毛久鳳， 夏　茜， 吳　鐳， 楊　紅， 周成菊， 方　藝， 董　強(qiáng)

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 3.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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鈦表面構(gòu)建成骨細(xì)胞膜片的體外研究*

毛久鳳1， 夏茜2， 吳鐳1， 楊紅3， 周成菊3， 方藝4， 董強(qiáng)5**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng)550004； 3.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究成骨細(xì)胞膜片在鈦表面的生長(zhǎng)情況。方法： 將體外培養(yǎng)鑒定的的大鼠成骨細(xì)胞接種在純鈦表面，構(gòu)建大鼠成骨細(xì)胞膜片，連續(xù)培養(yǎng)1、2、3周，分別于第1、2、3周末收集成骨細(xì)胞膜片，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞膜片的組成，光鏡測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞膜片的厚度。結(jié)果： 原代培養(yǎng)細(xì)胞符合成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；第2、3周末細(xì)胞膜片厚度較第1周末細(xì)胞膜片厚度明顯增加(P<0.05)；與第3周末細(xì)胞膜片相比，第2周末細(xì)胞膜片厚度增加最明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 鈦表面構(gòu)建的成骨細(xì)胞膜片擁有良好的增殖生長(zhǎng)活性。

[關(guān)鍵詞]成骨細(xì)胞； 鈦； 組織工程； 細(xì)胞膜片

由于外傷、牙周疾病等因素導(dǎo)致的種植術(shù)區(qū)牙槽骨骨缺損，給缺牙區(qū)的種植修復(fù)帶來(lái)了困難且修復(fù)失敗率高。基于組織工程方法促進(jìn)骨組織再生、恢復(fù)其結(jié)構(gòu)與功能已引起人們廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)的組織工程方法利用細(xì)胞與支架的直接復(fù)合，出現(xiàn)細(xì)胞活性差、細(xì)胞利用率低等缺點(diǎn)。隨著組織工程無(wú)支架細(xì)胞膜片技術(shù)(cell sheet technology，CST)的不斷發(fā)展，利用細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)聚合物再生組織的方法，一定程度上有效的解決了細(xì)胞流失的問(wèn)題。該技術(shù)已成功應(yīng)用于構(gòu)建皮膚、角膜、牙周膜等多種組織[1-4]。鈦?zhàn)鳛榭晒┻x擇的植入材料，與宿主骨之間具有良好的生物相容性，但其生物惰性使鈦與宿主骨之間短時(shí)間內(nèi)難以形成很好的骨整合，構(gòu)建具有成骨活性的細(xì)胞膜片，對(duì)植體周圍快速成骨、縮短骨愈合時(shí)間具有重要的臨床指導(dǎo)意義[5]。目前尚未見(jiàn)有關(guān)鈦表面構(gòu)建細(xì)胞膜片的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在鈦表面構(gòu)建大鼠成骨細(xì)胞膜片，從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察不同時(shí)間段細(xì)胞膜片的厚度，初步評(píng)估其在鈦表面的生物學(xué)變化。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自浙江杭州四季青公司，Ⅰ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，抗壞血酸購(gòu)自美國(guó)Solarbio-Sigma-Ultra公司，超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)及倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Corning-Costar公司，鈦片由陜西省西安泰金工業(yè)電化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)，SD大鼠乳鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1大鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定新生24 h內(nèi)SD大鼠乳鼠于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)剝離顱骨，預(yù)冷的PBS液洗3次后，刮凈骨膜結(jié)締組織，剪碎骨片。加入胰蛋白酶(含0.25% EDTA)消化約15 min，棄消化液；0.1%Ⅰ型膠原酶2 mL，于37 ℃消化20 min，重復(fù)消化3次，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀制成細(xì)胞懸液，差數(shù)貼壁法純化，用含有15 %胎牛血清的DMEM的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次。細(xì)胞融合單層鋪滿瓶底約80%～90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳至3代。從形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶染色、茜蘇紅染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.2鈦片的準(zhǔn)備準(zhǔn)備厚約1 mm，直徑3.5 cm的2級(jí)純鈦片，以不同粗糙度的金相砂紙打磨表面、拋光后呈鏡面，丙酮超聲清洗180 min，之后依次使用75 %酒精、去離子水清洗15 min，置于空氣中自然干燥，實(shí)驗(yàn)前高壓滅菌。

1.2.3構(gòu)建大鼠成骨細(xì)胞膜片第3代成骨細(xì)胞以2×106個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)鈦表面，用DMEM高糖培養(yǎng)基(含15%胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸及100 U/mL青霉素-鏈霉素)連續(xù)培養(yǎng)3周，培養(yǎng)基每2 d更換1次。

1.3觀察指標(biāo)

分別于細(xì)胞膜片培養(yǎng)的第1、2、3周末時(shí)，用細(xì)胞刮將其小心的分離鈦表面，置于PBS里倒置相差顯微鏡下觀察；然后置于4 %的多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察細(xì)胞膜片的形態(tài)及組成。用Image-Pro Plus圖像分析軟件(200倍視野，圖像尺寸1 280×1 024)采集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞膜片的組織學(xué)切片圖像，同樣像素和視野下設(shè)置標(biāo)尺，隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，根據(jù)標(biāo)尺測(cè)量其厚度并取平均值，此值為膜片的厚度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)

原代培養(yǎng)的細(xì)胞呈圓形類圓形，5 h后有部分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞呈梭形、星形。第7～8天時(shí)后有細(xì)胞集落生長(zhǎng)，融合成片，細(xì)胞鋪滿瓶底即可傳代。堿性磷酸酶染色檢測(cè)陽(yáng)性，符合成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。連續(xù)培養(yǎng)21 d，茜蘇紅染色出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。見(jiàn)圖1。

2.2大鼠成骨細(xì)胞膜片

細(xì)胞膜片培養(yǎng)第1、2及3周末均可觀察到鈦表面形成薄層乳白色膜狀物，利用細(xì)胞刮可將成骨細(xì)胞膜片從鈦表面分離(圖2A)，膜片有一定韌性，可收縮成團(tuán)，具有一定的操作性。將膜片置于倒置顯微鏡下觀察膜片層由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)形成，細(xì)胞間連接緊密(圖2B)。

2.3成骨細(xì)胞膜片厚度

細(xì)胞膜片厚度測(cè)量結(jié)果(如圖3)，第1周末(13.336 1±0.455 51)μm，第2周末(27.759 5±0.444 88)μm，第3周末(34.768 2±0.399 78)μm,第2周末和第3周末的膜片厚度逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示通過(guò)在純鈦表面高密度接種的成骨細(xì)胞，用含有抗壞血酸的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)，可形成膜片層結(jié)構(gòu)，且隨時(shí)間的增加膜片厚度增加，其中第2周膜片厚度增加最明顯。

注：A為原代成骨細(xì)胞，B為HE染色，C為堿性磷酸酶染色，D為茜蘇紅染色圖1　大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.1　Morphological characteristics of osteoblasts of rats

注：A為大體觀，B為鏡下觀圖2　大鼠成骨細(xì)胞膜片(100×)Fig.2　Osteoblast cell sheets of rats

注： A(200×)和B(400×)為培養(yǎng)第1周末膜片，C(200×)和D(400×)為培養(yǎng)第2周末膜片，E(200×)和F(400×)為培養(yǎng)第3周末膜片圖3　培養(yǎng)不同時(shí)間的成骨細(xì)胞膜片(HE)Fig.3　Osteoblast cell sheet cultured in different time

3討論

相較于傳統(tǒng)的組織工程方法，CST作為一種新型的組織再生技術(shù)，具有細(xì)胞利用率高、無(wú)組織排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞膜片結(jié)構(gòu)保留了一些重要的細(xì)胞表面蛋白如細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞-細(xì)胞連接蛋白等可通過(guò)溫度反應(yīng)培養(yǎng)皿法、物理刮取法等方法獲得完整的膜片結(jié)構(gòu)，由于膜片結(jié)構(gòu)保留了細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間連接，它可同一時(shí)間將大量細(xì)胞移植到受體區(qū)，移植細(xì)胞活性和生理功能及結(jié)構(gòu)的完整性受到保護(hù)[6]。本研究采用CST的方法，利用成骨細(xì)胞在鈦表面構(gòu)建了大鼠成骨細(xì)胞膜片，研究發(fā)現(xiàn)，利用抗壞血酸成骨誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞在鈦表面培養(yǎng)5～7 d，即能形成薄層膜狀物，膜片內(nèi)細(xì)胞隨機(jī)排列并重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞間充滿細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，膜片結(jié)構(gòu)能很好的黏附于鈦表面，并且可以在鈦表面維持至少2～3周。鈦材料與周圍環(huán)境的整合過(guò)程需要細(xì)胞的粘附、增殖、分化等行為。成骨細(xì)胞增殖、分化的前提是細(xì)胞的黏附。不同于其它金屬，金屬鈦表面可以對(duì)一些大分子物質(zhì)的吸附來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。有研究提示采用ECM蛋白處理的鈦表面促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖、分化[7]。ECM蛋白的存在影響細(xì)胞的黏附能力，鈦表面大量細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的反應(yīng)對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、細(xì)胞的黏附、增殖很重要[8-10]。本實(shí)驗(yàn)前期已對(duì)體外構(gòu)建的成骨細(xì)胞膜片有一定研究，其主要成分是細(xì)胞及細(xì)胞自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，現(xiàn)對(duì)成骨細(xì)胞膜片在鈦表面的生物學(xué)變化評(píng)估提示，豐富的ECM蛋白可以增強(qiáng)膜片結(jié)構(gòu)在鈦表面的黏附能力，ECM作為細(xì)胞自身的細(xì)胞外支架有利于維持細(xì)胞的穩(wěn)定、促進(jìn)細(xì)胞間的連接，便于細(xì)胞間信息的溝通。細(xì)胞膜片通過(guò)ECM的黏附與周圍環(huán)境相互作用影響細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)量鈦片上細(xì)胞膜片的厚度結(jié)果顯示，借助細(xì)胞刮將膜片與鈦表面分離，組織學(xué)對(duì)其厚度分析，誘導(dǎo)過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，膜片厚度增加，其中第2周末和第3周末較第1周末厚度明顯增加，提示通過(guò)在純鈦表面高密度接種的成骨細(xì)胞，用含有抗壞血酸的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)，可形成膜片層結(jié)構(gòu)，且隨時(shí)間的增加膜片厚度增加；與第3周末比較，第2周末膜片厚度增加最明顯，細(xì)胞膜片在鈦表面培養(yǎng)2周，增殖能力降低，有可能膜片內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入分化階段。提示在鈦表面構(gòu)建的成骨細(xì)胞膜片能很好的與鈦表面形成接觸，并且在表面生長(zhǎng)增殖，這可能與細(xì)胞的發(fā)育需要生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等細(xì)胞信號(hào)分子的激發(fā)完成，而這些信號(hào)分子能夠募集細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化[11]。綜上，本研究應(yīng)用細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)膜片技術(shù)在鈦表面構(gòu)建的由多層細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞膜片模擬了體內(nèi)骨基質(zhì)的形成過(guò)程。在鈦表面，成骨細(xì)胞膜片仍然存在細(xì)胞增殖活性。

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(2016-01-06收稿，2016-03-18修回)

中文編輯： 戚璐； 英文編輯： 劉華

Studyinvitroof Osteoblast Cell Sheet on Titanium Surface

MAO Jiufeng1, XIA Qian2, WU Lei1, YANG Hong3, ZHOU Chengju3, FANG Yi4, DONG Qiang5

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofOralMedicine,theAffiliatedStomatologicalHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 5.DepartmentofProsthodontics,StomatologicalCollegeofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the growth activity of osteoblast cell sheet on the titanium surface. Methods: Rats' osteoblasts were cultured in vitro and identified. Then osteoblast cell sheets were vaccinated on the titanium surfaces and cultured for 1 week, 2 weeks and 3 weeks. At different designated time points the cell-sheets were collected with a cell scraper and its structure and composition were examined under the inverted microscope, and the thickness of the cell sheet was measured by light microscope. Results: The cells on cell sheet were consistent with the morphological characteristics of osteoblasts, suggesting the cell sheets were successfully constructed on the titanium surface. The results showed that the thickness of the cell sheet significantly increased at 2ndweek and 3rdweek after culture compared with at the 1stweek(P<0.05). The thickness of the cell sheet increased more significantly at the 2ndweek compared with at the 3rdweek (P<0.05). Conclusion: The osteoblast cell sheets on the titanium surface have a good proliferation activity.

[Key words]osteoblast; titanium; tissue engineering; cell sheet

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳省校合作協(xié)議項(xiàng)目[黔科合LH字(2014)7115號(hào)]； 貴陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目[筑科合同(20141001)39號(hào)]

[中圖分類號(hào)]R318.021

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0535-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.010

**通信作者 E-mail:dongq666@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2030.016.html