肖春林（兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆　五家渠　831300）

植物染色體制片方法的改進(jìn)

肖春林
（兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠831300）

摘要：以普通小麥（2n = 6x = 42）為材料，對(duì)其種子進(jìn)行發(fā)根，取其根尖分生區(qū)進(jìn)行酶解法染色體制片。對(duì)比常規(guī)壓片和去壁低滲火焰干燥法制片技術(shù)，酶解法制片技術(shù)易獲得更好的分裂相，分布更加均勻的染色體片，更有利于后期的原位雜交進(jìn)行信號(hào)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：小麥；根尖分生區(qū)；染色體制片

植物染色體制片技術(shù)是植物細(xì)胞遺傳學(xué)、染色體工程、植物細(xì)胞生物學(xué)、植物細(xì)胞分類學(xué)和物種生物學(xué)等眾多學(xué)科的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)[1]。對(duì)于染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)、遺傳行為及細(xì)胞變異等遺傳學(xué)現(xiàn)象的分析，可以大大提高作物育種工作的效率和質(zhì)量。因此，改善并提高染色體制片技術(shù)顯得尤為重要。目前常用的染色體制片技術(shù)有2種，即普通壓片技術(shù)和去壁低滲火焰干燥技術(shù)。前者雖然操作簡(jiǎn)單實(shí)用，但是需要制片者取材時(shí)間適宜，壓片力量適中，對(duì)操作者的熟練程度要求較高；且處理一些細(xì)胞壁堅(jiān)硬、難以軟化的材料時(shí)，也不易獲得良好的制片[2-3]。后者相比前者，需要的制片經(jīng)驗(yàn)較少，且制片效果較好，但操作過(guò)程涉及酒精燈，需要火焰干燥和蓋玻片壓片，對(duì)染色體造成部分影響。酶解法在兩者技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)部分實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行了改善，不僅可以得到分散良好的有絲分裂中期分裂相，而且還縮短了酶解的時(shí)間,提高了制片的效率，從而獲得更好的染色體制片，為細(xì)胞學(xué)觀察及相關(guān)的原位雜交（GISH）實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1　材料與方法

1.1材料來(lái)源

市場(chǎng)購(gòu)買的普通小麥種子。

1.2材料制備

1.2.1冷處理

將普通小麥種子置于裝有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，小麥腹溝朝下貼在濾紙上，于4℃冰箱冷處理24h。

1.2.2發(fā)根、剪根

冷處理的種子放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以上，待根尖長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)剪下。

1.2.3預(yù)處理

濕潤(rùn)根尖裝于2mLEP管中，笑氣處理2h左右。

1.2.4固定、保存

預(yù)處理的根尖用90%冰醋酸浸泡3～5 min后轉(zhuǎn)入70%酒精中，4℃冰箱保存。

1.2.5清洗

用鑷子取出固定根尖，蒸餾水反復(fù)漂洗3次，清洗干凈后用絲巾擦盡根尖水珠。

1.2.6配制酶液

將提前配好的纖維素酶0.02 g與果膠酶0.01 g溶于1 mL檸檬酸鈉緩沖液（滅菌）中，每20 μL分裝于EP管中。

1.2.7酶解

剪取根尖分生區(qū)（乳白色）2mm左右，紙巾擦干其上水分，置于20 μL酶液EP管中，37℃水浴1h左右。

1.2.8漂洗、脫水

吸干EP管中酶液，加入50 μL蒸餾水，反復(fù)漂洗3次；吸盡EP管中蒸餾水，加100%C2H5OH脫水2次。

1.2.9滴片、照相

每一根尖加20 μL冰醋酸，用20 μL白色槍頭搗碎根尖1 min，吸取10 μL溶液滴于載玻片上，加蓋玻片，相差顯微鏡下觀察照相。

1.3.0永久封片

液氮冷凍后用刀片將蓋玻片和載玻片分離，分別干燥后用“指甲油”進(jìn)行封片處理。

2　結(jié)果與討論

按照酶解法制得的小麥根尖染色體片（未染色）如圖1，染色體形態(tài)比清晰，且分布比較均勻，都為42條。但需要注意的是，用此方法制片若纖維素酶與果膠酶的比例濃度不夠，在顯微鏡下觀察時(shí)，會(huì)出現(xiàn)染色體重疊、分散不均勻或細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)仍存在的現(xiàn)象，影響染色體的觀察。

圖1　普通小麥根尖分生區(qū)染色體圖（2n = 6x = 42）

相比常規(guī)染色體制片方法，酶解法優(yōu)點(diǎn)在于：（1）預(yù)處理中（笑氣處理）相比傳統(tǒng)的冰水混合物需處理24 h以上，該方法僅為2 h左右，大大縮短了處理時(shí)間；（2）對(duì)常規(guī)壓片法中碰到細(xì)胞壁等堅(jiān)硬無(wú)法軟化的材料，酶解法利用纖維素酶和果膠酶可以溶解細(xì)胞壁、部分細(xì)胞質(zhì)及兩者之間的果膠物質(zhì)，充分軟化分散細(xì)胞，使染色體分布均勻；（3）避免了常規(guī)制片法中的手指壓片及解剖針敲擊來(lái)分散染色體并使之處于同一平面上的操作經(jīng)驗(yàn)和力度問(wèn)題；（4）整個(gè)操作過(guò)程中僅酶液濃度的酶解時(shí)間需要精確掌控，其他操作較規(guī)范，易把握。

參考文獻(xiàn)

[1]李懋學(xué)，張贊平.作物染色體及其研究技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：63-66.

[2]王幼平.植物染色體制片方法的改進(jìn)[J].生物學(xué)通報(bào)，2007，42 （10）：55.

[3]蒿若超，武美燕.一種植物染色體制片改良方法[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，8（2）：236-238.

收稿日期：2016—01—11