劉　婷　李發(fā)弟*　李　沖,2　王維民,2　汪曉娟　李　飛鄭　琛　莫負(fù)濤　王芳彬　喇永富　李寶勝

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤733300；3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州730020；4.甘肅金昌中天羊業(yè)有限公司，金昌737100)

斷奶時(shí)間對(duì)不同日齡湖羊羔羊瘤胃形態(tài)及表皮生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉婷1李發(fā)弟1*李沖1,2王維民1,2汪曉娟1李飛3鄭琛1莫負(fù)濤1王芳彬1喇永富1李寶勝4

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤733300；3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州730020；4.甘肅金昌中天羊業(yè)有限公司，金昌737100)

摘要：本試驗(yàn)旨在探討斷奶時(shí)間對(duì)不同日齡湖羊羔羊瘤胃形態(tài)及表皮生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響。采用兩因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)斷奶時(shí)間和羔羊日齡2個(gè)因子。選擇初生重[(3.51±0.57) kg]接近的54只湖羊羔羊，28日齡時(shí)隨機(jī)屠宰6只后按照同質(zhì)性原則將剩余48只湖羊分為28日齡斷奶組[(8.21±0.97) kg]和56日齡斷奶組[(8.06±0.53) kg]，分別在42、56、70和84日齡從2組中各隨機(jī)挑選6只羔羊進(jìn)行屠宰。采集瘤胃腹囊組織樣品測(cè)定瘤胃乳頭長(zhǎng)度、寬度和肌層厚度，提取瘤胃組織總RNA測(cè)定表皮生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量。結(jié)果表明：28日齡斷奶組羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度顯著高于56日齡斷奶組羔羊(P<0.05)，瘤胃肌層厚度顯著低于56日齡斷奶組羔羊(P<0.05)。斷奶時(shí)間和羔羊日齡之間的交互作用對(duì)瘤胃乳頭長(zhǎng)度和肌層厚度有顯著影響(P<0.05)。28日齡斷奶組羔羊瘤胃上皮胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)3、IGFBP5和IGFBP6表達(dá)量顯著高于56日齡斷奶組(P<0.05)。羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)1和IGFBP6表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.318，P=0.001；r=-0.520，P<0.001)；瘤胃乳頭寬度與TGFβ1表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.275，P=0.004)，與IGFBP3和IGFBP5表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.344，P<0.001；r=0.256，P=0.001)。綜上所述，28日齡斷奶促進(jìn)湖羊羔羊瘤胃乳頭發(fā)育和瘤胃表皮生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá),可能參與羔羊瘤胃早期發(fā)育的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：湖羊羔羊；早期斷奶；瘤胃形態(tài)學(xué)；發(fā)育；基因表達(dá)

羔羊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中瘤胃發(fā)育是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，斷奶后瘤胃內(nèi)發(fā)酵類(lèi)型的改變，將難以消化的纖維類(lèi)物質(zhì)降解為最終產(chǎn)物揮發(fā)性脂肪酸，瘤胃上皮對(duì)于揮發(fā)性脂肪酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)很大程度取決于角質(zhì)層厚度。研究表明，高營(yíng)養(yǎng)水平飼糧可通過(guò)增加上皮基底層細(xì)胞數(shù)量和提高細(xì)胞分化遷移率，引起棘狀細(xì)胞層和顆粒層細(xì)胞數(shù)量增加，促進(jìn)瘤胃上皮的發(fā)育[1]。瘤胃上皮細(xì)胞在胎兒期開(kāi)始分化，直到出生時(shí)，分化仍未完成。出生時(shí)，可利用顯微鏡在瘤胃上皮觀察到瘤胃乳頭，隨著年齡增長(zhǎng)和飼料的影響，瘤胃乳頭的面積、長(zhǎng)度和寬度逐漸增加[2]。幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育與采食飼料類(lèi)型直接相關(guān)。犢牛只采食牛奶時(shí)，其瘤胃乳頭并不發(fā)育；牛奶和飼草共同飼喂對(duì)瘤胃乳頭發(fā)育起不到有效的刺激作用[3]。此外，?itan等[4]試驗(yàn)表明,早期斷奶犢牛乳頭的表面積大于常規(guī)飼養(yǎng)犢牛，但Klein等[5]使用2種不同的斷奶體系,卻并未發(fā)現(xiàn)與?itan等[4]相似的結(jié)果。本試驗(yàn)對(duì)早期飼喂開(kāi)食料斷奶時(shí)間不同的湖羊羔羊瘤胃形態(tài)發(fā)育展開(kāi)研究，并揭示瘤胃乳頭發(fā)育相關(guān)基因與湖羊羔羊瘤胃發(fā)育之間關(guān)系，為羔羊早期斷奶及補(bǔ)飼提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用兩因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)斷奶時(shí)間和羔羊日齡2個(gè)因子。試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于甘肅金昌中天羊業(yè)有限公司，選取初生重[(3.51±0.57) kg]接近的54只湖羊雙羔飼養(yǎng)至28 d，隨機(jī)屠宰6只[(8.22±0.87) kg]后按同質(zhì)性原則將剩余48只湖羊分為28日齡斷奶組[(8.21±0.97) kg]和56日齡斷奶組[(8.06±0.53) kg]。28日齡斷奶組在分組當(dāng)天斷奶，56日齡斷奶組在56日齡斷奶。

1.2試驗(yàn)飼糧及飼養(yǎng)管理

所有羔羊都從7日齡開(kāi)始補(bǔ)飼開(kāi)食料1，60日齡逐漸更換開(kāi)食料2，過(guò)渡期10 d。開(kāi)食料壓縮比均為1∶6，制粒直徑均為2.5 mm。飼糧中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、鈣(Ca)和磷(P)含量測(cè)定參照《AOAC分析方法手冊(cè)》[6]及《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[7]。消化能和淀粉含量計(jì)算參照文獻(xiàn)[8-9]，開(kāi)食料各個(gè)組成原料的綿羊消化能和淀粉含量，乘以開(kāi)食料中各個(gè)原料的組成比例后，求出它們之和。開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，開(kāi)食料1和開(kāi)食料2的精粗比分別為78∶22、57∶43。

羔羊與母羊共同飼養(yǎng)在同一圈欄內(nèi)，圈欄內(nèi)安有補(bǔ)飼欄。每天08:00—10:00、12:00—14:00、18:00—20:00將羔羊關(guān)進(jìn)補(bǔ)飼欄，使其與母羊隔開(kāi)，母羊采食飼料。母羊料為常規(guī)全混合日糧(TMR)(原料為青貯玉米40%、燕麥草12%、苜蓿10%、大麥秸稈8%、油菜秸稈5%、豆渣13%、玉米9%、豆粕3%，營(yíng)養(yǎng)水平為消化能7.38 MJ/kg、粗蛋白質(zhì)7.60%、鈣0.32%、磷0.25%)。母羊采食TMR后，將飼槽和圈舍清掃干凈，避免羔羊跟隨母羊時(shí)采食母羊料，其余時(shí)間羔羊可跟隨母羊自由吮乳。圈舍每隔15 d徹底消毒1次。表2為28日齡斷奶組和56日齡斷奶組羔羊不同日齡階段日均干物質(zhì)采食量。由于羔羊隨母羊群飼，數(shù)據(jù)未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1　開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets：Fe 25 mg，Zn 40 mg，Cu 8 mg，Mn 40 mg，I 0.3 mg，Se 0.2 mg，Co 0.1 mg，VA 940 IU，VD 111 IU，VE 20 IU。

2)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、鈣和磷為實(shí)測(cè)值，其他為計(jì)算值。DM， CP， NDF， Ca and P were measured values， while the others were calculated values.

1.3樣品采集

試驗(yàn)羔羊分別于28、42、56、70和84日齡屠宰采樣，每組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)屠宰6只羔羊。屠宰后迅速采集瘤胃腹囊右側(cè)上皮組織5塊，每塊大小約為2 cm×2 cm×2 cm，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后立即放入2.0 mL Eppendorf管，投入液氮速凍，后放入-80 ℃?zhèn)溆谩２杉鑫父鼓疑掀そM織，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4，1×)反復(fù)沖洗后，立即放入4%甲醛溶液固定。將瘤胃內(nèi)容物用4層紗布過(guò)濾，濾液裝入5 mL Eppendorf管，投入液氮速凍，后放入-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表2　湖羊羔羊不同日齡階段日均干物質(zhì)采食量

1.4主要儀器與試劑

顯微鏡(IX71，日本Olympus公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(CFX96，美國(guó)Bio-Rad公司)，微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NANODrop2000，德國(guó)Thermo公司)，電泳儀(PowerPacTM，美國(guó)Bio-Rad公司)、凝膠成像儀(GelDoc-It310，美國(guó)UVP公司),氣相色譜儀(Focus GC AI 3000，德國(guó)Thermo公司)。

Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1總RNA提取

按照Trizol的使用說(shuō)明提取瘤胃腹囊上皮組織總RNA。用微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。

1.5.2實(shí)時(shí)定量PCR

參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Sythesis Super Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)中選擇一種方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)。應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5設(shè)計(jì)引物，以甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，使用20 μL的擴(kuò)增體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.4 μL上游引物(10 μmol/L)和0.4 μL下游引物(10 μmol/L)(表3)，1 μL cDNA，8.2 μL ddH2O，混合樣品。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，退火20 s，72 ℃延伸10 s，讀板2次，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min；熔解曲線條件為：60～95 ℃，每隔0.05 s讀板1次；陰性對(duì)照用1 μL ddH2O代替模板。試驗(yàn)對(duì)每個(gè)樣品檢測(cè)進(jìn)行4個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表3　基因引物序列及參數(shù)

1.5.3光鏡觀察

石蠟切片制作過(guò)程參照施恩青[10]推薦方法。瘤胃組織用冰冷的PBS沖洗干凈后，取瘤胃腹囊底部約1 cm2。將所采集的組織迅速投入4%甲醛溶液中固定，以備制作組織切片和相關(guān)測(cè)定。石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色后，選擇5張切片，每張切片選5個(gè)典型視野(組織完整)，分別測(cè)量瘤胃背囊乳頭長(zhǎng)度和寬度，瘤胃肌層的厚度。采用Image-Pro Express 6.0圖像分析系統(tǒng)軟件測(cè)量瘤胃乳頭寬度和長(zhǎng)度。

1.5.4瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定

使用氣相色譜儀(AI 3000，德國(guó)Thermo公司)測(cè)定瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量。色譜柱為HP 19091N-213毛細(xì)管柱(Aglient)。色譜條件為：進(jìn)樣口溫度220 ℃，氮?dú)饬髁?.0 mL/min，分流比40∶1，程序升溫模式(120 ℃ 3min，然后10 ℃/min至180 ℃，保持1 min)，火焰氫離子檢測(cè)器(FID)250 ℃，F(xiàn)ID的空氣、氫氣和氮?dú)饬髁糠謩e為450、40和45 mL/min。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)定量PCR樣品設(shè)置相同的閾線值，采用2-△△CT方法處理數(shù)據(jù)[11]。數(shù)據(jù)分析利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行兩因子方差分析(two-way ANOVA,LSD)，差異顯著時(shí)，采用Tukey’s法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)(n=54)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果

2.1瘤胃乳頭形態(tài)

由表4可知，斷奶時(shí)間和羔羊日齡之間的交互作用和斷奶時(shí)間對(duì)羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度和肌層厚度有顯著影響(P<0.05)。

28日齡斷奶組羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度顯著高于56日齡斷奶組羔羊(P<0.05)，但瘤胃肌層厚度顯著低于56日齡斷奶組羔羊(P<0.05)。

日齡對(duì)羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度和肌層厚度產(chǎn)生顯著性影響(P<0.05)。56、70和84日齡羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度顯著高于28和42日齡羔羊(P<0.05)，42日齡羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度顯著高于28日齡羔羊(P<0.05)。56和70日齡時(shí)，羔羊瘤胃肌層厚度顯著高于28、42和84日齡羔羊(P<0.05)。日齡對(duì)羔羊瘤胃乳頭寬度無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4　斷奶時(shí)間對(duì)不同日齡湖羊羔羊瘤胃乳頭形態(tài)的影響

Table 4　Effects of weaner time on morphological structure of rumen papillae ofHu lambs at different days of age　m

表4　斷奶時(shí)間對(duì)不同日齡湖羊羔羊瘤胃乳頭形態(tài)的影響

項(xiàng)目Items日齡Daysofage瘤胃乳頭長(zhǎng)度Papillaheight瘤胃乳頭寬度Papillawidth肌層厚度Muscularthickness28日齡斷奶組28daysofageweanergroup28741.92d513.80835.07d421280.04bc664.28844.41d561667.51ab571.921131.56ab701908.78a595.82910.76cd841737.20ab640.00867.91d56日齡斷奶組56daysofageweanergroup28741.92d513.80835.07d421035.51cd508.89849.62d561444.62b448.481080.36abc701487.37b500.791170.70a841605.07a465.30949.16bcd28日齡斷奶組28daysofageweanergroup1610.38a618.01a937.81b56日齡斷奶組56daysofageweanergroup1435.34b480.86b1012.46a28日齡28daysofage741.92c513.80835.07b42日齡42daysofage1157.77b586.58847.02b56日齡56daysofage1530.80a510.201105.96a70日齡70daysofage1698.07a548.311040.73a84日齡84daysofage1746.04a552.65906.84bSEM33.6413.2918.50

續(xù)表4項(xiàng)目Items日齡Daysofage瘤胃乳頭長(zhǎng)度Papillaheight瘤胃乳頭寬度Papillawidth肌層厚度MuscularthicknessP值P-value斷奶時(shí)間Weanertime0.028<0.0010.032日齡Daysofage<0.0010.177<0.001斷奶時(shí)間×日齡Weanertime×daysofage0.0010.7210.007

同一項(xiàng)目、同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column of the same item with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), and those with different lowercase letter superscripts differ significantly (P<0.05). The same as below.

2.2斷奶時(shí)間對(duì)湖羊羔羊表皮生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表5可知，斷奶時(shí)間和羔羊日齡之間的交互作用對(duì)羔羊瘤胃上皮轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)1、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)3、IGFBP5和IGFBP6表達(dá)量產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)。

斷奶時(shí)間對(duì)IGFBP3、IGFBP5和IGFBP6表達(dá)量有顯著影響。28日齡斷奶組羔羊瘤胃上皮IGFBP3、IGFBP5和IGFBP6表達(dá)量顯著高于56日齡斷奶組羔羊(P<0.05)。其他差異不顯著(P>0.05)。

羔羊日齡對(duì)湖羊羔羊瘤胃上皮TGFβ1、IGFBP3和IGFBP5表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)。42、70和84日齡羔羊瘤胃上皮TGFβ1表達(dá)量顯著高于28和56日齡表達(dá)量(P<0.05)。羔羊瘤胃上皮IGFBP3表達(dá)量，84日齡顯著高于28、42和56日齡(P<0.05)；56日齡顯著高于28日齡(P<0.05)。羔羊瘤胃上皮IGFBP5表達(dá)量，56日齡顯著高于28、70和84日齡(P<0.05)；70和84日齡日齡顯著高于28日齡(P<0.05)。羔羊日齡對(duì)瘤胃上皮IGFBP6表達(dá)量無(wú)顯著性影響(P>0.05)。

表5　斷奶時(shí)間對(duì)不同日齡湖羊羔羊瘤胃表皮生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items日齡Daysofage轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1TGFβ1胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3IGFBP3胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5IGFBP5胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6IGFBP684日齡84daysofage4.90a38.11a17.29bc2.51SEM0.241.620.770.17P值P-value斷奶時(shí)間Weanertime0.247<0.001<0.0010.005日齡Daysofage<0.001<0.0010.0020.511斷奶時(shí)間×日齡Weanertime×daysofage0.007<0.0010.001<0.001

2.3相關(guān)性分析

對(duì)試驗(yàn)54只羔羊瘤胃形態(tài)參數(shù)，短鏈脂肪酸(SCFA)和瘤胃上皮生長(zhǎng)相關(guān)基因進(jìn)行相關(guān)性分析。由表6可知，羔羊瘤胃液SCFA含量與瘤胃乳頭長(zhǎng)度、肌層厚度及瘤胃上皮TGFβ1、IGFBP3和IGFBP5表達(dá)量顯著正相關(guān)(r=0.562，P<0.001；r=0.349，P<0.001；r=0.205，P=0.002；r=0.219，P=0.032；r=0.265，P=0.026)，但與IGFBP6表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.616，P<0.001)。丙酸含量與羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度顯著正相關(guān)(r=0.226，P=0.007)。丁酸含量與羔羊瘤胃乳頭寬度和瘤胃上皮IGFBP5表達(dá)量顯著正相關(guān)(r=0.216，P=0.009；r=0.316，P<0.001)，與瘤胃上皮IGFBP6表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.274，P=0.005)。

羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度與瘤胃上皮TGFβ1和IGFBP6表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.318，P=0.001；r=-0.520，P<0.001)。羔羊瘤胃乳頭寬度與TGFβ1呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.275，P=0.004)，與IGFBP3和IGFBP5呈顯著正相關(guān)(r=0.344，P<0.001；r=0.256，P=0.001)。

表6　瘤胃表皮生長(zhǎng)相關(guān)基因與瘤胃形態(tài)和短鏈脂肪酸關(guān)聯(lián)性分析

續(xù)表6項(xiàng)目Items短鏈脂肪酸SCFA乙酸Acetate丙酸Propionate丁酸Butyrate瘤胃乳頭長(zhǎng)度Papillaheight瘤胃乳頭寬度Papillawidth肌層厚度Muscularthickness轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1TGFβ1胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3IGFBP3胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5IGFBP5胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6IGFBP6胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5IGFBP51.000-0.103胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6IGFBP61.000

*表示顯著相關(guān) (P<0.05)。

* meant significant correlation (P<0.05).

3討論

生長(zhǎng)因子超家族中的TGFβ控制包括細(xì)胞增殖、識(shí)別、分化和細(xì)胞凋亡等各種過(guò)程[12-13]，本試驗(yàn)中，羔羊瘤胃上皮TGFβ1表達(dá)量與瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度呈顯著負(fù)相關(guān)。有試驗(yàn)證明，TGFβ1的下調(diào)能促進(jìn)瘤胃發(fā)育[14]。TGFβ1可能抑制羔羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖和乳頭狀生長(zhǎng)，Naeem等[15]的試驗(yàn)也得到了相同的結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的促增殖作用主要受IGFBP家族的調(diào)控[16]。瘤胃內(nèi)丁酸含量影響IGFBP調(diào)節(jié)IGF1在組織細(xì)胞中活動(dòng)[17]。本試驗(yàn)羔羊瘤胃液丁酸含量與IGFBP5表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，丁酸可能會(huì)影響到IGF軸，促使其分泌促細(xì)胞分化的激素，減少促細(xì)胞凋亡激素的分泌[18]。本試驗(yàn)中28日齡斷奶組羔羊瘤胃上皮IGFBP5表達(dá)量顯著高于56日齡斷奶組，Steele等[19]試驗(yàn)證實(shí)，IGFBP5表達(dá)量上調(diào)時(shí)促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)了28日齡斷奶組瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度顯著高于56日齡斷奶組羔羊。這也與本試驗(yàn)中，IGFBP5表達(dá)量與瘤胃乳頭寬度呈顯著正相關(guān)的結(jié)果一致。IGFBP6結(jié)合IGF2優(yōu)先于IGF1，IGFBP6具有抑制IGF2的功能。在本試驗(yàn)中，羔羊瘤胃上皮IGFBP6表達(dá)量與乳頭長(zhǎng)度和寬度呈顯著負(fù)相關(guān)。這與之前Bach等[20]的試驗(yàn)中IGFBP6在瘤胃上皮具有抑制作用的結(jié)果一致。IGFBP3抑制瘤胃組織細(xì)胞IGF1的活性，瘤胃內(nèi)丁酸含量增加時(shí)，引起IGFBP3表達(dá)量下調(diào)[19,21]。但是，本試驗(yàn)中羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度與瘤胃上皮IGFBP3表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

反芻動(dòng)物瘤胃形態(tài)學(xué)研究中，瘤胃乳頭長(zhǎng)度是最重要的指標(biāo),其次是瘤胃乳頭寬度和瘤胃壁厚度[22]。斷奶前，小腸吸收是羔羊獲得能量的主要來(lái)源。羔羊采食固體飼料時(shí)，瘤胃乳頭開(kāi)始增長(zhǎng)，瘤胃黏膜開(kāi)始加厚[23]。本試驗(yàn)28～84日齡28日齡斷奶組羔羊日均干物質(zhì)采食量(582.81 g/d)高于56日齡斷奶組(552.97 g/d)。28日齡斷奶組羔羊瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度顯著高于56日齡斷奶組羔羊，28日齡斷奶組瘤胃SCFA含量與瘤胃乳頭長(zhǎng)度呈正相關(guān)。這是因?yàn)楦嵫驍嗄毯螅墒沉吭黾?，?dǎo)致瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸含量增加，促進(jìn)瘤胃發(fā)育[24]。Anderson等[25]報(bào)道28日齡斷奶犢牛瘤胃內(nèi)丙酸和丁酸含量顯著高于未斷奶犢牛。本試驗(yàn)28日齡斷奶組瘤胃丙酸含量與瘤胃乳頭寬度和肌層厚度呈正相關(guān)。有研究表明，丙酸和丁酸是影響瘤胃乳頭發(fā)育的重要因素[26-27]。此外，由于羔羊?qū)腆w飼料采食量增加，瘤胃物理性刺激增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)瘤胃乳頭的發(fā)育[28]。?itan等[4]和Stobo等[29]試驗(yàn)也證明，犢牛早期斷奶可顯著增加瘤胃乳頭長(zhǎng)度。新生反芻動(dòng)物的瘤胃壁很薄,瘤網(wǎng)胃的容積很小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，56日齡斷奶組羔羊瘤胃肌層厚度顯著高于28日齡斷奶組，Stobo等[29]試驗(yàn)也證實(shí)，隨著精料飼喂量的增加,羔羊瘤胃肌層厚度沒(méi)有顯著變化。但是，本試驗(yàn)羔羊日齡和斷奶時(shí)間的交互作用對(duì)于羔羊瘤胃肌層厚有顯著性的影響。?itan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶后犢牛瘤胃乳頭數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。本試驗(yàn)中沒(méi)有測(cè)量瘤胃乳頭數(shù)量，早期斷奶如何影響湖羊瘤胃乳頭數(shù)量變化還有待于進(jìn)一步的研究。

4結(jié)論

在本試驗(yàn)飼養(yǎng)管理模式下，28日齡斷奶能提高湖羊羔羊的開(kāi)食料采食量，且促進(jìn)瘤胃乳頭發(fā)育。羔羊瘤胃內(nèi)SCFA能促進(jìn)瘤胃上皮IGFBP3、IGFBP5和IGFBP6表達(dá)，抑制TGFβ1表達(dá)；羔羊瘤胃上皮IGFBP5表達(dá)上調(diào)與瘤胃乳頭發(fā)育呈顯著正相關(guān)。

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(責(zé)任編輯王智航)

Effects of Weaner Time on Rumen Morphology and Gene Expressions Involved in Rumen Epidermis Growth ofHuLambs at Different Days of Age

LIU Ting1LI Fadi1*LI Chong1,2WANG Weimin1,2WANG Xiaojuan1LI Fei3ZHENG Chen1MO Futao1WANG Fangbin1LA Yongfu1LI Baosheng4

(1. College of Animal Science and Technology, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China;2. Engineering Laboratory of Sheep Breeding and Reproduction Biotechnology in Gansu Province, Minqin 733300, China;3. College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University,Lanzhou 730020, China; 4. Jinchang Zhongtian Sheep Industry Co. Ltd.,Jinchang 737100, China)

Abstract:The objective of this study was to investigate the effects of weaner time on rumen morphology and gene expressions involved in rumen epidermis growth of Hu lambs at different days of age. Two-factor design was used, and the factors were weaner time and days of age of lambs. A total of 54 Hu lambs with similar birth weight [(3.51±0.57) kg] were selected, and 6 of them were randomly selected and slaughtered on 28 days of age, while the remaining animals were randomly assigned to a 28 days of age weaner group [(8.21±0.97) kg] or a 56 days of age weaner group [(8.06±0.53) kg]. Six lambs from each group were randomly selected and slaughtered at 42, 56, 70 and 84 days of age, respectively. The ventral sac sample of rumen was collected to measure rumen papilla height, width and muscular thickness, and the tissue sample was extracted total RNA to measure gene expressions involved in rumen epidermis growth. The results showed as follows: rumen papilla height and thickness in 28 days of age weaner group was significantly higher than that in 56 days of age weaner group (P<0.05), however, rumen muscular thickness in 28 days of age weaner group was significantly lower than that in 56 days of age weaner group (P<0.05). There were significant interactions of weaner time and days of age for rumen papilla height and muscular thickness (P<0.05). The expressions of insulin-like growth factor binding protein (IGFBP)3, IGFBP5 and IGFBP6 in 28 days of age weaner group were significantly higher compared with 56 days of age weaner group (P<0.05). Rumen papilla length was negatively correlated with expressions of IGFBP6 and transforming growth factor β (TGFβ)1 (r=-0.318， P=0.001； r=-0.520， P<0.001); rumen papilla width was negatively correlated with the expression of TGFβ1 (r=-0.275， P=0.004), while were positively correlated with expressions of IGFBP3 and IGFBP5 (r=0.344， P<0.001； r=0.256， P=0.001). In conclusion, the results indicate that weaning at 28 days of age can promote rumen papillae development, affect expressions of genes involved in rumen epidermis growth, and may modulate early development of rumen of Hu lambs.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1384-1393]

Key words:Hu lamb; early weaning; rumen morphology; development; gene expression

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.014

收稿日期：2016-01-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31260564)；國(guó)家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-39)

作者簡(jiǎn)介：劉婷(1985—)，女，陜西臨潼人，博士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail: lting822@sina.cn *通信作者：李發(fā)弟，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: lifd@lzu.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S826

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)05-1384-10

*Corresponding author, professor, E-mail: lifd@lzu.edu.cn