童　磊,李湘凌,吳紀南,袁　峰,周濤發(fā)

(合肥工業(yè)大學 資源與環(huán)境工程學院,安徽 合肥　230009)

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一株鐵還原菌的分離及其碳源利用特性研究

童磊,李湘凌,吳紀南,袁峰,周濤發(fā)

(合肥工業(yè)大學 資源與環(huán)境工程學院,安徽 合肥230009)

摘要:文章探究從污水處理廠污泥中篩選的一株鐵還原菌的生長特性,研究不同碳源對Fe(Ⅲ)還原的影響。結果表明:此株鐵還原菌株適宜的生長條件為pH=7、溫度為35℃、黑暗條件;碳源類型和濃度顯著影響菌株的鐵還原能力,其最適碳源濃度為1.5 mol/L,以蔗糖、葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉為碳源時,其Fe(Ⅲ)還原率依次降低,以蔗糖和葡萄糖為碳源時Fe(Ⅲ)還原率分別為81.0%和57.2%;Fe(Ⅲ)還原過程中脫氫酶活性與Fe(Ⅲ)還原率顯著正相關,脫氫酶活性能在一定程度上反映Fe(Ⅲ)還原程度。

關鍵詞:鐵還原菌;碳源;脫氫酶活性

異化鐵還原是鐵還原菌介導進行的Fe(Ⅲ)還原,該過程廣泛地存在于自然界的厭氧環(huán)境[1]。在異化鐵還原過程中鐵還原菌不僅以簡單有機物等為電子供體,而且可以偶聯(lián)難降解有機污染物氧化分解及重金屬還原等,因而鐵異化還原對環(huán)境污染修復具有重要的意義[2-3]。在異化鐵還原相關研究中,高效鐵還原菌的分離純化工作是研究異化鐵還原過程的基礎,也是利用鐵還原菌開展污染修復的基礎。迄今,研究人員從各種厭氧環(huán)境中分離得到了不同的異化Fe(Ⅲ)還原菌,這些Fe(Ⅲ)還原菌可利用的電子供體包括了纖維素、糖類、氨基酸、氫氣和有機酸等[3],如其中研究最為廣泛和系統(tǒng)的Geobacter和Shewanella分別以乙酸鹽和乳酸鹽、丙酮酸鹽為電子供體[4-5]。而微生物對碳源要求的單一性會極大地限制微生物在環(huán)境污染修復中應用。因此,研究并探明不同鐵還原菌對不同碳源的利用特征,得到可利用多種碳源的鐵還原菌對其在污染修復中應用具有重要意義。

本文從污水處理廠的污泥中分離純化鐵還原菌,以蔗糖、葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉和乙酸鈉分別作為碳源(電子供體),研究該鐵還原菌厭氧條件下Fe(Ⅲ)的還原能力,并探索不同碳源條件下脫氫酶在Fe(Ⅲ)還原過程中的意義。

1材料與方法

1.1儀器

采用722E型分光光度計、無菌操作臺、HC-2064高速離心機。

1.2培養(yǎng)基

50% LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L,酵母膏5 g/L,NaCl 2.5 g/L,調節(jié)培養(yǎng)基pH=7。

分離純化培養(yǎng)基:C6H12O6·H2O 1.0 g/L,FeCl3·6H2O 9.6 g/L,NH4Cl 0.53 g/L,KH2PO40.272 g/L,CaCl20.056 g/L,NaHCO30.252 g/L(使用量根據富集期間pH=7±0.2而定),微量元素溶液1 mL。

鐵還原培養(yǎng)基:檸檬酸鐵3.3 g/L,NH4Cl 1 g/L,CaCl2·2H2O 0.07 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,K2HPO4·3H2O 0.722 g/L,KH2PO40.25 g/L,葡萄糖10 g/L,調節(jié)培養(yǎng)基pH=7。將該培養(yǎng)基在0.1 MPa下滅菌30 min,加瓊脂粉10 g/L即為固體培養(yǎng)基。

1.3菌種來源及培養(yǎng)

菌種來源于合肥市王小郢污水處理廠的消化池污泥。

富集培養(yǎng):將20 mL污泥和180 mL分離純化培養(yǎng)基加入250 mL鹽水瓶,氮氣驅氧10 min后密封,30℃恒溫暗條件下培養(yǎng)。待溶液顏色由棕黃色變成無色時,取鹽水瓶中菌懸液繼續(xù)富集培養(yǎng)。連續(xù)富集培養(yǎng)3次后,從鹽水瓶中吸取2 mL富集培養(yǎng)液加入25 mL血清瓶中,同時添加18 mL檸檬酸鐵培養(yǎng)基,氮氣驅氧10 min后密封,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔一天搖勻,當菌液由黃色變成無色后,再連續(xù)富集3次。

分離純化:取上述最終富集所得菌液在檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基上進行平板畫線和涂布,待平板中長出細菌后,挑取形態(tài)一致、生長快的菌落接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);將培養(yǎng)所得菌液劃線和涂布,進一步分離純化菌種;重復該工作5次后,根據菌落形態(tài)和細胞的一致性判斷菌株的純化狀態(tài),選取最優(yōu)菌株。制得菌液,轉入1.5mL離心管中,4 000 r/min離心10 min,棄上清液,分離得到的菌液于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實驗設計

1.4.1菌株基本理化性質分析

觀察菌株在檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基上的菌落特征,并進行菌株革蘭氏染色試驗[6]。

1.4.2菌株生長特性

(1)pH對菌株生長的影響。將50% LB液體培養(yǎng)基的pH值用0.1 mol/L 的NaOH和HCl調至4、5、6、7、8、9,每個梯度設置3個水平,滅菌后接入2 mL菌懸液,置于30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。然后分別在第2、4、6、8、10、12、16、20、26、32、40 h用注射器在錐形瓶中取出2 mL,置于5 mL離心管中測定菌液OD值。

(2)溫度對菌株生長的影響。將配置好的培養(yǎng)基pH值調節(jié)為7，滅菌后接入2 mL菌懸液,置于溫度分別為4、15、20、30、35、40℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),每種溫度下設置3個水平。然后按上述(1)的操作測定OD值。

(3)光照對菌株生長的影響。將配置好的培養(yǎng)基pH調節(jié)為7。滅菌后接入2 mL菌懸液,置于溫度為35℃的培養(yǎng)箱中,分別采取連續(xù)光照和避光暗處理,每種處理設置3個水平。然后按上述(1)的操作測定OD值。

1.4.3不同碳源條件下的Fe(Ⅲ)還原

將純化菌液擴繁32 h后,測定菌液濃度后備用。選用碳源為蔗糖(Sue)、葡萄糖(Glu)、丙酮酸鈉(Pyr)、乙酸鈉(Ace)和乳酸鈉(Lac),以單一變量的控制方式分別添加,見表1所列。

表1　碳源添加量　mol/L

注:第1組的碳濃度為3.0 mol/L,第2～4組依次減1/2。

采用厭氧混合培養(yǎng)。分別取2 mL碳源、2 mL NH4Cl(5 g/L)和2 mL的檸檬酸鐵溶液(13 g/L)于10 mL的血清瓶中,高壓滅菌后,接種液2 mL擴繁菌液,并用滅菌后的磷酸緩沖溶液調節(jié)pH=7±0.2,氮氣驅氧5 min，用膠塞和鋁蓋密封[7]后置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)。每組實驗中不添加碳源為平行樣。

1.5分析方法

(1)菌懸液濃度。比濁法測定,由于細菌懸液的濃度與光密度(OD值)成正比,因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度,選用600 nm波長分光光度計,以同樣培養(yǎng)基作為空白對照,并對培養(yǎng)液從0 h起依次進行測定,對濃度大的菌懸液用未接種的液體培養(yǎng)基適當稀釋后測定,使其OD值在0.10～0.65以內。

(2)Fe(Ⅱ)測定。采用鄰菲啰啉比色法,在培養(yǎng)的1個周期內每天于同一時刻進行采樣,每次采樣時取待測樣品1瓶,搖勻,用注射器平行取樣品液2.0 mL 置于含2 mL的1+3 HCl(HCl與H2O的體積比為1∶3)的50 mL比色皿中,重復3組,分別加入5 mL鐵緩沖溶液與鄰菲羅啉溶液2 mL,顯色5～10 min,在510 μm處以水為參比測量吸光度。

(3)脫氫酶活性測定。脫氫酶活性(dehydrogenase activity,DHA)測定采用TTC分光光度法[8],將吸取的1 mL樣品溶液置于含有2 mL Tris-HC緩沖液(pH值為8.4)、0.5 mL 3.6 g/L Na2SO3溶液和0.5 mL 20 g/L TTC溶液的離心管中,重復3組,置37℃恒溫水浴中避光反應2 h后加入0.5 mL 甲醛終止酶反應。再加5 mL丙酮作為萃取劑[9],37℃200 r/min振蕩萃取10 min,于3 500 r/min離心5 min,取上清液于492 nm下測定吸光度。通過標準曲線計算生成的TF含量,定義1 h產生1 mg/L為1個脫氫酶活力單位(U)[10]。

1.6動力學模型

本文采用Logistic方程描述微生物介導的異化Fe(Ⅲ)還原過程[11],Logistic方程為:

其中,t為培養(yǎng)時間;ct表示培養(yǎng)時間t時體系中Fe(Ⅱ)的濃度;a為體系中Fe(Ⅲ)還原的最大潛勢,即Fe(Ⅱ)的最大累積量;b為模型參數;k為反應的速率常數,即 Fe(Ⅱ)的累積速率常數。Fe(Ⅲ)還原反應的最大反應速率Vmax=0.25ak;最大反應速率對應的時間tVmax=ln(b/k)。

數據處理采用Curve Expert1.4。

2實驗結果和討論

2.1菌株基本生長特性

通過富集及分離純化等過程,獲得一株具有良好Fe(Ⅲ)還原能力的菌株。該菌株在檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基上的菌落較小,呈圓形或散狀生長,菌落顏色為淺黃色,參考文獻[12]初步判別該菌為革蘭氏陰性菌,短桿狀,長2 μm、寬0.8 μm,如圖1所示。

圖1　菌株在檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基及顯微鏡下形態(tài)圖

pH值、溫度、培養(yǎng)時間及光照條件對菌株生長[13]的影響如圖2所示。

圖2　鐵還原菌在不同條件下菌懸液的光密度值(OD600)變化

圖2a顯示,在30℃、暗培養(yǎng)條件下,pH值分別為4、5、6、7、8、9時,菌液濃度差異較大,菌液濃度在pH=7是菌株生長最佳條件,其次為pH=6和pH=8,pH=9和pH=5再次之,當培養(yǎng)體系pH<4時不能存活。此株鐵還原菌耐酸堿性能力較強。

在pH=7、暗培養(yǎng)條件下,溫度對菌株生長的影響如圖2b所示。由圖2b可見,30℃為菌株生長最適溫度,其次為30℃,而當溫度為20、15℃時,菌株生長速度顯著下降,溫度降至4℃時菌株停止生長。溫度為40℃時,培養(yǎng)時間超過16 h后,隨著培養(yǎng)時間的增加,菌濃度顯著下降,菌株表現出較差的耐熱性。

在pH=7、溫度為35℃條件下,暗培養(yǎng)條件下的菌量比光照條件下量多,因此暗培養(yǎng)有利于菌株的生長。

因此,該株鐵還原菌最佳的生長條件是pH=7、溫度為35℃、暗培養(yǎng)。

從培養(yǎng)時間上來看,在pH=7、溫度為35℃、暗培養(yǎng)條件下,菌株在LB培養(yǎng)基中停滯期比較短,培養(yǎng)12 h左右生長曲線就進入對數期,26 h后進入穩(wěn)定生長期,到32 h時的生物量最大,故在后續(xù)的碳源利用特征試驗中,采用擴繁32 h處于菌株穩(wěn)定期的菌液進行鐵還原實驗。

2.2碳源對鐵還原菌Fe(Ⅲ)還原能力的影響

2.2.1碳源濃度對Fe(Ⅲ)還原的影響

碳源濃度對Fe(Ⅲ)還原的影響如圖3所示(圖注數值的單位為mol/L)。

圖3中碳濃度為1.5 mol/L時分別對應蔗糖、葡萄糖、乙酸鈉、乳酸鈉和丙酮酸鈉濃度為0.125、0.25、0.75、0.5、0.5 mol/L,以此類推。結果表明,未添加碳源時,培養(yǎng)體系中幾乎未檢測到Fe(Ⅱ),說明微生物Fe(Ⅲ)還原過程需要有電子供體才能進行。添加不同碳源時,反應體系中均可以檢測到Fe(Ⅱ)的累積。當添加碳濃度為1.5 mol/L時,Fe(Ⅱ)的累積量明顯大于0.75、0.375 mol/L碳濃度條件下的累積量。以蔗糖為例,碳濃度添加量為3.0、1.5、0.75、0.375 mol/L時,反應體系中Fe(Ⅱ)累積量分別為17.52、17.38、9.24、7.66 mg/L,1.5 mol/L碳濃度條件下Fe(Ⅱ)累積量分別是0.75、0.375 mol/L碳源濃度時Fe(Ⅱ)累積量的1.9和2.3倍,而3.0 mol/L的碳源濃度下Fe(Ⅱ)累積量并無顯著的增加。由此可見,較低的碳源濃度因不能提供足夠的電子供體,不利于Fe(Ⅲ)還原過程進行;過高的碳源濃度也未顯著增加Fe(Ⅱ)的累積量,多余的碳源不能有效被菌株利用。因此,選擇1.5 mol/L的碳源濃度是異化鐵還原高效碳源濃度。

圖3　鐵還原菌利用不同碳源作為電子供體的Fe(Ⅱ)質量濃度變化

2.2.2碳源類型對Fe(Ⅲ)還原的影響

在添加不同碳源條件下,反應體系中Fe(Ⅱ)的積累量存在明顯的差異,以蔗糖為碳源的體系中Fe(Ⅱ)累積量最多,其后依次為葡萄糖、丙酮酸鈉、乙乳酸鈉和乳酸鈉。在1.5 mol/L最佳碳濃度條件下,蔗糖、葡萄糖、丙酮酸鈉、乙乳酸鈉和乳酸鈉為碳源時,體系中Fe(Ⅲ)還原的比例依次為81.0%、57.2%、42%、30.8%、18.3%?？梢娫摼哉崽菫樘荚磿r的Fe(Ⅲ)還原能力最強,而以蔗糖無氧分解終產物乳酸鈉為碳源時的Fe(Ⅲ)還原能力最弱。與文獻[14]分離得到的一株鐵/硝酸鹽還原菌38.9%的Fe(Ⅲ)還原率(碳源為葡萄糖)相比,該菌表現出較強的Fe(Ⅲ)還原,而與文獻[15]以葡萄糖為碳源的6株菌24.52%～92.11%的Fe(Ⅲ)還原能力相比,仍具有較好的Fe(Ⅲ)還原能力。

不同碳源條件下,隨著時間的變化,體系中Fe(Ⅲ)還原變化趨勢有較明顯的差異。以葡萄糖和蔗糖作為碳源時,前7 d,體系中Fe(Ⅱ)迅速累積,之后體系中Fe(Ⅱ)累積量緩慢增加,到第9天時趨于穩(wěn)定。以丙酮酸鈉為碳源時,體系中的Fe(Ⅱ)累積量迅速增加,在第3天時Fe(Ⅱ)累積量已經達到最大累積量(以第11天計)的85.2%,表明鐵還原菌以丙酮酸鈉為碳源時能在較短時間內達到較高的Fe(Ⅲ)還原水平。乙酸鈉和乳酸鈉為碳源時,體系存在1～2 d的緩沖期,此時體系中Fe(Ⅱ)累積水平低,之后Fe(Ⅱ)累計量迅速增加,乳酸鈉碳源體系中在第6天時Fe(Ⅱ)累積量已經達到最大累積量的82.3%,之后增幅降低,直到第10天左右Fe(Ⅱ)累計量趨于穩(wěn)定。綜上可見,從Fe(Ⅲ)還原率角度來看,蔗糖、葡萄糖是最佳碳源;從還原所需時間角度來看,丙酮酸鈉是較好的碳源選擇。

2.3Fe(Ⅲ)還原動力學

采用Logistic方程擬合不同碳源對Fe(Ⅲ)還原的影響,結果見表2所列。

表2　不同碳濃度下鐵還原菌介導的Fe(Ⅲ)還原的動力學擬合

結果表明,丙酮酸鈉為碳源時,乙酸鈉濃度為1.5、0.375 mol/L時,不能用Logistic方程進行Fe(Ⅲ)還原動力學擬合,其他不同碳源條件下均能用Logistic方程擬合Fe(Ⅲ)還原動力學過程。從還原最大潛勢a看,蔗糖和葡萄糖作為電子供體時Fe(Ⅲ)還原的最大潛勢a隨著碳源濃度增大而增大,而以乳酸鈉和乙酸鈉為電子供體時Fe(Ⅲ)還原的最大潛勢與碳源濃度無明顯的關聯(lián)。從反應速率常數k看,Fe(Ⅱ)累積速率常數隨添加的碳源濃度的降低而增加。高濃度的蔗糖(0.25、0.125 mol/L)和高濃度葡萄糖(0.5、0.25 mol/L)的最大反應速率Vmax比同系低濃度的蔗糖(0.062 5、0.031 25 mol/L)和葡萄糖(0.125、0.062 5 mol/L)的最大反應速率Vmax高出1倍,而高、低濃度乳酸鈉和乙酸鈉體系中最大反應速率無明顯差別。最大反應速率對應時間(tVmax)均在第3～6天,表明鐵還原菌要經過2～3 d生長期后大量增殖,參與Fe(Ⅲ)還原。Fe(Ⅲ)還原率均是高濃度比低濃度的高,其中蔗糖和葡萄糖隨著濃度的加倍,還原率有較大的變化,而乳酸鈉和乙酸鈉的還原率很接近,與濃度的大小沒有關系。這表明蔗糖和葡萄糖對此株鐵還原菌有更大的還原潛勢。

2.4不同碳源的脫氫酶活性變化

碳濃度為1.5 mol/L時,研究不同碳源條件下脫氫酶活性,結果如圖4所示。

圖4　鐵還原菌利用不同碳源(c=1.5 mol/L)作為電子供體的脫氫酶活性變化

由圖4可知隨著培養(yǎng)時間增加,各碳源體系中脫氫酶活性增加,然而增長的幅度和時間有很大不同。前3 d中,不同碳源體系中脫氫酶活性差異較小,第4天開始,不同碳源條件下的脫氫酶活性差異顯著,到第11天時,丙酮酸鈉、蔗糖、葡萄糖、乙酸鈉和乳酸鈉條件下的脫氫酶活性依次為120.41、90.23、67.75、47.20、20.47 mg/(L·h),丙酮酸鈉體系中的脫氫酶活性為乳酸鈉體系中的脫氫酶活性的6倍。

每種碳源體系中的脫氫酶活性與Fe(Ⅱ)濃度的關系,見表3所列。由表3可知,蔗糖、葡萄糖、乙酸鈉和乳酸鈉碳源體系中Fe(Ⅱ)積累量與脫氫酶活性均為顯著正相關關系,而丙酮酸鈉碳源體系中Fe(Ⅱ)積累量與脫氫酶活性的相關系數明顯低于其他4種碳源體系,但兩者間仍為正相關。

表3　Fe(Ⅱ)濃度(y)與脫氫酶活性(x)的相關性

注:當α=0.05,r0.05=0.602 1;當α=0.01,r0.01=0.734 8;當α=0.001,r0.001=0.847 1。

對比不同碳源間的脫氫酶活性與Fe(Ⅱ)濃度可以發(fā)現,雖然丙酮酸鈉碳源體系中脫氫酶活性顯著大于其余碳源體系,但其Fe(Ⅱ)濃度小于蔗糖和葡萄糖碳源體系。這可能是由于蔗糖、葡萄糖在無氧條件下酵解為丙酮酸,提供給鐵還原菌更多的能量,而丙酮酸還原生成乳酸的過程產能低,提供給鐵還原菌可利用的能量低,從而導致丙酮酸鈉碳源體系中雖然有高的脫氫酶活性,但體系中Fe(Ⅱ)積累較少。因此,脫氫酶活性可以在某種程度上反映碳源的利用程度,也能間接反映異化鐵還原程度[16]。

綜合不同碳源條件下的脫氫酶活性及Fe(Ⅱ)累積濃度分析,該菌具有利用多種碳源為電子供體異化還原Fe(Ⅲ)的能力,在環(huán)境污染物控制方面具有較好的應用前景,在污水處理中具有較好的應用前景。

3結論

(1)分離獲得的鐵還原菌可耐受pH值為5～9的酸堿度變化,其最佳生長條件為pH=7、溫度為35℃、黑暗條件。

(2)在不同碳源條件下,異化鐵還原最佳碳濃度均為1.5mol/L。蔗糖和葡萄糖是該菌株的最佳碳源,其后依次是丙酮酸鈉、乙酸鈉和乳酸鈉。蔗糖和葡萄糖為碳源時,Fe(Ⅲ)還原率分別為81.0%和57.2%。

(3)碳源明顯影響著異化鐵還原過程中的脫氫酶活性,各碳源體系脫氫酶活性依次為丙酮酸鈉>蔗糖>葡萄糖>乙酸鈉>乳酸鈉。碳源體系中,除去丙酮酸鈉,脫氫酶活性與Fe(Ⅱ)累積量呈顯著正相關,脫氫酶活性在某種程度上能反應異化鐵還原程度。

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(責任編輯張淑艷)

Isolation of an iron-reducing bacteria strain and its carbon source utilization

TONG Lei,LI Xiang-ling,WU Ji-nan,YUAN Feng,ZHOU Tao-fa

(School of Resources and Environmental Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:An iron-reducing bacteria strain was isolated from municipal sewage sludge.The characteristics of the bacteria strain and the influence of carbon sources on the Fe(Ⅲ)reduction were studied.The results showed that the strain grew best when pH value was 7 and the temperature was 35℃ under the darkness condition.The iron reduction ability of the bacteria strain was significantly influenced by the type and the concentration of carbon source.The optimum concentration of the carbon source was 1.5 mol/L.When sucrose,glucose,sodium pyruvate,sodium acetate,sodium lactate were serviced as carbon sources respectively,Fe(Ⅲ)reduction rate of the strain reduced in turn.When sucrose and glucose were used as carbon sources,Fe(Ⅲ)reduction rate of the strain was 81.0% and 57.2% respectively.There was a significant positive correlation between the dehydrogenase activity of the strain and Fe(Ⅲ)reduction rate.Dehydrogenase activity could reflect the Fe(Ⅲ)reduction degree.

Key words:iron-reducing bacteria;carbon source;dehydrogenase activity

收稿日期：2015-01-04；修回日期：2015-03-04

基金項目：環(huán)保部公益性行業(yè)科研專項經費資助項目(201009041-03)

作者簡介：童磊(1988-),男,安徽蕪湖人,合肥工業(yè)大學碩士生;周濤發(fā)(1964-),男,安徽廬江人,博士,合肥工業(yè)大學教授,博士生導師.

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.04.021

中圖分類號:X172

文獻標識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)04-0536-07

袁峰(1971-),男,廣西桂林人,博士,合肥工業(yè)大學教授,博士生導師;