朱 滔，張 平，鄭 偉

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310009；2.浙江省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，浙江 杭州 310022

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卵巢癌血清相關(guān)miRNAs的篩選及其臨床意義

朱 滔1，張 平2，鄭 偉1

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310009；2.浙江省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，浙江 杭州 310022

［摘要］背景與目的：卵巢癌預(yù)后較差，發(fā)現(xiàn)時(shí)通常是晚期，需找尋與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的診治方法。該研究檢測(cè)miRNA在上皮性卵巢癌患者術(shù)前外周血清及良性卵巢腫瘤患者外周血清中表達(dá)情況的差異，篩選差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA并分析其與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征、預(yù)后等的關(guān)系。方法：定制研究相關(guān)的48種miRNA表達(dá)譜芯片，通過(guò)TaqMan低密度微陣列芯片，篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）法驗(yàn)證篩選的miRNA在卵巢良、惡性腫瘤患者血清中的表達(dá)情況，選擇具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA行大樣本驗(yàn)證并分析其與腫瘤分期、組織病理及預(yù)后等的關(guān)系。結(jié)果：通過(guò)TaqMan低密度微陣列芯片篩選和RTFQ-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-125b在上皮性卵巢癌患者血清中的表達(dá)高于良性腫瘤患者（P=0.039），miR-125b在早期患者中的表達(dá)量高于晚期患者（P=0.003），術(shù)后無(wú)殘余腫瘤患者表達(dá)量高于術(shù)后有殘余腫瘤患者（P=0.013）。血清miR-125b高表達(dá)有利于卵巢癌患者無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）延長(zhǎng)（P=0.003），但對(duì)總生存期（overall survival，OS）無(wú)明顯影響（P=0.069）。結(jié)論：miR-125b在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，與患者預(yù)后相關(guān)，是預(yù)測(cè)卵巢癌復(fù)發(fā)的潛在基因，但在腫瘤不同期別的表達(dá)情況發(fā)生變化，在早期作用比較明顯，在晚期或腫瘤殘余較多的患者表達(dá)較不明顯，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［關(guān)鍵詞］上皮性卵巢癌；miRNA表達(dá)譜芯片；miR-125b；預(yù)后

Correspondence to: ZHENG Wei E-mail: zhengwei@zju.edu.cn

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科腫瘤之首。我國(guó)婦女的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，近20年來(lái)其占女性全部惡性腫瘤死亡的構(gòu)成比上升92.92%［1］。調(diào)查顯示，早期（Ⅰ期）上皮性卵巢癌患者的5年生存率高于85%［2］。然而，75%以上的卵巢癌患者在晚期確診，Ⅲ期卵巢癌患者的5年生存率小于40%，Ⅳ期卵巢癌患者的5年生存率小于20%［2-3］。卵巢癌預(yù)后較差，主要與卵巢癌診斷均為較晚期及現(xiàn)有的治療方法對(duì)不能手術(shù)者療效欠佳有關(guān)。因此，找尋與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的診治方法迫在眉睫。

非編碼單鏈RNA分子（microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA）是長(zhǎng)度為19～24 nt的非編碼小分子RNA，它在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)作用于信使RNA（mRNA）3’端的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，從而使mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞變化過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，如細(xì)胞周期、分化及凋亡［4］。近年miRNA是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究顯示，在血液腫瘤及實(shí)體腫瘤中miRNA的表達(dá)發(fā)生了變化［5］。miRNA在不同類型腫瘤中的表達(dá)是獨(dú)特的，由于作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制的不同，同一種miRNA在不同的細(xì)胞中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，同時(shí)，miRNA還參與腫瘤轉(zhuǎn)移及其他特性［6］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在組織和細(xì)胞中的表達(dá)表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性［7］；而且miRNA在外周血中的表達(dá)同樣具有腫瘤相關(guān)性和組織特異性，其表達(dá)穩(wěn)定性更為顯著［8-9 ］，能夠穩(wěn)定地被檢測(cè)并且提示腫瘤狀態(tài)。

miRNA在卵巢癌組織及血清中的相關(guān)研究顯示，miRNA在包括卵巢癌在內(nèi)的腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤的組織類型及預(yù)后相關(guān)［10-11］，miRNA在卵巢癌患者與健康人中有不同的表達(dá)譜，且在組織、細(xì)胞和血清中的表達(dá)水平相當(dāng)，基于血清檢測(cè)具有創(chuàng)傷小、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，本研究通過(guò)檢測(cè)卵巢良、惡性腫瘤患者血清中miRNA表達(dá)差異，分析其差異和臨床病理特征之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究血清中miRNA在卵巢癌中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1　資料和方法

1.1一般資料

病例組血清樣本取自2009年2月—2012年1月在浙江省腫瘤醫(yī)院收治行手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者共135例，年齡37～78歲，平均中位年齡54歲。參照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（Internationa Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO分類標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：早期（Ⅰ期和Ⅱ期33例，晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）102例；漿液性腺癌93例，非漿液性卵巢癌患者為42例；病理分級(jí)G1、G2級(jí)分化者18例，G3級(jí) 106例，缺失1例；術(shù)后有殘余腫瘤62例，無(wú)殘余腫瘤71例，缺失2例。同時(shí)收集60例卵巢良性上皮性腫瘤患者臨床血清樣本為對(duì)照組。血清樣本取自患者入院后術(shù)前空腹時(shí)肘靜脈全血10 mL，置于未加抗凝試劑的試管中，標(biāo)本采集后在室溫下靜置1 h，離心后（1 680 ×g）去上清液，置于EP管中，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2主要材料和試劑

血清miRNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定制miRNA預(yù)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄引物池、TaqMan低密度微陣列芯片和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescen quantitative polymerase chain reaction，RTFQ PCR）試劑購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，RTFQ-PCR反應(yīng)miR-125b基因標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3研究方法

前期數(shù)據(jù)挖掘，定制研究相關(guān)的48種miRNA表達(dá)譜芯片。定制研究相關(guān)miRNA表達(dá)譜芯片，通過(guò)TaqMan低密度微陣列芯片，檢測(cè)挖掘的miRNA在部分上皮性卵巢癌患者血清、卵巢良性腫瘤血清樣本中的表達(dá)差異情況，10 張TaqMan低密度微陣列芯片總共篩選了135例上皮性卵巢癌患者中的18例血清及60例良性血清中的16例血清，每個(gè)樣本篩查48種miRNA。再利用RTFQ-PCR技術(shù)在20例上皮性卵巢癌患者血清及18例良性卵巢腫瘤患者血清中進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA的表達(dá)情況，經(jīng)以上兩次篩查驗(yàn)證，最終確定目的miRNA。在135例上皮性卵巢癌患者血清與38例卵巢良性腫瘤患者血清中進(jìn)一步驗(yàn)證目的miRNA的表達(dá)水平并分析了其與卵巢癌患者的生存預(yù)后及相關(guān)臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。

1.4隨訪

所有卵巢癌患者經(jīng)手術(shù)治療后均進(jìn)行電話隨訪，術(shù)后2年平均3個(gè)月隨訪1次，3年及以后每半年隨訪1次，本次隨訪時(shí)間為2015年6 月10日?；颊叩臒o(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）為3～69個(gè)月，中位PFS為28個(gè)月?？偵嫫冢╫verall survival，OS）為4～75個(gè)月，平均中位生存期為40個(gè)月。卵巢癌復(fù)發(fā)人數(shù)為58例，死亡人數(shù)為44例。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié) 果

2.1卵巢癌血清相關(guān)miRNAs的篩選結(jié)果

通過(guò)TaqMan低密度微陣列芯片，檢測(cè)挖掘的miRNA在部分上皮性卵巢癌患者血清、卵巢良性腫瘤血清樣本中的表達(dá)差異情況，10張TaqMan低密度微陣列芯片總共篩選了135例上皮性卵巢癌患者中的18例血清及60例良性血清中的16例血清，其中miR-20a （P=0.953）、miR 125b（P=0.044）、miR-126（P=0.209）在卵巢良、惡性腫瘤血清中表達(dá)有差異（P＜0.05）。采用RTFQ PCR在135例上皮性卵巢癌患者血清與38例卵巢良性腫瘤患者血清中進(jìn)一步驗(yàn)證miR-125b的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-125b在上皮性卵巢癌患者血清中的表達(dá)量高于卵巢良性腫瘤患者（P=0.039，圖1）。

圖 1　RTFQ-PCR檢測(cè)上皮性卵巢癌患者血清miR-125b表達(dá)量與卵巢良性腫瘤患者血清中表達(dá)量的關(guān)系Fig. 1 Significant up-regulation of miR-125b in the serum of thmalignant ovarian cancer as compared with that in the benign ovarian tumor detected by RTFQ-PCR

2.2miR-125b表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征關(guān)系

將miR-125b在135例上皮性卵巢癌患者血清中的表達(dá)量與患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1。術(shù)后無(wú)殘余腫瘤組血清miR-125b表達(dá)量高于術(shù)后有殘余腫瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）；早期患者的血清miR 125b表達(dá)量高于晚期患者的血清表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）；血清miR-125b表達(dá)量在不同病理類型（P=0.937）和分化程度（P=0.782）上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3miR-125b表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

將135例上皮性卵巢癌患者血清miR-125b表達(dá)量分為高表達(dá)組及低表達(dá)組。Kaplan-Meier曲線顯示，miR-125b表達(dá)水平與患者PFS密切相關(guān)，高表達(dá)miR-125b的患者PFS更長(zhǎng)（P=0.035），在OS方面無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)（P=0.069，圖2、3）。

表 1　miR-125b表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征關(guān)系Tab. 1 The relationship between the expression level of serum miR-125b and clinical pathological features of epithelial ovarian cancer

圖 2　135例卵巢癌患者中miR-125b表達(dá)水平與患者PFS的關(guān)系Fig. 2 The relationship between miR-125b expression levels in serum of malignant ovarian cancer with PFS

圖 3　135例卵巢癌患者中miR-125b表達(dá)水平與患者OS的關(guān)系Fig. 3 The relationship between miR-125b expression levels in serum of malignant ovarian cancer with OS

3　討 論

卵巢癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是婦科腫瘤中致死率最高的腫瘤［12］。由于其臨床癥狀隱匿，卵巢癌患者大部分在晚期確診，其5年生存率為30%［13］，預(yù)后不良。依據(jù)不同的起源，卵巢癌可分為上皮性腫瘤、性索間質(zhì)腫瘤及惡性生殖細(xì)胞腫瘤。臨床上以上皮性卵巢癌常見(jiàn)。上皮性卵巢癌進(jìn)一步分為5種組織類型，即透明細(xì)胞型、子宮內(nèi)膜型、黏液型、漿液型和未分化型［14］。

卵巢癌的發(fā)生與基因表達(dá)密切相關(guān)，近期miRNA與腫瘤研究是熱點(diǎn)之一，為惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展研究提供了一種新思路。Iorio等［15］首次在卵巢癌及卵巢正常組織中全基因組范圍內(nèi)比較了miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)約30種miRNA表達(dá)有差異。隨后其他研究也顯示，卵巢癌組織中有表達(dá)失調(diào)的miRNA［16-17］。

研究表明，在各種組織中穩(wěn)定表達(dá)的多種miRNA在外周血液中能夠被檢測(cè)到［18］。Chung等［19］發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌患者血清、組織、腹水中，有88種miRNA表達(dá)升高，95種miRNA表達(dá)降低。Wei等［20］報(bào)道，miR-212在卵巢癌組織及血清中低表達(dá)。Shapira等［21］發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者與正常人血清中有22種表達(dá)不同的miRNA，良性及卵巢癌患者血清中有6種差異表達(dá)的miRNA。本研究應(yīng)用TaqMan低密度微陣列芯片篩選了卵巢良、惡性腫瘤患者血清中48 種miRNA的表達(dá)情況，并進(jìn)一步以RTFQ-PCR技術(shù)驗(yàn)證篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)僅miR-125b在上皮性卵巢癌患者血清中的表達(dá)高于卵巢良性腫瘤患者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。卵巢良、惡性腫瘤血清miRNA表達(dá)情況的差異有助診斷卵巢癌，為找尋新的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)提供新思路。

miR-125b有兩個(gè)前體：miR-125b-1和miR-125b-2，其編碼基因分別在人類11號(hào)和21號(hào)染色體上，但是它們具有相同的成熟miR-125b堿基序列［22］。miR-125b在不同腫瘤中作用不一樣，其表達(dá)情況不同可用于疾病預(yù)后的評(píng)估。Cui等［23］分析了260例晚期非小細(xì)胞肺癌患者血清的miR-125b表達(dá)量與臨床特征、化療反應(yīng)及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR 125b在Ⅳ期患者、腫瘤病理分化差的患者及對(duì)鉑類化療治療無(wú)反應(yīng)的患者血清中表達(dá)均高于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-125b的高表達(dá)與患者較差的生存顯著相關(guān)（P＜0.05），miR-125b是判斷患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。這提示miR-125b或許是非小細(xì)胞肺癌患者血清有意義的標(biāo)志物，可用于預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展，監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)及檢測(cè)疾病復(fù)發(fā)。Zhang等［24］的研究結(jié)果顯示，miR-125b在侵襲性乳腺癌組織中低表達(dá)，miR-125b表達(dá)越低，患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高（P＜0.05），5年生存率也明顯低于miR-125b高表達(dá)患者（53.8% v 81.8%，P=0.002）。多因素及單因素分析顯示，低表達(dá)的miR-125b是乳腺癌患者不利的獨(dú)立因素。

miR-125b在各種腫瘤組織中報(bào)道較多，但是在腫瘤血清中的作用還未有廣泛的研究。本研究經(jīng)TaqMan低密度微陣列芯片篩選出miR 125b，進(jìn)一步通過(guò)RTFQ-PCR技術(shù)在135例上皮性卵巢癌患者血清中分析其表達(dá)水平與腫瘤分期、腫瘤分化程度、病理類型、患者術(shù)后殘余腫瘤狀況及生存預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在135例上皮性卵巢癌患者血清中，早期患者血清miR-125b的表達(dá)量高于晚期患者血清的表達(dá)量。芯片篩選及RTFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌患者血清的miR-125的表達(dá)量高于卵巢良性腫瘤患者血清的表達(dá)量（P＜0.05）；然而，miR-125b在無(wú)殘余腫瘤患者血清的表達(dá)量高于有殘余腫瘤患者血清的表達(dá)量（P＜0.05），原因在于早期患者術(shù)后幾乎無(wú)肉眼殘余腫瘤，而在晚期卵巢癌患者中，有殘余腫瘤的患者較多，而miR-125b在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，所以在上皮性卵巢癌早期的作用比較明顯，在晚期或腫瘤殘余較多的患者表達(dá)較不明顯。miR-125b表達(dá)量高的患者在PFS上有優(yōu)勢(shì)（P＜0.05），在OS方面無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)（P＞0.05），這提示miR-125b是一個(gè)潛在的預(yù)測(cè)卵巢癌復(fù)發(fā)的基因。因卵巢癌預(yù)后是多因素參與，因此可能還有其他影響OS的因素。

由于作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制的不同及多樣性，同一種miRNA在不同的細(xì)胞中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用。本研究結(jié)果提示，miRNA正是因?yàn)橥ㄟ^(guò)mRNA在轉(zhuǎn)錄后起作用，因此它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能會(huì)作用于癌基因或者抑癌基因表達(dá)的mRNA，從而在腫瘤的不同期別的表達(dá)情況發(fā)生變化。本研究結(jié)果提示，在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中也可能有其他基因參與調(diào)控，從而在不同期別引起miR-125b表達(dá)不同，因此miR-125b在無(wú)殘余腫瘤患者血清的表達(dá)量高于有殘余腫瘤患者血清的表達(dá)，早期術(shù)后無(wú)肉眼殘余腫瘤高于晚期術(shù)后有殘余腫瘤的患者表達(dá)。

本研究以TaqMan低密度微陣列芯片篩選上皮性卵巢癌與卵巢良性腫瘤外周血清中有差異表達(dá)的miRNA，并進(jìn)一步以RTFQ-PCR技術(shù)驗(yàn)證篩選的miRNA及分析臨床意義，結(jié)果顯示miR-125b在上皮性卵巢癌中的表達(dá)量高于卵巢良性腫瘤。miR-125b在早期上皮性卵巢癌患者中的表達(dá)高于晚期患者，在術(shù)后無(wú)殘余腫瘤患者中的表達(dá)高于術(shù)后有殘余腫瘤的患者，故本研究顯示miR-125b在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，而且在腫瘤不同期別的表達(dá)情況發(fā)生變化，所以在上皮性卵巢癌早期的作用比較明顯，在晚期或腫瘤殘余較多的患者表達(dá)較不明顯。研究還顯示，miR-125b高表達(dá)有利于患者的PFS，但在OS方面無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。MiR-125b在腫瘤早期診斷、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后等方面均有一定的意義，但是找尋miR-125b作用的靶基因及其作用的相關(guān)機(jī)制等問(wèn)題尚未解決。MiR-125b可作為上皮性卵巢癌一類新的生物標(biāo)志物及作用靶點(diǎn)，但是還需要更多的研究來(lái)探明其作用機(jī)制。

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Screening of miRNAs in ovarian cancer patients and its correlation with clinicopathological features

ZHU Tao1, ZHANG Ping2, ZHENG Wei1(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Medical College, Zhejiang University, Hangzhou 310009, Zhejiang Province, China; 2. Department of Gynecologic Oncology, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, Zhejiang Province, China)

［Key words］Ovarian cancer； MiRNA expression cards； MiR-125b； Prognosis

［Abstract］Background and purpose: The prognosis of ovarian cancer is poor and the diagnosis is relatively late. It is needed to search for early diagnosis and treatment for ovarian cancer. This study investigated the expression of serum miRNAs in patients with malignancy or benign ovarian tumor preoperativey and analyzed its correlation with clinicopathological progress and prognostic features of epithelial ovarian cancer. Methods: Forty-eight miRNAs which have been reported to be related to ovarian cancer were ordered. The differential expression of 48 miRNAs in the serum of patients with malignant or benign epithelial ovarian tumors was detected by TaqMan low density array. The differentially expressed miRNAs were further confirmed by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR）. The relationship between the expression level of selected miRNA and clinical clinicopathological factors， progress and prognosis were analyzed. Results: TaqMan low density array and further RTFQ-PCR showed that only miR-125b was significantly increased in 135 ovarian cancer patients as compared with 38 individuals with benign tumor. The expression of miR-125b was higher in early stage patients than that in advanced stage patients （P=0.039）. The patients without residual tumor expressed more miR-125b than patients with residual tumor （P=0.013）. The high level of miR-125b was signifi-cantly correlated with longer progress free survival （PFS） （P=0.003）， but not correlated with overall survival （OS） （P=0.069）. Conclusion: MiR-125b may play an important role in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer and prognosis. It may be a potential gene to predict the recurrence of epithelial ovarian cancer， but the change of gene expression at different stages and its underlying mechanism need further research.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.03.001

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639(2016)03-0201-07

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2111317；LY14H160010）。

通信作者：鄭 偉 E-mail:zhengwei@zju.edu.cn

收稿日期：（2015-10-01 修回日期：2016-01-24）