王小俠，張 玨，李 建，夏詠梅，潘 紅

1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省原子醫(yī)學研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫 2140631

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異甜菊醇對骨肉瘤細胞U-2OS生長的影響

王小俠1，張 玨2，李 建2，夏詠梅1，潘 紅1

1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省原子醫(yī)學研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫 2140631

［摘要］背景與目的：骨肉瘤惡性程度高、發(fā)展迅速、易轉移且致殘致死率高；其常用化療藥物的長期應用不良反應較大，存在著一定的局限性。異甜菊醇具有四環(huán)二萜結構，是很多抗癌藥的合成起始劑，但其自身的抗癌活性鮮有報道。該研究旨在考察異甜菊醇對骨肉瘤細胞U-2OS生長的影響，并初步探討其作用機制。方法：通過MTT實驗檢測異甜菊醇對U-2OS細胞生長的影響；分別通過Hoechst 33342和PI染色分析細胞狀態(tài)，檢測細胞活性氧和細胞膜電位；用流式細胞術分析異甜菊醇處理細胞后細胞周期；通過蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的差異表達。結果：異甜菊醇對骨肉瘤細胞U-2OS的抑制呈現出時間和劑量依賴性；染色和流式細胞術實驗顯示，異甜菊醇對骨肉瘤細胞U-2OS作用24 h觀察到細胞S期周期阻滯，48 h時觀察到細胞凋亡；隨著藥物濃度升高活性氧顯著增多，細胞膜電位逐漸降低，促凋亡相關蛋白Bax的表達上調，抗凋亡相關蛋白Bcl-2的表達下調。結論：異甜菊醇對人骨肉瘤U-2OS細胞有抑制生長作用，其作用機制可能與上調Bax及下調 Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達有關。

［關鍵詞］異甜菊醇；U-2OS；生長抑制；凋亡

Correspondence to: XIA Yongmei E-mail: ymxia@jiangnan.edu.cn

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年的股骨遠端、脛骨近端，其惡性程度高、發(fā)展迅速、易轉移至肺、腦等組織，預后較差，致殘、致死率高［1-3］。骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展是多途徑、多因素共同作用的復雜過程［4-5］。常用化療藥物如氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、順鉑（cisplatin，DDP）等長期應用不良反應較大，存在著一定的局限性［6-7］。

異甜菊醇具有四環(huán)二萜結構，有保護心?。?］、抗高血壓［9］、降低血糖生成［10］以及細胞毒作用［11］和抗腫瘤［12-13］等生物活性。異甜菊醇是很多抗癌藥的合成起始劑，但其自身的抗癌活性鮮有報道。本研究就異甜菊醇對人骨肉瘤細胞系U-2OS增殖、凋亡的影響及可能的作用機制進行初步探討，為異甜菊醇應用于人骨肉瘤治療提供理論依據。

1　材料和方法

1.1主要試劑及儀器

5-FU購自美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、Hoechst 33342、PI、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］、細胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白檢測試劑盒、抗體稀釋液、ECL化學發(fā)光試劑盒、活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA分子探針)和線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)均購自上海碧云天生物技術有限公司，Bcl-2、Bax和β-actin兔抗單克隆抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz公司，異甜菊醇(isosteviol)由實驗室制備（HPLC檢測純度為99%)。所有化學試劑都是分析純。

超凈工作臺(SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺)購自蘇州凈化設備有限公司，μQuant酶標儀購自美國 Bio-Tek公司，XDS-1A倒置相差顯微鏡、BX51TRF熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，3111生化培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，FACSAria流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司，ChemiDoc MP凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細胞株U-2OS購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。細胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃、CO2體積分數為5%的飽和濕度下培養(yǎng)，取對數生長期細胞試驗。

1.3MTT法檢測［14］

將對數生長期的細胞用0.25%胰蛋白酶消化后以4×104個/mL的濃度接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸出孔內培養(yǎng)基，然后每孔加200 μL含有一定濃度5-FU、異甜菊醇藥物的培養(yǎng)基，溫育后每孔分別加入20 μL MTT溶液(用PBS溶解，5 mg/mL)，于培養(yǎng)箱溫育4 h后，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解結晶，在微量振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀在570 nm下測定吸光度。細胞生長抑制率=(1- D實驗組570 nm/D對照組570 nm)×100%。用倒置顯微鏡觀察不同藥物濃度作用24、48 h后96孔板內細胞形態(tài)及生長情況，并顯微拍照。

1.4Hoechst 33342和PI雙染熒光法［15］

將對數期細胞消化，吹打均勻，調整細胞濃度為5×104個/mL鋪板，各孔100 μL，設置對照組，放于培養(yǎng)箱過夜，細胞貼壁后吸出上清液，測試組分別加入200 μL不同終濃度的藥物，作用24、48 h 后，小心吸除上層培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞，先加入Hoechst 33342染液37℃避光溫育15 min，吸出染液。再加入PI染液(終濃度均為10 μg/mL，以PBS溶解)進行雙標記染色，37℃避光溫育15 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。

1.5PI單染流式細胞術檢測細胞周期［16］

將對數生長期細胞消化，鋪6孔板，細胞懸液20×104個/mL每孔加1 mL。放入培養(yǎng)箱中過夜。待6孔板內細胞貼壁后，吸取上清液，每孔加入不含血清的培養(yǎng)基1 mL饑餓處理過夜使細胞周期同步。將相應濃度的藥物加入6孔板內，設置對照組。作用24、48 h后將孔內上清液吸出，每孔加入消化液1 mL，將消化下來的細胞和上清液一起放于離心管離心 (200×g，離心3 min)，倒掉上清液，加1 mL PBS吹打重懸，再離心3 min。倒掉上清液，加入70%乙醇2 mL吹打成懸浮液放于4℃冰箱中固定4 h以上。固定好后取出細胞，200×g，離心3 min，分兩次用PBS清洗去除乙醇，離心去除PBS，加入PI染液 （50 μg/mL RNase，0.1% TritonX-100，0.1 mmol/L EDTA，50 μg/mL PI），4℃冰箱溫育30 min。用流式細胞儀檢測，數據分析使用軟件Modifit LT 3.2.1。

1.6異甜菊醇對U-2OS細胞活性氧的影響

原位裝載DCFH-DA分子探針，用熒光共聚焦顯微鏡直接觀察［17］。由于細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，以細胞中DCF的熒光強度表征細胞內活性氧的水平。按1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L。異甜菊醇作用24 h后去除細胞培養(yǎng)液，6孔板每孔加入稀釋好的DCFH-DA 1 mL，37℃細胞培養(yǎng)箱內溫育20 min，用PBS輕輕洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

1.7原位裝載JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位［16，18-19］

藥物作用24 h后用PBS輕輕洗滌細胞2次，吸取500 μL 緩沖液，加入1 μL JC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液；每孔加入取50 μL JC-1工作液，于37℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中溫育15~20 min，吸棄工作液，用緩沖液洗2次；再每孔加入50 μL緩沖液，用熒光顯微鏡觀察橙紅色和綠色熒光的變化，通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化，從橙紅色熒光到綠色熒光的轉變標示著細胞膜電位的下降。

1.8蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測凋亡相關基因蛋白水平表達［19］

將處于對數生長期的細胞接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后加入含有異甜菊醇的培養(yǎng)基，溫育24 h后收集細胞，加入細胞裂解液并在冰上裂解5 min，然后置于-80℃和37℃反復凍融3次使細胞充分裂解，于高速離心機(4℃ 2 400×g)離心15 min后取上清液，即為細胞蛋白液。以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照每孔50 μg的總蛋白量上樣，經12% SDS-PAGE電泳后再轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用質量濃度為5%的脫脂奶粉室溫封閉條帶1 h后，再用1∶1 000比率稀釋的一抗在4℃下溫育過夜。TBST溶液漂洗條帶3次后再用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶1 000)室溫溫育1 h，最后加入等體積混合的ECL化學發(fā)光試劑A液和B液后進行檢測，用Image Lab 4.0軟件(Bio-Rad，USA)分析條帶。

1.9統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析，組間比較采用方差分析進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

2.1異甜菊醇對 U-2OS細胞生長的作用

以5-FU為對照，異甜菊醇對U-2OS細胞生長的作用如圖1，作用前后細胞形態(tài)變化見圖2。MTT實驗結果顯示，異甜菊醇作用24、48 h后的IC50值分別為148.75和86.69 μg/mL。在所觀察劑量(25～500 μg/mL）下，異甜菊醇對U-2OS細胞增殖的抑制作用呈明顯的時間依賴性和劑量依賴性。異甜菊醇對骨肉瘤細胞作用后，細胞密度下降，通透性變差，失去原有的形狀，變圓，細胞質固縮，碎片增多，且隨藥物濃度增大和作用時間延長致死現象越明顯，與MTT實驗結果對應（圖2）。

圖 1　5-FU和異甜菊醇對U-2OS細胞生長的作用Fig. 1 U-2OS cells’ growth in the presence of 5-FU and isosteviol

圖 2　異甜菊醇作用48 h后細胞形態(tài)Fig. 2 Cell morphology after the treatment of isosteviol for 48 h

2.2異甜菊醇對U-2OS細胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst 33342和PI染色顯示，異甜菊醇處理組的細胞密度明顯下降，出現亮藍色，細胞體積減小，核染色質濃集。在濃度高于150 μg/mL時，異甜菊醇作用后的U-2OS細胞呈現出較多的月形甚至碎裂，染色體碎裂、濃集細胞被染成亮藍色或者淡紅色，有的出現凋亡小體(圖3)。

2.3異甜菊醇對U-2OS細胞周期的影響

異甜菊醇作用后，隨其濃度升高U-2OS細胞凋亡比例增加，24 h出現Sub-G1凋亡狀態(tài)峰；作用48 h后凋亡比例大幅上升，這與圖3染色實驗的相應凋亡形態(tài)對應一致(圖4)。S期細胞比例隨異甜菊醇濃度升高而逐漸減少。與對照組相比，作用組S期細胞比例降低了27.62%，說明在異甜菊醇作用24 h后呈現S期阻滯現象(圖5)。

2.4異甜菊醇對U-2OS細胞活性氧的影響

異甜菊醇對U-2OS作用24 h后，活性氧含量與異甜菊醇濃度呈正相關，提示異甜菊醇能增加其活性氧的產生(圖6)。

2.5異甜菊醇對對線粒體膜電位的影響

異甜菊醇對U-2OS作用24 h后，隨異甜菊醇濃度升高綠色熒光顯著增多，橙色熒光顯著降低［19］，且有明顯的劑量依賴性，表明細胞膜電位逐漸降低(圖7)。

2.6異甜菊醇對凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組相比，異甜菊醇作用后在高劑量（200 μg/mL）時明顯下調U-2OS細胞抗凋亡蛋白Bcl-2［14］的表達(P<0.01)。50、100和200 μg/mL濃度的異甜菊醇都使U-2OS細胞促凋亡蛋白Bax［14］的表達水平顯著升高(P<0.01)，且呈現出濃度梯度效應(圖8)。

圖 3　異甜菊醇作用骨肉瘤細胞U-2OS后的形態(tài)觀察Fig. 3 Hoechst 33342 and PI staining of isosteviol-treated U-2OS cells

圖 4　流式細胞術檢測異甜菊醇對U-2OS細胞作用后細胞周期Fig. 4 The cell cycle analysis of U-2OS cells treated with isosteviol by flow cytometry

圖 5　異甜菊醇作用后細胞各周期比例Fig. 5 The proportion of each cell cycle after isosteviol treatment

圖 6　異甜菊醇對U-2OS作用24 h后活性氧狀況Fig. 6 Reactive oxygen species generation affected by different concentrations of isosteviol （×400）

圖 7　異甜菊醇對U-2OS細胞膜電位影響Fig. 7 U-2OS cell membrane potential affected by isosteviol （×400）

圖 8　Western blot檢測異甜菊醇對U-2OS細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig. 8 Expression of U-2OS cells apoptosis-related proteins after treatment with isosteviol for 24 h

3　討 論

在本實驗中，MTT檢測表明，異甜菊醇對U-2OS有明顯的抑制增殖作用，而Hoechst 33342和PI雙染熒光檢測發(fā)現異甜菊醇作用24 h時有少量凋亡出現，48 h作用時出現大量凋亡狀態(tài)細胞，且在一定濃度范圍內呈現劑量依賴性。流式細胞術檢測結果表明，24 h時出現S期細胞周期阻滯，細胞DNA直方圖出現Sub-G1峰，在作用48 h后大量細胞出現凋亡，在一定范圍內隨異甜菊醇濃度升高凋亡比例逐漸升高，說明異甜菊醇促進U-2OS細胞凋亡的作用且有濃度依賴性。

較高的活性氧可作用于線粒體，促使線粒體膜通透性改變、線粒體膜電位下降、細胞色素C從線粒體內膜解離至膜間隙［20］。線粒體跨膜電位下降源于線粒體的膨脹；內膜的膨脹導致外膜的破裂，從而使與細胞凋亡有關的重要因子釋放到細胞質中，致使細胞整體結構破壞、功能紊亂，發(fā)生凋亡。而實驗發(fā)現作用24 h后U-2OS細胞內的活性氧明顯增加且呈現濃度依賴性，且隨異甜菊醇濃度升高線粒體膜電位明顯降低。由此可以推測異甜菊醇作用24 h后可能刺激細胞產生過量活性氧，使膜脂質過氧化作用而破壞線粒體膜完整性［21］，導致膜電位下降促進細胞凋亡［22-23］。而定位于細胞質的細胞色素C可以啟動半胱天冬酶的級聯(lián)活化，由半胱天冬酶3啟動凋亡［24］，其中活性氧的升高和線粒體膜電位的降低被視為凋亡的早期事件［25］。

再者，Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細胞色素C等從線粒體釋放，具有抗凋亡作用，而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放促進細胞凋亡。而實驗表明抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達不斷降低，而促凋亡基因Bax的蛋白表達不斷升高，且呈濃度依賴性。因此推測，異甜菊醇通過促進活性氧的產生，降低細胞膜電位，破壞細胞膜完整性，上調Bax的表達、下調Bcl-2的表達而促進U-2OS細胞的凋亡。綜上所述，異甜菊醇可以改變骨肉瘤U-2OS細胞周期進程并發(fā)生凋亡，從而抑制U-2OS細胞生長。

［參 考 文 獻］

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The effect of isosteviol on growth of human osteosarcoma cell lines U-2OS

WANG Xiaoxia1, ZHANG Jue2, LI Jian2, XIA Yongmei1, PAN Hong1(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of College of Chemical and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China; 2. Key Laboratory of Nuclear Medicine of Ministry of Health, Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Wuxi 214063, Jiangsu Province, China)

［Key words］Isosteviol; U-2OS; Growth inhibition; Apoptosis

［Abstract］Background and purpose: Osteosarcoma, a highly malignant bone tumor, develops rapidly. The current medicines for osteosarcoma present some limitations with serious side effects of long-term use. Isosteviol has the structure of tetracyclic diterpene which is the starting material of many anti-cancer drugs. However, its anti-tumor activity has been rarely reported. This study investigated the effect of isosteviol on proliferation of human osteosarcoma cell line U-2OS. Methods: The effect of isosteviol on U-2OS cell proliferation was assayed by MTT method. Cellular morphologic changes were observed under an inverted phase contrast microscope. The cell condition was observed with Hoechst 33342 and PI staining. Generation of reactive oxygen species and cell membrane potential were detected as well. The cell cycles were analyzed with flow cytometry. The expressions of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax were measured by Western blot assay. Results: The result indicates that isosteviol suppressed the growth of U-2OS cells in time- and concentration-dependent manner. Isosteviol could cause S phase cell cycle arrest at 24 h and apoptosis at 48 h. With the increased drug concentration, reactive oxygen species increased significantly, and the membrane potential gradually reduced. In addition, isosteviol treatment enhanced the expression of Bax but reduced that of Bcl-2. Conclusion: The inhibition of isosteviol on cell growth of U-2OS cells was possibly caused by promoting apoptosis through regulating the apoptosis-related protein expressions, such as the enhancement of Bax and reduction of Bcl-2expression.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.03.005

中圖分類號：R738.1

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)03-0230-08

基金項目：國家自然科學基金（31171752，31371837）。

通信作者：夏詠梅 E-mail:ymxia@jiangnan.edu.cn

收稿日期：（2015-09-10 修回日期：2015-12-20）