武 丹，楊 昕，朱君玲，王紅英，李洪濤，潘 歡，何鴻昌，任顯顯，潘澤民

1.石河子大學新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子大學醫(yī)學院生物化學教研室，新疆 石河子 832002；2.新疆醫(yī)科大學自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院病理科，新疆 烏魯木齊 830000；3.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院病理科，新疆 喀什 844000；4.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物學教研室，新疆 烏魯木齊 830011

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新疆維吾爾族婦女子宮頸癌DBC1基因啟動子甲基化分析

武 丹1，楊 昕2，朱君玲3，王紅英4，李洪濤1，潘 歡1，何鴻昌1，任顯顯1，潘澤民1

1.石河子大學新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子大學醫(yī)學院生物化學教研室，新疆 石河子 832002；2.新疆醫(yī)科大學自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院病理科，新疆 烏魯木齊 830000；3.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院病理科，新疆 喀什 844000；4.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物學教研室，新疆 烏魯木齊 830011

［摘要］背景與目的：近年來，表觀遺傳學研究已經成為癌癥研究的一個新方向。大量研究結果顯示，表觀遺傳修飾的異常改變與癌癥有著十分密切的聯系，全基因組范圍內的表觀遺傳修飾改變已經成為癌癥的新標志。該研究旨在探討膀胱癌缺失基因1（deleted in bladder cancer 1，DBC1）啟動子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的關系及與人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染的相關性，分析其能否作為高敏感性及特異性的工具用于子宮頸癌篩選。方法：用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法對43例正常子宮頸組織、35例子宮頸上皮內瘤樣變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織以及54例子宮頸癌組織進行HPV16、HPV18感染的檢測；運用甲基化特異性PCR方法檢測上述組織DBC1基因啟動子甲基化狀況；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）方法檢測10例甲基化陰性的正常子宮頸組織和10例甲基化陽性的子宮頸癌組織中DBC1基因mRNA表達情況。結果：正常子宮頸組織、CIN組織及子宮頸癌組織中HPV16的感染率分別為18.6%、34.3%和68.5%；HPV18的感染率分別為2.3%、8.6% 和16.7%；DBC1基因發(fā)生甲基化率分別為23.3%、40.0%和87.0%；在79例高級別宮頸損傷及子宮頸癌樣本中，其中50例HPV16/18感染陽性，29例HPV16/18感染陰性；陽性組中DBC1基因發(fā)生甲基化率88.0%，陰性組甲基化率為55.2%（P＜0.05）；10例甲基化陽性子宮頸癌組織中DBC1基因mRNA表達水平明顯低于10例甲基化陰性正常子宮頸組織（P＜0.05）。結論：DBC1基因甲基化可能作為新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的分子標志物，結合HPV16/18感染檢測有助于子宮頸癌的診斷。

［關鍵詞］子宮頸癌；DBC1基因甲基化；HPV16/18；基因表達

Correspondence to: PAN Zemin E-mail: panteacher89@sina.com

子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例50萬人左右，80%在發(fā)展中國家［1］。我國的子宮頸癌患病率和病死率均約占世界的1/3［2］。新疆是我國子宮頸癌高發(fā)區(qū)，尤其在南疆，子宮頸癌是當地維吾爾族婦女死亡的主要原因之一。新疆維吾爾族婦女子宮頸癌患病率高達（459～590）/10萬，病死率為15.78/ 10萬，明顯高于生活在同一個環(huán)境下的其他民族［3］。人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是子宮頸癌發(fā)生的最重要的因素［4］，但是子宮頸癌的病因與多種因素有關。研究表明，表觀基因變化可以引起子宮頸癌的發(fā)生［5］。DNA甲基化可以有效用于子宮頸癌的早期篩查。

膀胱癌缺失基因1（deleted in bladder cancer 1，DBC1）在許多癌癥中都表現雜合性缺失，是目前發(fā)現的惡性腫瘤組織中的甲基化新基因，研究發(fā)現該基因可以作為甲基化標志物用于篩查子宮頸癌［4］。本研究旨在分析DBC1基因在新疆維吾爾族婦女子宮頸癌中的甲基化狀況，探討基因甲基化與子宮頸癌發(fā)生及與HPV16/18感染的相關性。

1　資料和方法

1.1研究對象

所有標本來自于2010年5月—2014年12月石河子大學醫(yī)學院第一和第三附屬醫(yī)院、喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院未經化療或放療維吾爾族婦女子宮頸病變患者的手術切除或活檢新鮮組織標本，均經過病理確診且獲得患者知情同意。其中正常對照組4例，子宮頸上皮內瘤樣變（cervical intraepithelia neoplasia，CIN）組35例，子宮頸癌組54例?；颊吣挲g23～73歲，平均年齡47歲。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA提取

取約30 mg組織，使用TIANamp FFPE DNA Kit DP331-02試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，置于-20 ℃冰箱的保存。

1.2.2 HPV感染檢測

H P V 1 6 / 1 8病毒采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增檢測，反應體系（25 μL）為PCR Mix 12.5 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，DNA模板1 μL，滅菌水10.5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。擴增片段大小為268 bp，反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)內照相鑒定。引物設計見表1。

表 1　引物信息Tab. 1 Primer information

1.2.3DNA亞硫酸鹽修飾

取約1 μg DNA，使用CpGenomeTMDNA Modification Kit S7820試劑盒（美國Chemicon公司），經過修飾、初步脫鹽、二次脫鹽對DNA進行亞硫酸鹽修飾并純化，將修飾后的DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4甲基化特異性PCR檢測

對所有標本進行甲基化與非甲基化檢測，反應體系與反應條件均一致。引物參照文獻［6］，使用Bio-Rad梯度PCR儀進行擴增。反應體系（25 μL）為 Mix 12.5 μL（北京康為世紀生物科技有限公司，2×PCR goldstar Best Mastermix），正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌水9.5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 1 min，59 ℃1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。甲基化產物片段大小為253 bp，非甲基化產物片段大小為269 bp，用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

1.2.5RNA提取

挑選甲基化陰性的正常子宮頸組織和甲基化陽性的子宮頸癌組織各10例，取約30 mg組織，使用TRIzol法（美國Invitrogen公司）提取總RNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。

1.2.6實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-tim fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

取約1 μgRNA，使用RevertAid First Stran cDNA Synthesis Kit、K1622試劑盒（美國Thermo公司）進行逆轉錄，步驟按說明書操作。β-acti作為內部參照，DBC1基因引物序列參照美國哈佛大學ParaBioSys數據庫中的數據。20 μ反應體系包括：2×SYBR Green 10.0 μL（美國QIAGEN公司），正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，cDNA模板1.5 μL，滅菌水7.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，最后95 ℃1 min，56 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。每個樣本重復3次實驗。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理分析，計數資料及相關性分析均采用χ2檢驗；RTFQ-PCR檢測結果的數據為計量資料，采用兩獨立樣本t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

2.1HPV病毒感染情況

正常子宮頸組織、CIN組織及子宮頸癌組織中HPV16的感染率分別為18.6%、34.3%和68.5%；HPV18的感染率分別為2.3%、8.6%和16.7%。HPV16感染率兩兩比較發(fā)現：正常組與CIN組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CIN組與子宮頸癌組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常組與子宮頸癌組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。HPV18感染率兩兩比較，正常組與子宮頸癌組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。HPV16/18感染率兩兩比較，CIN組與子宮頸癌組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常組與子宮頸癌組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

表 2　HPV16/18病毒感染情況Tab. 2 The infection status of HPV16 and 18

表 3　DBC1基因甲基化狀況Tab. 3 The frequency of DBC1 gene promoter methylation

2.2甲基化特異性PCR電泳及測序結果

43例子宮頸正常組織中10例（23.3%）發(fā)生DBC1基因甲基化，35例CIN組織中14例（40.0%）發(fā)生甲基化，而54例子宮頸癌組織47例（87.0%）發(fā)生甲基化。正常組與CIN組比較，DBC1基因甲基化率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CIN組與子宮頸癌組比較，DBC1基因甲基化率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常組與子宮頸癌組比較，DBC1基因甲基化率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。隨著疾病的發(fā)展，甲基化的概率呈現出增加的趨勢（表3）。

通過甲基化特異性PCR方法檢測發(fā)現，甲基化擴增條帶為253 bp，非甲基化擴增條帶為269 bp（圖1）。

圖 1　DBC1基因甲基化特異性PCR結果Fig. 1 The result of methylation-specific PCR of DBC1 gene M: Marker （100-600 bp）； m: Methylation-specific PCR products； U: Unmethylation-specific PCR products； 1， 2: Cervical cancer tissues；3, 4: Cervical intraepithelial neoplasia tissues; 5, 6: Normal cervical tissues

DBC1基因甲基化特異性PCR產物測序后發(fā)現，甲基化產物CpG位點的C均不變，其余C變成了T；而非甲基化產物中所有C都變成了T，包括CpG位點（部分未修飾完全未變成T，圖2）。

2.3DBC1基因甲基化與臨床病理因素之間的相關性

研究發(fā)現，在54例子宮頸癌組織中，患者年齡、FIGO分期與DBC1基因甲基化之間無相關性（P＞0.05，表4）。

2.4DBC1基因甲基化與HPV感染的關系

在25例高級別子宮頸損傷（CINⅡ、CINⅢ）和54例子宮頸癌組織樣本中，50例HPV16/18陽性，29例HPV16/18陰性。陽性組中44例（88.0%）發(fā)生甲基化，陰性組中16例（55.2%）發(fā)生甲基化，兩組之間甲基化率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.828，P＜0.05）。結果顯示，DBC1基因甲基化與HPV16/18感染之間可能相關（表5）。

2.5DBC1基因表達量分析

10例甲基化陽性的子宮頸癌組織中DBC1基因mRNA表達量為0.642±0.272，10例甲基化陰性的正常子宮頸組織mRNA表達量為1.052±0.187，甲基化陽性組中DBC1基因mRNA表達水平明顯低于甲基化陰性組（P＜0.05，圖3）。

圖 2　DBC1基因MSP產物測序結果Fig. 2 The sequencing results of MSP products of DBC1 gene Above: Methylation-specific PCR products； Below: Unmethylation-specific PCR products （the reverse sequencing results）； Arrows for the CpG loci

表 4　DBC1基因甲基化與臨床病理因素之間的相關性Tab. 4 The correlation of methylation of DBC1 gene promoter with clinical factors in cervical cancer patients （chi-square test）

表 5　DBC1基因甲基化與HPV16/18在子宮頸癌組織中的分布情況Tab. 5 The distribution of methylation of DBC1 gene promoter and infection of HPV16/18 in cervical cancer tissues

圖 3　DBC1基因mRNA表達水平Fig. 3 The expression of DBC1 gene at mRNA level

3　討 論

腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要機制是各種物理、化學、生物致癌因素造成DNA序列變異，從而導致細胞生長、分化失控，最終導致腫瘤的形成。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現DNA序列以外的調控機制異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中更為普遍［7］，這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調控機制稱為表觀遺傳學機制，DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的重要組成部分，不改變基因序列而引起基因表達的失活，并且可以引起腫瘤的發(fā)生［8］。陳蔚等［9］通過對LMX1A基因的6個位點和PAX1基因的9個位點的甲基化定量分析，發(fā)現子宮頸癌組甲基化水平明顯高于CIN組。前期課題組也同樣發(fā)現，在子宮頸癌組織中經常出現抑癌基因高甲基化而失活，如IFITM1、NKX6-1等基因［10-11］。

感染高危型HPV是子宮頸癌發(fā)生的重要因素［12］。雖然HPV感染是子宮頸癌的發(fā)生原因，但HPV病毒感染不是導致子宮頸癌發(fā)生的唯一因素，有研究表明少于1%的感染HPV的女性可以發(fā)展為子宮頸癌［13］。研究報道，經過早期發(fā)現與及時治療后，患者的子宮頸癌病死率出現顯著下降，幅度為20%～60%［14］。因此通過早診早治，可以降低子宮頸癌的發(fā)病率及病死率?；蚣谆治鼋Y合HPV感染檢測用于子宮頸癌的診斷，將對新疆維吾爾族婦女這一嚴峻的健康問題產生重大而深遠的影響。

DBC1基因定位在染色體9q32-33［15］。有研究發(fā)現，DBC1基因的低表達與膀胱癌預后差有關［16］，DBC1基因可抑制非小細胞肺癌細胞系的生長［17］。前期有研究發(fā)現，在臺灣省婦女子宮頸癌組織中DBC1基因發(fā)生甲基化率為93%，存在高甲基化的狀態(tài)［4］。本研究中正常子宮頸組織DBC1基因發(fā)生甲基化率為23.3%，CIN組織甲基化率為40.0%，子宮頸癌組織DBC1發(fā)生甲基化率為87.0%，隨著病變的發(fā)展，甲基化率呈現出逐漸增加的趨勢。其中，子宮頸癌組明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義；高級別的子宮頸損傷DBC1基因發(fā)生甲基化率顯著高于低級別子宮頸損傷。提示DBC1基因發(fā)生甲基化導致基因失活可能與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關。同時發(fā)現，在54例子宮頸癌組織中，患者年齡、FIGO分期與DBC1基因甲基化率之間無顯著相關性（P＞0.05）。

本研究中正常組、CIN組及子宮頸癌組的HPV16感染率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義；HPV18感染率兩兩比較，只有正常組與子宮頸癌組差異有統(tǒng)計學意義。感染以HPV16為主，這與文獻報道一致［18］。本研究對79例高級別子宮頸損傷及子宮頸癌樣本進行了統(tǒng)計，其中50例HPV16/18感染陽性，29例HPV16/18感染陰性；陽性組中DBC1基因甲基化發(fā)生率為88.0%，陰性組甲基化率為55.2%（P＜0.05），兩者之間差異有統(tǒng)計學意義。提示HPV16/18感染與DBC1基因甲基化之間可能相關，在子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。

根據上述分析，DBC1基因甲基化可能與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關，并與HPV感染有一定的相關性。隨著DNA甲基化研究的逐漸深入，甲基化檢測在腫瘤早期診斷的作用進一步明確，為去甲基化藥物在腫瘤的治療方面提供了希望。

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Analysis of DBC1 gene promoter methylation in cervical cancer tissues of Uyghur women in Xinjiang

WU Dan1, YANG Xin2, ZHU Junling3, WANG Hongying4, LI Hongtao1, PAN Huan1, HE Hongchang1, REN Xianxian1, PAN Zemin1(1.Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2. Department of Pathology, Chinese Medicine Hospital of Autonomous Region, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3. Department of Pathology, the First People Hospital of Kashgar, Kashgar 844000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4. Department of Microbiology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China)

［Key words］Cervical cancer； DBC1 gene methylation； HPV16/18； Gene expression

［Abstract］Background and purpose: In recent years， epigenetics research has become a new direction of cancer research. A large number of results have shown that the abnormal changes of epigenetic modifications have close connection with cancer. Genome-wide epigenetic modifications have become new markers for cancer. This study aimed to investigate the methylation of the promoter of DBC1 gene in cervical cancer tissues of Uyghur women in Xinjiang， to explore the correlation between the gene methylation and the infection of HPV， and to evaluate whether it can be used as a tool with high sensitivity and specificity for cervical cancer screening. Methods: This study detected the infection of HPV16， 18 in 43 normal cervical tissues， 35 cervical intraepithelial neoplasia tissues and 54 cervical cancer tissues using the polymerase chain reaction （PCR） method. The methylation of the promoter of DBC1 gene in above-mentioned tissues was detected by the methylation-specific PCR method. The expression of DBC1 at mRNA level was measured by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR） in 10 methylation-negative normal cervical tissues and 10 methylation-positive cervical cancer tissues. Results: In normal cervical tissues， CIN tissues and cervical cancer tissues，the infection ratios of HPV16 were 18.6%， 34.3% and 68.5%， respectively； the infection ratios of HPV18 were 2.3%， 8.6% and 16.7%， respectively； and the methylation ratios of DBC1 gene were 23.3%， 40.0%， 87.0%， respectively. In 79 highgrade squamous intraepithelial lesions （CINⅡ and Ⅲ） and cervical cancer tissues， 50 of 79 were infected with HPV16/18，while 29 of 79 were negative. The methylation ratio of DBC1 gene was 88.0% in HPV16/18 infection positive group while the methylation ratio was 55.2% in negative group （P＜0.05）. The expression of DBC1 gene at mRNA level in 10 methylation-positive cervical cancer tissues was significantly lower than that in the 10 methylation-negative normal cervical tissues （P＜0.05）. Conclusion: The methylation of DBC1 gene may become a molecular marker to detect cervical cancer of Uyghur women in Xinjiang. DBC1 gene methylation combined with HPV16/18 infection test can be used to aid diagnosis of cervical cancer.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.03.002

中圖分類號：R737.33

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)03-0208-07

基金項目：兵團國際科技合作項目（2013BC003）；國家科技支撐計劃（“十二五”計劃）（2013BAI05B0503）；國家自然科學基金項目（30860302，30660193）；石河子大學重大科技攻關計劃項目（gxjs2013-zdgg05）；高層次人才科研啟動資金專項（RCZX201333）。

通信作者：潘澤民 E-mail:panteacher89@sina.com

收稿日期：（2015-09-22 修回日期：2015-12-14）