常英英，梁立雄，高亞南，王顏波，丁昌俊，蘇曉華，張冰玉

(中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所/林木遺傳育種國家重點實驗室/國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091)

去甲基化酶基因AtROS1化學誘導表達載體的構(gòu)建及其在煙草中的瞬時表達

常英英，梁立雄，高亞南，王顏波，丁昌俊，蘇曉華，張冰玉*

(中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所/林木遺傳育種國家重點實驗室/國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091)

摘要：植物去甲基化酶ROS1是表觀遺傳中一種重要的作用因子，參與基因的表達調(diào)控，與植物的生長發(fā)育及各種逆境響應(yīng)過程密切相關(guān)。以擬南芥AtROS1基因為目的基因，采用“酶切—連接”的方法構(gòu)建了以17-β-雌二醇為誘導劑的植物表達載體pER8-ROS1。將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，通過煙草瞬時表達技術(shù)，對該載體的誘導表達特性進行了研究。qPCR結(jié)果表明：17-β-雌二醇處理能夠有效調(diào)控pER8-ROS1中目的基因的表達，17-β-雌二醇最佳誘導濃度為50～100 μmol·L-1；隨著誘導時間的延長，目的基因表達量逐漸升高，在12 h后達到最高。該誘導表達載體的構(gòu)建為研究植物抗逆脅迫過程中的表觀遺傳機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：pER8-ROS1；17-β-雌二醇；化學誘導表達載體；瞬時表達

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，是植物正常生長發(fā)育所必需的，也是植物逆境響應(yīng)的重要機制。DNA甲基化的水平主要靠DNA甲基化和去甲基化的作用調(diào)節(jié)，這2個過程相互平衡，維持了DNA甲基化模式的穩(wěn)定。植物基因組甲基化模式的形成主要依賴于主動去甲基化，因此主動去甲基化的研究逐漸成為甲基化研究領(lǐng)域的重點之一。在植物中可能存在5種DNA主動去甲基化機制：DNA糖基化酶參與的堿基切除修復機制(base excision repair，BER)、脫氨基作用及G/T堿基錯配修復機制、核酸切除修復機制、氧化去甲基化機制及水解去甲基化[1]。DNA去甲基化酶參與DNA主動去甲基化過程，并且占主導地位。植物中的去甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有DME，ROS1，DML2和DML3 4個家族，它們均含有最保守的DNA糖基化酶結(jié)構(gòu)域[2-4]。其中，ROS1是植物體內(nèi)第一個被克隆的去甲基化酶基因；植物通過ROS1家族介導的堿基切除修復(BER)機制實現(xiàn)DNA主動去甲基化[3]。在BER途徑中，ROS1雙功能團酶切除甲基，使脫氧核糖和5-mC之間的核苷鍵斷裂，產(chǎn)生DNA鏈上的AP(apurillic/apyrimidinic)位點，ZDP和APE1L將3′磷酸變成3′羥基，最后，由DNA聚合酶和DNA連接酶填補此缺口，最終C取代5-mC[5-6]。ROS1是該通道中發(fā)揮作用的主要功能蛋白。擬南芥ROS1功能缺失突變體研究表明，ROS1能夠使目的基因啟動子發(fā)生去甲基化，激活沉默基因的表達，從而調(diào)控植物生長發(fā)育及對環(huán)境脅迫的應(yīng)答[3，7-10]。另外，ROS1還可以阻止RNA介導的DNA甲基化[11-13]。因此，研究ROS1的生物學功能對于豐富DNA主動去甲基化的機制，了解植物生長發(fā)育的調(diào)控機制，以及采用分子育種手段定向培育抗逆性強的樹木新品種都具有重要價值。

化學誘導表達系統(tǒng)是研究基因功能的有效手段之一[14]。其中，類固醇激活系統(tǒng)是基于糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體等建立的較為精密的化學誘導表達系統(tǒng)，其主要是通過糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體作為轉(zhuǎn)錄激活因子與融合啟動子結(jié)合，來調(diào)控下游基因的表達。當類固醇存在時，受體從細胞質(zhì)的熱休克蛋白90(HSP90)中解離出來，轉(zhuǎn)移到細胞核中，并與融合啟動子結(jié)合，激活目的基因的表達。2000年，Zuo等[15]構(gòu)建了雌激素激活表達系統(tǒng)(XVE系統(tǒng))，該系統(tǒng)能夠精密地調(diào)控下游基因的表達，并且對植物沒有毒害作用，是研究基因功能的理想工具。

本研究以擬南芥去甲基化酶基因AtROS1為目的基因，構(gòu)建了以17-β-雌二醇為誘導劑的XVE系統(tǒng)載體pER8-ROS1，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，通過煙草(NicotianatabacumL.)瞬時表達，對該載體的誘導表達特性進行了研究，為研究DNA去甲基化與植物生長發(fā)育以及抗逆脅迫之間的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料

煙草由中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所盧孟柱課題組饋贈。播種于土壤中，并將其放入(26 ± 1)℃，16 h·d-1光照和50 μmol·m-2·s-1光強的人工氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。60 d后用于農(nóng)桿菌介導的基因瞬時表達。

1.2菌株、質(zhì)粒及試劑

含有雌二醇誘導型啟動子的pER8-GFP質(zhì)粒由Nam. Hai Chua博士(The Rockefeller University，USA)贈送，含擬南芥AtROS1基因cDNA的pET28a-ROS1質(zhì)粒由Roldn-Arjona博士(Universidad de Córdoba，Spain)贈送。農(nóng)桿菌LBA4404為本實驗室保存。

1.3試驗方法

1.3.1擬南芥ROS1基因誘導表達載體構(gòu)建

GenBank中AtROS1基因CDS區(qū)序列長度為4 182 bp，利用Primer 5.0設(shè)計特異性引物ROS1-F (5′-CCGCTCGAGATGGAGAAACAGAGGAGAGAAGA-3′)和ROS1-R (5′-CTAGACTAGTACGGATTAGGCGAGGTTAGC-3′)(下劃線分別表示XhoⅠ和SpeⅠ酶切位點)，以pET28a-ROS1質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10 × GC buffer 2 μL，200 μmol·L-1dNTPs 2 μL，0.2 μmol·L-1PCR引物各1 μL，5×16.67 mkat·L-1Taq酶0.2 μL，500 ng·μL-1模板1 μL，ddH2O 12.8 μL；擴增程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段，連接到克隆載體pMDTM19-T Vector(Takara公司，日本)。轉(zhuǎn)化EscherichiacoliDH5α，經(jīng)過藍白斑篩選，挑取陽性克隆進行序列測定。

用XhoⅠ和SpeⅠ酶切pMDTM19-T-ROS1和pER8-GFP質(zhì)粒，酶切回收的ROS1片段和pER8線性片段，用T4 DNA酶連接，挑取單克隆進行PCR檢測，所用引物在載體pER8多克隆位點設(shè)計(pXhoⅠ-F: 5′-CGCTGAAGCTAGTCGACT-3′；pSpeⅠ-R: 5′-AGGCCTGGATCGACTAGT-3′)。將陽性克隆擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證。菌液加入20%的甘油保種備用，質(zhì)粒于-20 ℃保存。植物誘導表達載體pER8-ROS1的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.3.2pER8-ROS1載體的誘導表達特性研究

圖1　植物誘導表達載體pER8-ROS1結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　The structural diagram of the plant chemical inducible expression vector pER8-ROS1

煙草處理方法。用電擊法分別將質(zhì)粒pER8-GFP和pER8-ROS1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，得到1#和2#菌株；其中1#菌株用于篩選誘導劑處理的條件，2#菌株在篩選出的誘導條件下進行pER8-ROS1載體的誘導表達特性研究。在含50 mg·L-1利福平和壯觀霉素的YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于28 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)直至D600為0.4～0.6，并用懸浮液處理。先用1#農(nóng)桿菌重懸液注射煙草葉片，26 ℃控濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，再用17-β-雌二醇涂抹煙草葉面，處理濃度分別為0，0.08，0.20，1.00，5.00，25.00，50.00，100.00和200.00 μmol·L-1。對照組1(CK1)為未注射含pER8-GFP農(nóng)桿菌的煙草，對照組2(CK2)為0 μmol·L-117-β-雌二醇處理的煙草，即注射含pER8-GFP農(nóng)桿菌但無誘導處理的。12 h之后打孔取葉片，每個處理3次重復，每次重復約取樣100 mg，立即投入液氮中，保存于-80 ℃冰箱中(下同)。同時，以50 μmo·L-117-β-雌二醇處理煙草葉面，并于0，0.5，1.0，3.0，6.0，12.0，24.0，48.0，96.0 h后取樣。對照組(CK1)為未注射的煙草，對照組2(CK2)為誘導0 h的煙草。

用2#農(nóng)桿菌重懸液注射煙草葉片，共培養(yǎng)12 h后用17-β-雌二醇涂抹煙草葉面，處理濃度為0，1，25，50，100和200 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)12 h之后取樣。對照組1(CK1)為未注射的煙草，對照組2(CK2)為注射含pER8-ROS1農(nóng)桿菌但無誘導的煙草。根據(jù)篩選出的最佳濃度，用17-β-雌二醇涂抹煙草葉面，處理時間分別為0，1，6，12，24和48 h，取樣及保存方法同上。設(shè)立對照組同上。該材料用于檢測pER8-ROS1載體中ROS1基因的誘導表達情況。

總RNA提取及cDNA合成。使用Qiagen公司RNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取不同處理的葉片總RNA，用Nano Drop 8000分光光度計測RNA的濃度和純度。采用Reverse transcriptase-PCR方法合成cDNA，具體反應(yīng)過程參照Takara公司的說明書進行。

實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)反應(yīng)。以不同處理的稀釋10倍的cDNA為模板，采用Roche LightCycle 480Ⅱ型熒光定量PCR儀進行qPCR反應(yīng)。以actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法進行分析[16]，qPCR引物序列見表1。

表1qPCR引物序列

Table 1The primer sequences of qPCR

基因擴增長度/bp引物序列(5'→3')ROS1300ATGGAGAAACAGAGGAGAGAAGAGCTCAAACTCTCCACTTCTTCAGFP166TGTTCCATGGCCAACACTTGACGTGTCTTGTAGTTCCCGTactin195TGTGTTGGACTCTGGTGATGCGCTCGGTAAGGATCTTCATC

2結(jié)果與分析

2.1誘導表達載體pER8-ROS1的構(gòu)建

用ROS1-F和ROS1-R引物擴增pET28a-ROS1質(zhì)粒，獲得4 182 bp的PCR片段，與預(yù)期帶有酶切位點的全長AtROS1基因相符。純化后連入pMDTM19-T載體，經(jīng)過雙端測序，證明克隆基因核酸序列與AtROS1基因完全相同，獲得pMDTM19-T-ROS1中間載體。用XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切質(zhì)粒pMDTM19-T-ROS1，獲得4 197 bp的片段，將其連入植物誘導表達載體pER8-GFP中，替換GFP基因。采用pXhoⅠ-F和pSpeⅠ-R引物，進行PCR擴增，擴增出4 227 bp片段。XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切結(jié)果顯示，酶切片段大小正確(圖2)。表明成功構(gòu)建了擬南芥去甲基化酶基因AtROS1的植物誘導表達載體pER8-ROS1。

2.2pER8-ROS1的誘導表達特性分析

2.2.1誘導劑濃度及誘導時間的確定

將含有pER8-GFP質(zhì)粒的LBA4404菌株注射到煙草中，共培養(yǎng)12 h后檢測不同濃度17-β-雌二醇處理下GFP基因的表達情況。圖3-A顯示，2個對照組均無特異性條帶，且qPCR結(jié)果中對照組1的Ct值(>35)遠大于對照組2以及處理組，說明GFP在對照組1中不表達。圖4-A表明，17-β-雌二醇能有效誘導煙草瞬時表達系統(tǒng)中GFP的表達，隨著17-β-雌二醇濃度增加，GFP的表達量逐漸增加。17-β-雌二醇濃度為0.2 μmol·L-1時，即可檢測到GFP基因的表達，5 μmol·L-1時GFP基因的表達量顯著增加，濃度達到50 μmol·L-1后，GFP的表達量增加趨勢趨于平緩，因此，確定17-β-雌二醇有效濃度為5～50 μmol·L-1。

采用qPCR方法檢測了在煙草瞬時表達體系中XVE系統(tǒng)的目的基因表達水平隨17-β-雌二醇處理時間變化的趨勢。結(jié)果表明：17-β-雌二醇處理1 h時即能檢測到GFP基因的表達，隨著處理時間的增加，GFP的表達量逐漸增加，3 h時GFP的表達量顯著增加，在12 h時表達量最大，之后逐漸降低(圖3-B，圖4-B)

A： 質(zhì)粒pER8-ROS1轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌液PCR檢測。M: 1kb DNA marker；1～3: 3個單菌落的PCR結(jié)果。B: pER8-ROS1質(zhì)粒雙酶切。M: 1kb DNA marker；P: pER8-ROS1質(zhì)粒；X+S: pER8-ROS1質(zhì)粒XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切片段。圖2　pER8-ROS1載體的PCR(A)和XhoⅠ+SpeⅠ雙酶切(B)檢測Fig.2　PCR identification (A) and XhoⅠ+SpeⅠdigestion (B) of the pER8-ROS1 vector

A： 不同濃度誘導劑處理GFP基因的半定量PCR檢測。M: Marker I；-：CK1；0: CK2；0.08～200：誘導劑濃度分別為0.08～200 μmol·L-1的煙草樣品。B：不同誘導時間GFP基因的半定量PCR檢測。-：CK1；0: CK2；0.5～96：誘導時間分別為0.5～96 h的煙草樣品。圖4同。圖3　GFP基因的半定量PCR檢測Fig.3　sq-PCR indentification of GFP gene

圖4　GFP對17-β-雌二醇濃度(A)和處理時間(B)的響應(yīng)Fig.4　Dose-response(A) and induction time-course(B) of GFP to 17-β-estradiol

2.2.2pER8-ROS1中ROS1的誘導表達特性分析

在確定了17-β-雌二醇處理濃度和處理時間的基礎(chǔ)上，對構(gòu)建的ROS1基因化學誘導表達系統(tǒng)的誘導特性進行了研究。對照組1的半定量結(jié)果無條帶(圖5-A)，且qPCR結(jié)果無熒光信號，說明所設(shè)計的AtROS1引物不能擴增煙草中的NtROS1基因。qPCR結(jié)果表明，1～200 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，17-β-雌二醇能夠有效誘導ROS1的表達，并且隨著17-β-雌二醇濃度增加，ROS1的表達量逐漸增加，17-β-雌二醇濃度達到100 μmol·L-1后，ROS1的表達量進入平臺期(圖5-B)。較低濃度的17-β-雌二醇也能有效誘導外源基因的表達，說明該載體對誘導劑的反應(yīng)較為靈敏。但在同樣濃度條件下，ROS1的表達量比GFP低。

在100 μmol·L-1的17-β-雌二醇處理下，煙草葉片中ROS1的表達量隨處理時間而逐漸增加，處理1 h后ROS1即有少量表達，6 h后表達量略有上升，12 h后表達量達到高峰，之后緩慢下降(圖5-C)。其表達趨勢與GFP相似，但表達量較GFP低。

3結(jié)論與討論

為了更加深入研究AtROS1基因在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中的作用，選用雌激素激活系統(tǒng)構(gòu)建了受17-β-雌二醇誘導表達的pER8-ROS1雙元載體，并利用煙草的瞬時表達技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)，檢測了該系統(tǒng)中AtROS1基因隨17-β-雌二醇處理條件變化的表達情況。研究結(jié)果表明：較低濃度的17-β-雌二醇即能有效誘導AtROS1的表達，處理12 h后表達量最高。Zuo等[15]在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中研究發(fā)現(xiàn)，17-β-雌二醇處理濃度為5 μmol·L-1、處理時間為24 h時，XVE系統(tǒng)中目的基因表達量最大。而本研究中17-β-雌二醇濃度提高到50～100 μmol·L-1時，目的基因表達量才能達到最大，可能是因為本研究中誘導劑處理的方法為葉片涂抹法，誘導劑容易揮發(fā)，導致處理濃度降低；而擬南芥轉(zhuǎn)基因研究中誘導劑處理的方法為根部吸收，這能為植物提供穩(wěn)定的誘導條件[17]。本研究中17-β-雌二醇處理12 h后目的基因的表達水平達到最高，原因可能是恒定表達與瞬時表達方法不同導致的。本研究還發(fā)現(xiàn)，雌激素激活系統(tǒng)對GFP基因和AtROS1基因的調(diào)控水平也有差異，可能是由于基因片段大小不同導致轉(zhuǎn)化效率的差異[18]。

A: AtROS1基因的半定量PCR檢測。M: Marker I；wt: CK1；0: CK2；1～200：誘導劑濃度分別為1～200 μmol·L-1的煙草樣品；1～48 h：誘導時間分別為1～48 h的煙草樣品。B: pER8-ROS1載體對17-β-雌二醇濃度的響應(yīng)。0: CK2；1～200：誘導劑濃度分別為1～200 μmol·L-1的樣品。C: pER8-ROS1對17-β-雌二醇誘導時間的響應(yīng)。0: CK2；1～48：誘導劑時間分別為1～48 h的樣品。圖5　表達載體pER8-ROS1的誘導表達特性分析Fig.5　Inducible characteristic analysis of expression vector pER8-ROS1

煙草的瞬時表達系統(tǒng)由于其省時省力、周期快、結(jié)果可靠等優(yōu)點成為研究基因功能的有效手段[19]。本研究中用于構(gòu)建化學表達載體的擬南芥AtROS1基因功能已經(jīng)很明確，即通過去甲基化作用調(diào)控基因的表達[3]。在煙草瞬時表達試驗中，誘導表達AtROS1會引起基因組的DNA甲基化變化。這種基因組甲基化的改變可以通過MSAP(methylation sensitive amplification polymorphis)，MeDIP(methyl-DNA immunoprecipitation)和BS-seq(bisulphite sequencing)的方法進行測定。然而，由于本研究僅是利用煙草的瞬時表達系統(tǒng)來確定構(gòu)建載體的誘導特性，加之上述測定基因組甲基化的方法成本較高、煙草瞬時體系的不穩(wěn)定性等原因，本文并未對誘導表達AtROS1后煙草葉片的甲基化情況進行測定。在獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株后，我們將選擇部分植株進行有針對性的甲基化研究。

另外，擬南芥AtROS1基因與植物的抗逆性密切相關(guān)。在煙草中超表達AtROS1基因，煙草表現(xiàn)出較強的抗鹽能力[20]。在擬南芥AtROS1基因的缺失突變體rdd中，對抗病性相關(guān)的基因檢測表明，AtROS1基因在擬南芥的抗病性方面有重要作用[21]。此外，AtROS1基因有助于擬南芥種子打破休眠，其還能夠通過RNA介導的DNA甲基化過程(RNA-directed DNA methylation，RdDM)來影響植物的耐熱性等[22-23]。擬南芥AtROS1的化學誘導表達載體pER8-ROS1的成功構(gòu)建，對于研究植物DNA主動去甲基化的機制，特別是采用分子育種手段定向培育抗逆性強的植物新品種具有重要意義。

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(責任編輯侯春曉)

Construction of a chemical-inducible expression vector ofAtROS1 and its transient expression in tobacco

CHANG Ying-ying， LIANG Li-xiong， GAO Ya-nan， WANG Yan-bo， DING Chang-jun， SU Xiao-hua， ZHANG Bing-yu*

(StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreeding/KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationofStateForestryAdministration/ResearchInstituteofForestry，ChineseAcademyofForestry，Beijing100091，China)

Abstract:Plant demethylase ROS1 was an important factor in epigenetic regulation. It could activate the expression of genes and was closely related to the processes of plant development and various stress responses. In this study， AtROS1 gene from Arabidopsis thaliana was used as the target gene， and ‘digestion-ligation’ method was applied for constructing plant expression vector pER8-ROS1 which could be induced by 17-β-estradiol. Then the vector was transferred to Agrobacterium tumefaciens LBA4404， and the inducible expression characteristics were verified by the transient expression system of Nicotiana tabacum. The results of qPCR showed that 17-β-estradiol could effectively induce the expression of the target gene in pER8-ROS1 and the optimal concentration of 17-β-estradiol was 50 to 100 μmol·L-1. The expression level of ROS1 gene gradually increased and reached the highest level at 12 h. The construction of pER8-ROS1 laid a good foundation for the epigenetic mechanism study in plant environmental stress.

Key words:pER8-ROS1; 17-β-estradiol; chemical-inducible expression vector; transient expression

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.01

收稿日期：2015-09-22

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA102703)；林木遺傳育種國家重點實驗室基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(TGB2013010)

作者簡介：常英英(1987—)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向為林木基因工程。E-mail: 15510642172@163.com

*通信作者，張冰玉，E-mail: byzhang@caf.ac.cn

中圖分類號：Q943.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-1524(2016)05-0717-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 717-723

http://www.zjnyxb.cn

常英英， 梁立雄， 高亞南， 等. 去甲基化酶基因AtROS1化學誘導表達載體的構(gòu)建及其在煙草中的瞬時表達[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報， 2016， 28(5): 717-723.