閆慧麗，席　俊，高學(xué)梅，賀夢雪，陳　哲，陸啟玉

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001)

抗Gly m Bd 28K單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性

閆慧麗，席俊*，高學(xué)梅，賀夢雪，陳哲，陸啟玉

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001)

摘要：利用Gly m Bd 28K天然蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合，篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗Gly m Bd 28K單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1E3和2F4。體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體，經(jīng)純化后，得到2株均為IgG1型的單克隆抗體mAb1E3和mAb2F4。間接ELISA方法測得mAb1E3的效價(jià)達(dá)到1∶4.10×105，對Gly m Bd 28K蛋白的半數(shù)抑制率(IC50)為23.99 μg·L-1，與花生蛋白、核桃蛋白等的交叉反應(yīng)率均低于0.1%。該單克隆抗體的制備為Gly m Bd 28K致敏蛋白的檢測以及抗原表位的鑒定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Gly m Bd 28K；雜交瘤細(xì)胞；單克隆抗體；間接ELISA

大豆是優(yōu)質(zhì)植物蛋白的來源，大豆及大豆制品多達(dá)30余種，以其豐富的營養(yǎng)深受消費(fèi)者喜愛。然而，大豆中過敏原的存在限制了一部分人對大豆及其制品的攝取。引起大豆過敏的過敏原主要有Gly m Bd 30K，Gly m Bd 28K，Gly m 60K，此外，還有一些致敏原，如大豆疏水蛋白Gly m 1、大豆外殼蛋白Gly m 2、大豆抑制蛋白Gly m 3等[1]。

Gly m Bd 28K是大豆球蛋白7S組分中的一種，能夠被大約25%的大豆過敏患者血清識別[2-3]。Kumari等[4]在黑豆中也分離、純化出了Gly m Bd 28K，這表明Gly m Bd 28K很可能存在于多種豆科植物中。如果能夠了解28K蛋白的致敏機(jī)制，降低28K蛋白的致敏性，將使很多對Gly m Bd 28K蛋白過敏的患者受益。本研究擬采用雜交瘤技術(shù)制備抗Gly m Bd 28K單克隆抗體，為Gly m Bd 28K過敏原的快速檢測以及致敏機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

Gly m Bd 28K天然蛋白：由本實(shí)驗(yàn)室分離純化，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度，具體方法參照席俊等[5]的論文；弗氏完全佐劑FCA，弗氏不完全佐劑FIA，聚乙二醇(PEG4000)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640，選擇培養(yǎng)基HAT、HT，均為Gibco產(chǎn)品；羊抗小鼠酶標(biāo)二抗、TMB單組分顯色液，均為Solarbio產(chǎn)品；胎牛血清，Sigma產(chǎn)品；單克隆抗體同種亞型試劑盒，Pierce產(chǎn)品；其他試劑市售所得，均為AR級。

7周齡SPF級BALB/c雌性小鼠4只，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)所用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物免疫

小鼠免疫前7 d，耳緣采血，制備陰性血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩? d后，對小鼠進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射抗原，具體參照史巧巧等[6]的方法，首次免疫劑量為40 μg·只-1。4周后加強(qiáng)免疫，免疫劑量為第1次免疫的30%，每間隔3周加強(qiáng)免疫1次，共3次。試驗(yàn)小鼠10 d后斷尾采血，離心(5 000 r·min-1，8 min)，收集上清置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抗體血清效價(jià)的測定

采用間接ELISA方法[6]測抗體血清效價(jià)。(1)將Gly m Bd 28K天然蛋白用碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋至1 μg·mL-1后包板，50 μL·孔-1，4 ℃過夜，取出后用PBST充分洗滌，拍干；(2) 將200 μL含5%脫脂乳的封閉液加入酶標(biāo)板， 37 ℃溫育1 h，充分洗滌，拍干；(3)將1.2.1節(jié)中的抗體血清從1∶100倍開始，倍比稀釋，加入到酶標(biāo)板，50 μL·孔-1，分別以小鼠陰性血清和PBS做陰性和空白對照，37 ℃恒溫箱中孵育15 min，完成后PBST充分洗滌，拍干；(4)取辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠酶標(biāo)二抗，1∶1 000倍稀釋后加入到酶標(biāo)板，50 μL·孔-1，37 ℃溫育30 min，充分洗滌，拍干；(5)加入50 μL TMB單組分顯色液，室溫避光條件顯色10～15 min后加入等量終止液；(6)在酶標(biāo)儀上讀取D450值，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)，抗體的效價(jià)為其最大稀釋倍數(shù)。

1.2.3抗體血清敏感性的測定

抗體血清敏感性測定采用間接ELISA方法，1.2.2節(jié)中第(3)步改為：將Gly m Bd 28K蛋白稀釋成不同質(zhì)量濃度(3.125～800 μg·L-1)作為抑制劑(50 μL·孔-1)，加入1.2.2節(jié)中測得的D450值在1.0附近的相應(yīng)稀釋倍數(shù)的抗體(50 μL·孔-1)，其余步驟同效價(jià)的測定。參照龔芳等[7]論文中方法繪制敏感性曲線，橫坐標(biāo)為Gly m Bd 28K濃度的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為吸光率(B/B0)(B0是Gly m Bd 28K標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)吸光值，B是Gly m Bd 28K標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度條件下的吸光值)。依據(jù)曲線推導(dǎo)回歸方程，計(jì)算多抗血清對Gly m Bd 28K的IC50。

1.2.4雜交瘤細(xì)胞株的建立

取免疫效果較好的1只小鼠加強(qiáng)免疫：將40 μg Gly m Bd 28K天然蛋白溶解在200 μL無菌PBS中，注射到小鼠體內(nèi)。96 h后，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0以大約1∶10的比例在PEG的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，加入適量含有HAT的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到96孔板上，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 d后，HAT培養(yǎng)基半量換液。12 d后，取細(xì)胞上清用間接ELISA測效價(jià)，以融合小鼠血清作陽性對照，以免疫前小鼠血清作陰性對照，篩選陽性孔。14 d后，改用HT培養(yǎng)基，將篩選出的陽性孔轉(zhuǎn)移至24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞長至1/2孔時(shí)，再次取上清測效價(jià)，對陽性孔進(jìn)行3次有限稀釋亞克隆。

1.2.5單克隆抗體的制備

單克隆抗體大量制備采用體內(nèi)誘生腹水法：提前2周注射0.5 mL液體石蠟于BALB/c小鼠腹腔，然后將約1×106個(gè)的雜交瘤細(xì)胞注入到小鼠腹腔，待小鼠腹腔鼓起變硬后收集腹水，室溫離心(3 000 r·min-1，5 min)，收集上清。

1.2.6單克隆抗體純度和亞型的鑒定

將1.2.5節(jié)中上清液通過Protein G Sepharose親和層析柱純化，并以SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度[8-9]。根據(jù)單克隆抗體同種亞型試劑盒說明測定單克隆抗體的亞型。

1.2.7單克隆抗體效價(jià)和敏感性的測定

單克隆抗體的效價(jià)和敏感性測定參照1.2.2節(jié)和1.2.3節(jié)。

1.2.8單克隆抗體特異性的測定

選取花生蛋白、核桃蛋白、芝麻蛋白、小麥麥谷蛋白(河南工業(yè)大學(xué)蛋白質(zhì)提取與制備實(shí)驗(yàn)室提供)作為競爭物，測定Gly m Bd 28K單克隆抗體對這些蛋白的IC50。交叉反應(yīng)率(CR，%)=Gly m Bd 28K 單克隆抗體對 Gly m Bd 28K的IC50/各競爭物的IC50×100。

2 結(jié)果與分析

2.1抗體血清的效價(jià)和敏感性

間接ELISA法測得4只小鼠抗體血清效價(jià)(圖1)均達(dá)到了1∶3.20×103，適合于細(xì)胞融合，其中2號小鼠的抗體血清效價(jià)最高，達(dá)到1∶6.40×103。由圖2可知：4只小鼠中，2號小鼠抗體血清的敏感性最好(圖中數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值)，其IC50為75.86 μg·L-1。因此，選取2號小鼠作為融合小鼠。

圖1　小鼠抗體血清的效價(jià)Fig.1　Titer curves of mice antisera

圖2　抗體血清的敏感性曲線Fig.2　Sensitivity curves of antisera

2.2單克隆抗體純度與亞型的鑒定

多次克隆篩選后，得到2株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E3，2F4，其單克隆抗體分別命名為mAb1E3和mAb2F4。mAb1E3和mAb2F4的電泳圖譜(圖3)表明，純化后的抗體在還原條件下只有兩條蛋白條帶，并無其他雜蛋白。采用亞型試劑盒測定mAb1E3和mAb2F4的亞型，結(jié)果表明mAb1E3和mAb2F4都是IgG1型。進(jìn)一步證明電泳圖譜上的2條蛋白條帶為IgG抗體的重鏈和輕鏈，表明純化后的抗體純度較高。

2.3單克隆抗體的效價(jià)

M： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 1: mAb1E3(未純化)； 2: mAb2F4(未純化)； 3: mAb1E3(純化)； 4: mAb2F4(純化)。圖3　SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度Fig.3　SDS-PAGE analysis of the purity of monoclonal antibodies

間接ELISA測得單克隆抗體細(xì)胞株1E3和2F4的細(xì)胞上清效價(jià)分別為1∶1.28×103和1∶6.40×102，其腹水的效價(jià)分別為1∶4.10×105和1∶2.05×105，結(jié)果見表1。

表1單克隆抗體效價(jià)測定

Table 1The titers of Gly m Bd 28K mAb

單克隆抗體細(xì)胞上清腹水mAb1E31∶1.28×1031∶4.10×105mAb2F41∶6.40×1021∶2.05×105

2.4單克隆抗體的敏感性

獲得的2株單克隆抗體中，mAb1E3的敏感性較好，其敏感性曲線如圖4(圖中數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值)，線性回 歸方程為y=-0.237x+0.828，由此可以得出mAb1E3對Gly m Bd 28K的IC50為23.99 μg·L-1。

圖4　mAb1E3的敏感性曲線Fig.4　The sensitivity curve of mAb1E3

2.5單克隆抗體的特異性

單克隆抗體mAb1E3特異性測定結(jié)果見表2。由表2可知，mAb1E3與花生蛋白的交叉反應(yīng)率為0.096%，與核桃蛋白、芝麻蛋白、小麥麥谷蛋白的交叉反應(yīng)率均低于0.03%，具有良好的特異性。

表2mAb1E3與其他蛋白的交叉反應(yīng)

Table 2The cross-reactivity of mAb1E3 with other proteins

蛋白質(zhì)IC50/(μg·L-1)CR/%GlymBd28K蛋白23.99100.0花生蛋白2.5×1049.6×10-2芝麻蛋白>105<0.03核桃蛋白>105<0.03小麥麥谷蛋白>105<0.03

3討論

制備抗體，首先要考慮的問題就是抗原。一個(gè)良好的抗原必須具備足夠大的分子量，較強(qiáng)的外源性和特異性。目前的免疫試驗(yàn)中，常用的抗原有3類：一類來自純化的天然蛋白；一類來自純化的重組蛋白；還有一類是半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物。本實(shí)驗(yàn)室之前利用重組Gly m Bd 28K蛋白免疫Balb/C小鼠，成功制備出抗Gly m Bd 28K重組蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株3F5，其抗體效價(jià)為1∶1.64×106，對重組Gly m Bd 28K蛋白的IC50為3.49 μg·L-1。從結(jié)果來看，用重組Gly m Bd 28K蛋白制備出的單克隆抗體的效價(jià)和敏感性都高于天然Gly m Bd 28K蛋白制備出的單克隆抗體，這說明抗原的制備方法很可能對抗體的免疫學(xué)特性有影響。杜智欣等[10]分別利用提純的黃瓜花葉病毒M株系(CMV-M)病毒粒子和體外原核表達(dá)的外殼蛋白免疫健康家兔，制備了CMV-M多克隆抗體。檢測結(jié)果表明，兩種CMV-M 多克隆抗血清效價(jià)是一致的，但在檢測病汁液靈敏度方面，以病毒粒子為抗原的多克隆抗血清明顯優(yōu)于以原核表達(dá)蛋白為抗原的抗血清，并且前者在樣品量倍比稀釋后Western-blot免疫條帶清晰，后者條帶模糊甚至消失。因此，在制備單克隆或多克隆抗體時(shí)，也要考慮到抗原的制備方法可能會(huì)對抗體產(chǎn)生的影響，選取合適的抗原制備方法。

細(xì)胞融合技術(shù)是細(xì)胞工程的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，為單克隆抗體的制備以及新物種的培育等提供了有力的技術(shù)支持。影響細(xì)胞融合成敗的因素較多，本實(shí)驗(yàn)室曾因骨髓瘤細(xì)胞生長狀態(tài)不好而造成細(xì)胞融合的失敗。因此，要保證細(xì)胞融合成功，就需要選取處于對數(shù)生長期的、沒有污染的瘤細(xì)胞。除了瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)，促融劑也是影響細(xì)胞融合的一個(gè)關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)中選用的促融劑是PEG 4000，其促融率相對較高，且價(jià)格低廉。由于PEG具有毒性，會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，因此PEG的作用時(shí)間相當(dāng)重要。本試驗(yàn)中，將預(yù)熱至37 ℃的PEG在1 min內(nèi)以一定速度輕柔地加至瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的混合體系，避免了對細(xì)胞的過度損傷，最終保證了細(xì)胞融合的成功，并且細(xì)胞的融合率達(dá)到了79%，有利于進(jìn)一步篩選陽性克隆。

大豆過敏引發(fā)的食品安全問題不容忽視，研究大豆過敏原的結(jié)構(gòu)、特性，降低大豆的致敏性是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)[11]，要研究大豆致敏機(jī)制，就必須全面了解大豆過敏原的抗原表位。目前，已有學(xué)者[12]利用單克隆抗體鑒定出了Gly m Bd 30K的部分抗原表位。本試驗(yàn)成功篩選出了2株抗Gly m Bd 28K天然蛋白的單克隆抗體，其中mAb1E3的效價(jià)達(dá)到1∶4.10×105，對Gly m Bd 28K天然蛋白的半數(shù)抑制率為23.99 μg·L-1，且特異性較好，與花生蛋白、核桃蛋白、芝麻蛋白、小麥麥谷蛋白的交叉反應(yīng)均低于0.1%。Gly m Bd 28K單克隆抗體的制備為Gly m Bd 28K建立了一種快速、靈敏的檢測方法，同時(shí)也為進(jìn)一步的抗原表位研究奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯張韻)

Preparation of monoclonal antibodies against Gly m Bd 28K and identification of their immunological properties

YAN Hui-li， XI Jun*， GAO Xue-mei， HE Meng-xue， CHEN Zhe， LU Qi-yu

(SchoolofFoodScienceandTechnology，HenanUniversityofTechnology，Zhengzhou450001，China)

Abstract:To establish hybridoma cell lines that secreted anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies， Gly m Bd 28K protein was used to immunize BALB/c mouse， whose spleen was removed for cell fusion. Two hybridoma cell lines that stably secreted anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies were screened and then were injected into BALB/c mice to prepare monoclonal antibodies. After purification of monoclonal antibody， two strains of cell lines were identified for IgG1， named as mAb1E3 and mAb2F4. Indirect ELISA was used to detect the immunological properties of mAb1E3. The titer of mAb1E3 was 1∶4.10×105， and the IC50of mAb1E3 to Gly m Bd 28K was 23.99 μg·L-1. The ratios of cross-reactivity of mAb1E3 with peanut protein， sesame protein， walnut protein and wheat glutenin were less than 0.1%. We successfully prepared the anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies possessed high sensitivity and specificity. This study provided a basis for the detection of Gly m Bd 28K allergen and the identification of epitopes.

Key words:Gly m Bd 28K; hybridoma cell; monoclonal antibody; indirect ELISA

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.06

收稿日期：2015-08-28

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31301409)；河南工業(yè)大學(xué)自然科學(xué)基礎(chǔ)研究培育計(jì)劃(2014JCYJ01)

作者簡介：閆慧麗(1989—)，女，河南鄭州人，碩士研究生，從事食品安全與品質(zhì)控制研究。E-mail: yanhuili2000@163.com

*通信作者，席俊，E-mail: xijunhnu@163.com

中圖分類號：S565.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-1524(2016)05-0748-05

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 748-752

http://www.zjnyxb.cn

閆慧麗，席俊，高學(xué)梅，等. 抗Gly m Bd 28K單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性 [J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(5)： 748-752.