沈雪梅　李　晶　張　剛　崔宏曉　劉麗慧　姚軍虎　徐秀容

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100)

改良低溫螯合法分離家兔小腸絨毛和隱窩細(xì)胞及分離效果鑒定

沈雪梅李晶張剛崔宏曉劉麗慧姚軍虎徐秀容*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究家兔小腸絨毛和隱窩細(xì)胞的分離方法，為深入研究小腸上皮結(jié)構(gòu)與功能提供體外模型。試驗(yàn)以新西蘭白兔為試驗(yàn)材料，在不同螯合劑濃度[5、10、15、20、25 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)]和螯合溫度(4、25 ℃)下分離小腸絨毛和隱窩細(xì)胞，檢測所分離細(xì)胞團(tuán)的產(chǎn)量、形態(tài)、細(xì)胞活率、完整性。結(jié)果表明：1)各螯合條件下分離的絨毛和隱窩細(xì)胞形態(tài)完整，基因組DNA與總RNA完整；2)螯合溫度越高且EDTA濃度越大時(shí)，細(xì)胞富集率越高，但對(duì)細(xì)胞毒害作用也越強(qiáng)，4 ℃、5 mmol/L EDTA條件下絨毛和隱窩細(xì)胞富集率分別為7.75%和1.01%，絨毛相對(duì)完整率和隱窩細(xì)胞相對(duì)活率分別為91.67%和93.48%；25 ℃、25 mmol/L EDTA條件下絨毛和隱窩細(xì)胞富集率則分別高達(dá)17.89%和4.99%，但絨毛相對(duì)完整率和隱窩細(xì)胞相對(duì)活率僅為4.25%和5.17%；3)綜合分析后確定，4 ℃、10 mmol/L EDTA條件下分離效果最佳；4)在最佳條件下所分離隱窩富集物的溶菌酶和α-防御素的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于絨毛富集物(P<0.01)，顯示細(xì)胞純度較高；且隱窩細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)9 h后溶菌酶和α-防御素的相對(duì)表達(dá)量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，顯示細(xì)胞依然具有較高活力。由此可見，改良的低溫螯合法適用于家兔小腸絨毛和隱窩細(xì)胞的高效分離。

關(guān)鍵詞：隱窩；絨毛；腸上皮細(xì)胞；螯合劑；家兔

小腸是機(jī)體消化吸收的重要部位，其功能與腸上皮細(xì)胞密切相關(guān)，單層柱狀上皮細(xì)胞覆蓋在腸腔組成小腸的上皮，上皮彎曲折疊有序地排列成絨毛和隱窩，其中上皮凸向腸腔形成的葉狀結(jié)構(gòu)為絨毛，下陷至固有層形成的指套狀結(jié)構(gòu)為隱窩[1]。絨毛和隱窩的細(xì)胞組成及生理功能不同，分離培養(yǎng)可用于探討不同的生理問題，如絨毛培養(yǎng)可用于研究小腸物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能[2-4]，隱窩培養(yǎng)則可用于研究腸干細(xì)胞生理及潘氏細(xì)胞免疫功能等[5-10]。目前國內(nèi)外分離小腸絨毛和隱窩細(xì)胞的方法主要有機(jī)械分離法、螯合法、酶消化法[11]，其中螯合法應(yīng)用最廣泛，但螯合法也存在分離時(shí)間長、隱窩和絨毛分離效果差、細(xì)胞活率低等問題。Pothier等[12]使用含1.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的鹽溶液在37 ℃條件下螯合孵育腸組織，分離的絨毛和隱窩細(xì)胞互相摻雜，富集率低；Bjerknes等[13]將EDTA濃度提高為30 mmol/L，雖然分離時(shí)間縮短且提高了富集率，但對(duì)絨毛損傷很大；Ayabe等[14]在此基礎(chǔ)上將分離溫度降低到室溫，雖可提高隱窩的完整性，但無法富集絨毛。Flint等[15]則用二硫蘇糖醇(DTT)取代EDTA的螯合作用，并將處理溫度進(jìn)一步降低為4 ℃，可以得到更完整的隱窩細(xì)胞團(tuán)，但對(duì)絨毛損傷很大。Fuller等[16]發(fā)現(xiàn)，降低EDTA濃度為3 mmol/L并結(jié)合2%山梨醇，能有效地降低細(xì)胞損傷，但分離時(shí)間較長。以上研究均以小鼠或大鼠為試驗(yàn)材料，尚無分離家兔小腸絨毛和隱窩細(xì)胞的報(bào)道，且不同研究者使用的螯合劑種類、濃度、溫度不一致，目前均不能使富集率、完整性、分離純度、分離時(shí)間同時(shí)達(dá)到理想結(jié)果。本研究通過綜合分析前人各分離方法的優(yōu)勢(shì)與不足，探究不同螯合劑濃度與溫度組合對(duì)家兔小腸絨毛和隱窩細(xì)胞分離效果的影響，篩選出富集率高、細(xì)胞活率好、分離時(shí)間短的最佳組合，為后續(xù)研究家兔小腸不同細(xì)胞功能及營養(yǎng)物質(zhì)吸收及調(diào)控機(jī)制提供重要手段。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以健康14日齡新西蘭白兔為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)采用2×5完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)2個(gè)溫度水平：4 ℃低溫(low temperature,LT)和25 ℃室溫(room temperature,RT)；5個(gè)EDTA濃度：5、10、15、20、25 mmol/L。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)采用5 g小腸組織。

1.2螯合劑的配制

參照文獻(xiàn)[15]配制D-Hanks液，額外添加0.5 mmol/L DTT、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。螯合劑：1.5 mmol/L KCl、96 mmol/L NaCl、8 mmol/L KH2PO4、5 mmol/L Na2PO4、44 mmol/L蔗糖、55 mmol/L山梨糖醇、5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別添加5個(gè)濃度的EDTA。

1.3小腸絨毛和隱窩細(xì)胞的洗脫分離

家兔耳緣靜脈注射空氣處死后，浸泡于75%酒精中3 min，剖腹取下全段小腸，用冰冷的D-Hanks液(含DTT、雙抗)沖洗腸腔3遍，將腸段外翻并剪成1～2 cm小段，洗凈黏液，均分5 g小腸組織至各處理，各處理加入50倍體積(以下各步驟所加螯合劑體積均為50倍)對(duì)應(yīng)濃度EDTA的螯合劑。LT組和RT組分別在對(duì)應(yīng)溫度下操作：1)150 r/min條件下振搖15 min后上下顛倒振搖(≈60次/min)2 min后棄懸液，加入螯合劑，相同條件下振搖5～15 min，至肉眼可見懸液中出現(xiàn)針尖樣大小細(xì)胞團(tuán)時(shí)棄懸液；2)剩余腸段中加入螯合劑手動(dòng)上下顛倒振搖3 min后，懸液150×g離心3 min棄上清，此沉淀即為絨毛細(xì)胞團(tuán)；3)剩余腸段中重新加入螯合劑，150 r/min振搖5 min后棄懸液，再加入螯合劑，重復(fù)操作3次以去除腸壁上的大部分絨毛；4)重新加入螯合劑，手動(dòng)輕柔地上下顛倒，每隔2 min收集1次懸液，并加入新的螯合劑，重復(fù)4次之后，所得懸液冰上沉淀2 min，去除下層包含絨毛細(xì)胞團(tuán)的沉淀后，懸液300×g離心5 min去上清以去除單個(gè)細(xì)胞，此時(shí)獲得的沉淀即為隱窩細(xì)胞團(tuán)。

1.4絨毛與隱窩細(xì)胞富集率、絨毛相對(duì)完整率與隱窩細(xì)胞相對(duì)活率測定

在4倍光學(xué)顯微鏡視野下觀察絨毛和隱窩細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)和純度，要求單個(gè)4倍鏡視野下絨毛中隱窩細(xì)胞團(tuán)不多于3個(gè)，隱窩細(xì)胞團(tuán)內(nèi)絨毛碎片不多于3個(gè)[17]。分別測定各處理富集的絨毛和隱窩細(xì)胞重量，細(xì)胞重量占5 g小腸組織的百分比為富集率。將各處理絨毛細(xì)胞團(tuán)稀釋到相同倍數(shù)后，在單個(gè)4倍鏡視野下統(tǒng)計(jì)破損絨毛碎片的數(shù)量，每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)30個(gè)4倍鏡視野。假定每個(gè)4倍鏡視野下總絨毛數(shù)相等，通過公式(絨毛完整率=1-絨毛碎片數(shù)/總絨毛數(shù))計(jì)算出1個(gè)4倍鏡視野下的絨毛完整率，再以其中1個(gè)處理的絨毛完整率為100%，相比得到各處理的相對(duì)完整率。用臺(tái)盼蘭染色法統(tǒng)計(jì)單個(gè)隱窩細(xì)胞團(tuán)上死亡細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)處理統(tǒng)計(jì)30個(gè)細(xì)胞團(tuán)，按照與絨毛相對(duì)完整率相同的算法得到隱窩細(xì)胞相對(duì)活率。

1.5基因組DNA與總RNA提取和電泳

參照試劑盒操作說明，對(duì)分離出的絨毛和隱窩細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA與總RNA提取，用以判斷細(xì)胞核酸完整性，1%瓊脂糖凝膠電泳，Biorad成像儀攝像分析。

1.6隱窩細(xì)胞的培養(yǎng)

富集的隱窩細(xì)胞用DMEM/F-12培養(yǎng)基清洗3次，低速離心去除殘余螯合劑后等量接種于細(xì)胞培養(yǎng)用6孔板，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，分別于1、3、5、7、9 h后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測隱窩細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的變化。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測基因表達(dá)量

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測溶菌酶(LYZ)和α-防御素(DEFEN)的表達(dá)量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因[18]。根據(jù)GenBank登錄的家兔LYZ和DEFEN基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物。各基因的擴(kuò)增引物見表1。反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix ExTapTMII (2×)，1 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L)，1 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L)，1 μL cDNA，ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1　各基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1絨毛和隱窩細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)和純度

在不同EDTA濃度和溫度下，均獲得了較完整的絨毛和隱窩細(xì)胞團(tuán)。操作過程中，第2步洗脫絨毛時(shí)出現(xiàn)針尖樣細(xì)胞團(tuán)所需時(shí)間：RT各組(5～9 min)短于LT各組(7～15 min)，且EDTA濃度越高所需時(shí)間越短。第4步沉淀隱窩時(shí)，LT+5 mmol/L EDTA組隱窩洗脫量極低，且參雜大量絨毛，2 min內(nèi)洗脫物純化后僅獲得5 mg左右隱窩細(xì)胞團(tuán)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LT+10 mmol/L EDTA組。在光學(xué)顯微鏡4倍鏡下觀察，LT較RT條件下得到的細(xì)胞團(tuán)形態(tài)結(jié)構(gòu)更完整，但富集量小，LT+5 mmol/L EDTA組細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)最完整，但細(xì)胞濃度最低(圖1-A、圖1-B)；隨著溫度及EDTA濃度的升高，得到的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)完整性逐漸降低，但細(xì)胞濃度逐漸升高；在RT+25 mmol/L EDTA條件下時(shí)，盡管富集量最高，但在絨毛富集物中出現(xiàn)了較多的隱窩細(xì)胞團(tuán)，隱窩富集物中也出現(xiàn)了大量絨毛碎片(圖1-E、圖1-F)。直觀可看出，在LT+10～15 mmol/L EDTA條件下分離效果較好(圖1-C、圖1-D)。

2.2各分離條件對(duì)絨毛細(xì)胞富集率與絨毛相對(duì)完整率的影響

由圖2可知，各EDTA濃度條件下，RT組絨毛細(xì)胞富集率均極顯著高于LT組(P<0.01)，且2種溫度條件下絨毛細(xì)胞富集率均隨著EDTA濃度升高而升高。在EDTA濃度小于等于15 mmol/L時(shí)，LT組絨毛相對(duì)完整率極顯著高于RT組(P<0.01)，且隨著EDTA的濃度升高絨毛相對(duì)完整率降低；在EDTA濃度大于等于20 mmol/L時(shí)，RT組與LT組絨毛相對(duì)完整率差異不顯著(P>0.05)。

2.3各分離條件對(duì)隱窩細(xì)胞富集率與相對(duì)活率的影響

由圖3可知，各EDTA濃度條件下，RT組隱窩細(xì)胞富集率均極顯著高于LT組(P<0.01)，且2種溫度條件下隱窩細(xì)胞富集率均隨著EDTA濃度升高而升高。當(dāng)EDTA濃度小于等于10 mmol/L時(shí)，LT組隱窩細(xì)胞相對(duì)活率極顯著高于RT組(P<0.01)，且隨著EDTA的濃度的升高隱窩細(xì)胞相對(duì)活率逐漸降低；當(dāng)EDTA濃度大于等于15 mmol/L時(shí)，LT組與RT組的隱窩細(xì)胞相對(duì)活率均極低且2組間差異不顯著(P>0.05)。由圖可以看出，LT+5～10 mmol/L EDTA組與RT+5 mmol/L EDTA組的隱窩細(xì)胞相對(duì)活率較高，但LT+5 mmol/L EDTA組的隱窩細(xì)胞富集率極低，僅為(1.01±0.02)%。

圖示A與B、C與D、E與F分別為LT+5 mmol/L EDTA、LT+10 mmol/L EDTA、RT+25 mmol/L EDTA條件下分離的絨毛與隱窩細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)。

This picture showed the morphology of separated villus and crypt cells under LT+5 mmol/L EDTA (A and B), LT+10 mmol/L EDTA (C and D) and RT+25 mmol/L EDTA (E and F), respectively.

圖1絨毛和隱窩細(xì)胞富集物的形態(tài)學(xué)觀察

Fig.1Morphological observation of villus and crypt enrichments

同指標(biāo)同EDTA濃度，數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖3同。

In the same index and the same EDTA concentration, value points with different capital letters mean significant difference (P<0.01), while with no letter mean no significant difference (P>0.05). The same as Fig.3.

圖2各分離條件下絨毛細(xì)胞富集率與絨毛相對(duì)完整率

Fig.2Villus cell enrichment ratio and villus relative integrity rate under different separated conditions

圖3　各分離條件下隱窩細(xì)胞富集率與相對(duì)活率

2.4絨毛和隱窩細(xì)胞基因組DNA、總RNA保存完整性測定結(jié)果

富集的細(xì)胞團(tuán)提取DNA、總RNA后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，結(jié)果如圖4和圖5所示。各處理?xiàng)l件下，細(xì)胞基因組DNA完整，未見彌散拖尾現(xiàn)象；總RNA可見28S、18S和5S條帶，表明分離過程中細(xì)胞處于存活狀態(tài)。

A為絨毛細(xì)胞，B為隱窩細(xì)胞。RT與LT條件下EDTA濃度左起分別為5、10、15、20、25 mmol/L。圖5同。

A was villus cell, and B was crypt cell. From left to right, the concentration of EDTA was 5, 10, 15, 20 and 25 mmol/L, respectively. The same as Fig.5.

圖4絨毛和隱窩富集物基因組DNA電泳

Fig.4Electrophoresis of the genome DNA extracted from crypt and villus enrichments

圖5　絨毛和隱窩富集物總RNA電泳

2.5絨毛和隱窩細(xì)胞團(tuán)差異表達(dá)基因檢測結(jié)果

根據(jù)前述的試驗(yàn)結(jié)果，選取了綜合分離效果最佳的LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的絨毛和隱窩細(xì)胞，檢測其DEFEN與LYZ的相對(duì)表達(dá)量，由表2可知，隱窩富集物中DEFEN與LYZ的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于絨毛富集物(P<0.01)。

2.6隱窩細(xì)胞在培養(yǎng)過程中相關(guān)基因表達(dá)量變化

在LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的隱窩細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)1、3、5、7、9 h后，檢測了DEFEN與LYZ的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖6。在1～9 h過程中，DEFEN與LYZ的相對(duì)表達(dá)量均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，但在最初的1 hLYZ與DEFEN的相對(duì)表達(dá)量有低于3～9 h時(shí)的趨勢(shì)(0.05

3討論

小腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究腸道相關(guān)生理功能的重要手段，相比于各細(xì)胞系而言，原代培養(yǎng)的細(xì)胞生理性狀與體內(nèi)狀態(tài)更接近，在一定程度上能較好地反映小腸的真實(shí)生理特征[19]。為更深入的研究腸干細(xì)胞生理及潘氏細(xì)胞免疫等功能，國內(nèi)外報(bào)道了多種絨毛與隱窩細(xì)胞分離方法，常用的螯合劑為EDTA和DTT[20]。EDTA通過螯合作用可以結(jié)合并降低組織液中的鈣、鎂離子，破壞細(xì)胞之間的緊密連接，在機(jī)械力的作用下使細(xì)胞分離，因此可用于縱向分離腸絨毛與隱窩[21]。DTT能夠破壞分子間的二硫鍵，迅速地去除黏液及黏附的細(xì)菌，達(dá)到分離細(xì)胞的目的[14]。螯合劑對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，其毒性取決于螯合劑種類、濃度、作用溫度與時(shí)間[22]。動(dòng)物的年齡、生理狀況、腸段大小和腸道緊密連接狀態(tài)不同，分離條件也有所不同。

根據(jù)各成分作用原理，本研究對(duì)沿用次數(shù)較多的Flint等[15]的螯合劑配方進(jìn)行了改良，除加入一定濃度的EDTA外，還加入了5 mmol/L EGTA，并在清洗腸段時(shí)加入0.5 mmol/L DTT以快速去除黏液。在分離過程中，使用螯合劑將絨毛和隱窩細(xì)胞從小腸組織上分級(jí)洗脫下來之后，需要快速去除螯合劑以縮短螯合劑對(duì)細(xì)胞毒害的時(shí)間，且需根據(jù)絨毛與隱窩自身沉降系數(shù)不同進(jìn)行富集物的純化。離心純化絨毛時(shí)需根據(jù)試驗(yàn)動(dòng)物大小確定轉(zhuǎn)速和時(shí)間，要求離心力不應(yīng)過大(<300×g)，防止離心力對(duì)絨毛結(jié)構(gòu)造成破壞，并能避免將隱窩細(xì)胞離心混入絨毛沉淀中[22]。對(duì)于較大體型動(dòng)物的小腸，可使用自然沉降法獲得高純度的絨毛。在隱窩洗脫時(shí)不可避免地會(huì)混入少量絨毛，需要確定合適的自然沉降時(shí)間純化隱窩細(xì)胞。一般以上清液中針尖樣大小細(xì)胞團(tuán)即絨毛全部沉入底部時(shí)為合理的沉降時(shí)間[13]。

本研究結(jié)果表明，雖然各分離條件下細(xì)胞基因組DNA和總RNA均保存完整，但在不同條件下分離效果存在顯著差異。溫度越高，螯合劑濃度越大，得到的富集物越多，但細(xì)胞團(tuán)純度、絨毛完整性和隱窩細(xì)胞活率也越差，甚至?xí)?duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒害作用。首先，高EDTA濃度可提高富集率，但同時(shí)也是降低隱窩細(xì)胞活率和絨毛完整性的主要因素，本研究顯示，EDTA濃度高于15 mmol/L時(shí)，EDTA濃度對(duì)絨毛完整性和隱窩細(xì)胞活率的損傷作用遠(yuǎn)大于溫度，作為后續(xù)培養(yǎng)的材料，細(xì)胞活率和組織完整性是首要考慮的指標(biāo)，因此，分離時(shí)的EDTA濃度不宜高于15 mmol/L。其次，較高的螯合溫度可提高富集率，但同時(shí)也會(huì)降低絨毛完整性和隱窩細(xì)胞活率。對(duì)絨毛而言，溫度越高絨毛碎片越多，即使在最低EDTA濃度條件下，RT組的絨毛完整性也極顯著低于LT組，故分離溫度應(yīng)選擇低溫；對(duì)于隱窩而言，LT+EDTA濃度低于10 mmol/L組和RT+5 mmol/L EDTA組的細(xì)胞活率均較好，但LT+5 mmol/L EDTA組隱窩富集率僅有(1.01±0.02)%，細(xì)胞量已不能滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。綜合考慮絨毛和隱窩細(xì)胞的分離效果，本研究選擇LT+10 mmol/L EDTA為最適分離條件。

表2　絨毛、隱窩富集物DEFEN與LYZ的相對(duì)表達(dá)量

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same row, values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

數(shù)據(jù)柱形無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。

Value columns with no letter mean no significant difference (P>0.05).

圖6經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后隱窩富集物DEFEN與

LYZ的相對(duì)表達(dá)量

Fig.6Relative expression levels ofDEFENandLYZin crypt enrichments by cell cultured

在小腸上皮細(xì)胞中，DEFEN和LYZ主要在隱窩的潘氏細(xì)胞中表達(dá)，因而富集物中這2個(gè)基因的差異表達(dá)可以有效說明所富集細(xì)胞的純度和分離效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的隱窩富集物中DEFEN和LYZ的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于絨毛富集物，顯示分離的絨毛和隱窩細(xì)胞純度很高，達(dá)到預(yù)期分離效果。本研究對(duì)LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的隱窩細(xì)胞進(jìn)行了短時(shí)間培養(yǎng)以檢測是否達(dá)到后續(xù)研究的要求。培養(yǎng)3～9 h過程中，隱窩細(xì)胞中DEFEN與LYZ的相對(duì)表達(dá)量均未發(fā)生顯著變化，表明培養(yǎng)過程中細(xì)胞生理狀態(tài)穩(wěn)定；在最初的1 h，LYZ與DEFEN的相對(duì)表達(dá)量有低于3～9 h時(shí)的趨勢(shì)，這可能與分離過程中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏及LT造成了細(xì)胞的饑餓和應(yīng)激有關(guān)，但在隨后的培養(yǎng)中得到了恢復(fù)。這些結(jié)果表明，LT+10 mmol/L EDTA條件下分離的小腸絨毛和隱窩細(xì)胞可以滿足后續(xù)研究的要求。

4結(jié)論

① 2個(gè)溫度和5種EDTA濃度條件下對(duì)家兔小腸絨毛和隱窩細(xì)胞的分離效果有較大差異，低溫螯合時(shí)細(xì)胞富集率較低，但細(xì)胞活率較高，螯合劑中EDTA濃度越高細(xì)胞富集率越高，而細(xì)胞活率則相應(yīng)降低。

② 本研究中，LT+10 mmol/L EDTA為最佳分離條件，得到的絨毛和隱窩細(xì)胞富集率和純度較高，形態(tài)完整，細(xì)胞活率高。

③ 在37 ℃、5% CO2、無血清的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 h后的隱窩細(xì)胞依然具有較高活力，顯示分離的絨毛和隱窩細(xì)胞可用于家兔小腸生理特性相關(guān)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]PETERSON L W,ARTIS D.Intestinal epithelial cells:regulators of barrier function and immune homeostasis[J].Nature Reviews Immunology,2014,14(3):141-153.

[2]HORITA N,TSUCHIYA K,HAYASHI R,et al.Fluorescent labelling of intestinal epithelial cells reveals independent long-lived intestinal stem cells in a crypt[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2014,454(4):493-499.

[3]BEDFORD A,CHEN T,HUYNH E,et al.Epidermal growth factor containing culture supernatant enhances intestine development of early-weaned pigsinvivo:potential mechanisms involved[J].Journal of Biotechnology,2015,196-197:9-19.

[4]GRABINGER T,LUKS L,KOSTADINOVA F,et al.Exvivoculture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy[J].Cell Death & Disease,2014,5(5):e1228.

[5]VINCENT A,KAZMIERCZAK C,DUCHNE B,et al.Cryosectioning the intestinal crypt-villus axis:an ex vivo method to study the dynamics of epigenetic modifications from stem cells to differentiated cells[J].Stem Cell Research,2015,14(1):105-113.

[6]BERDASCO M,ESTELLER M.DNA methylation in stem cell renewal and multipotency[J].Stem Cell Research and Therapy,2011,2(5):42.

[7]CLEVERS H.The intestinal crypt,a prototype stem cell compartment[J].Cell,2013,154(2):274-284.

[8]TANCOS Z,NEMES C,POLGAR Z,et al.Generation of rabbit pluripotent stem cell lines[J].Theriogenology,2012,78(8):1774-1786.

[9]BEVINS C L,SALZMAN N H.Paneth cells,antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis[J].Nature Reviews Microbiology,2011,9(5):356-368.

[10]SALZMAN N H.Paneth cell defensins and the regulation of the microbiome:detente at mucosal surfaces[J].Gut Microbes,2010,1(6):401-406.

[11]EVANS G S,FLINT N,SOMERS A S,et al.The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures[J].Journal of Cell Science,1992,101(Pt 1):219-231.

[12]POTHIER P,HUGON J S.Characterization of isolated villus and crypt cells from the small intestine of the adult mouse[J].Cell and Tissue Research,1980,211(3):405-418.

[13]BJERKNES M,CHENG H.Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine[J].The Anatomical Record,1981,199(4):565-574.

[14]AYABE T,SATCHELL D P,WILSON C L,et al.Secretion of microbicidal α-defensins by intestinal Paneth cells in response to bacteria[J].Nature Immunology,2000,1(2):113-118.

[15]FLINT N,COVE F L,EVANS G S.A low-temperature method for the isolation of small-intestinal epithelium along the crypt-villus axis[J].Biochemical Journal,1991,280(2):331-334.

[16]FULLER M K,FAULK D M,SUNDARAM N,et al.Intestinal crypts reproducibly expand in culture[J].Journal of Surgical Research,2012,178(1):48-54.

[17]寧宇,王鋒超,劉登群,等.在體分離小鼠小腸隱窩絨毛上皮細(xì)胞的生化完整性研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,9(14):2610-2612.

[18]高博,楊曉農(nóng),于學(xué)輝,等.家兔GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(1):69-73.

[19]GROSSMANN J,WALTHER K,ARTINGER M,et al.Progress on isolation and short-termex-vivoculture of highly purified non-apoptotic human intestinal epithelial cells (IEC)[J].European Journal of Cell Biology,2003,82(5):262-270.

[20]CANO-GAUCI D F,LUALDI J C,OUELLETTE A J,et al.InvitrocDNA amplification from individual intestinal crypts:a novel approach to the study of differential gene expression along the crypt-villus axis[J].Experimental Cell Research,1993,208(2):344-349.

[21]CHOUGULE P,HERLENIUS G,HERNANDEZ N M,et al.Isolation and characterization of human primary enterocytes from small intestine using a novel method[J].Scandinavian Journal of Gastroenterology,2012,47(11):1334-1343.

[22]TAUC H M,TASDOGAN A,PANDUR P.Isolating intestinal stem cells from adultDrosophilamidguts by FACS to study stem cell behavior during aging[J].Journal of Visualized Experiments,2014(94):52223.

(責(zé)任編輯菅景穎)

Separation of Rabbit Intestinal Villus and Crypt Cells Using Improved Cryogenic Chelating Method and Separation Effect Identification

SHEN XuemeiLI JingZHANG GangCUI HongxiaoLIU LihuiYAO JunhuXU Xiurong*

(College of Animal Science and Technology, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China)

Abstract:This study aimed to investigate the separation method of rabbit intestinal villus and crypt cells, which can be served as the in vitro model for study on the structure and function of the intestinal epithelium. The experiment used New Zealand white rabbits as test material, and separated their intestinal villus and crypt cells under the conditions of different chelating agent concentrations [5, 10, 15, 20 and 25 mmol/L ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)] and chelating temperatures (4 and 25 ℃). Then the yield, morphology, cell viability rate and integrity of the separated cells were detected. The results showed as follows: 1) under different chelating separation conditions, all of the collected villus and crypt cells remained morphological integrity, and the genomic DNA and total RNA of these villus and crypt cells were intact. 2) The higher chelating temperature and EDTA concentration was, the greater cell enrichment rate was obtained, but the toxic effect on cell was stronger. The enrichment rate of villus and crypt cells in group LT+5 mmol/L EDTA was 7.75% and 1.01%, and that in group RT+25 mmol/L EDTA was 17.89% and 4.99%, respectively; while the relative integrity rate of villus and relative viability rate of crypt cells in the former group were 91.67% and 93.48%, and were 4.25% and 5.17% in the latter group, respectively. 3) By a comprehensive analysis, the best separation effect was observed under the condition of 4 ℃ and 10 mmol/L EDTA. 4) The relative expression levels of lysozyme and α-defensin genes from crypt enrichment separated under the optimal condition were significantly higher than those of from villus enrichment (P<0.01), and it indicated that cells in a higher purity. In addition, relative expression levels of lysozyme and α-defensin genes from the crypt cell separated under the optimal condition had no significantly change after cultured for 9 h (P>0.05), and it indicated that cells still had a higher vitality after cultured for 9 h. In conclusion, the improved cryogenic chelating method is suitable for separating rabbit intestinal villus and crypt cells effectively.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1442-1449]

Key words:crypt; villus; intestine epithelial cell; chelating agents; rabbits

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.020

收稿日期：2015-12-04

基金項(xiàng)目：陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013K02-18)

作者簡介：沈雪梅(1990—)，女，四川樂山人，碩士研究生，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控專業(yè)。E-mail: forshenxuemei@163.com *通信作者：徐秀容，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: xuxiurong@nwafu.edu.cn

中圖分類號(hào)：R329

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)05-1442-08

*Corresponding author, associate professor, E-mail: xuxiurong@nwafu.edu.cn