P<0.05). On the 7thday, the thickness of granulation tissue increased, skin granulation tissue was more compact. Besides, no edema existed in skin granulation tissue and the number of fibroblasts was significantly increased. On the 18thday, wound almost healed in all three groups, but the tissue after wound healing in Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group was more compact compared with blank control group. Also, there was no edema in tissue of Pyrrosia petiolosa group and Yunnan Baiyao group. Conclusion: Pyrrosia petiolosa can promote wound healing but its effect is poorer thanYunnan Baiyao.

[Key words]Yunnan Baiyao; wound healing; skin granulation tissue; mice; Pyrrosia petiolosa

*[基金項(xiàng)目]大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(NO.201410660001)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R285； R29

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0555-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.015

**通信作者 E-mail:826609585@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2204.062.html