李小平，郝朝亮，郭　輝

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖南衡陽(yáng) 421001；2．中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410078)

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Shank3基因多態(tài)性與漢族兒童孤獨(dú)癥的病例對(duì)照研究*

李小平1，郝朝亮1，郭輝2

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖南衡陽(yáng) 421001；2．中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410078)

[摘要]目的探討Shank3基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與漢族兒童孤獨(dú)癥的相關(guān)性。方法采用Illumina CNV 370-Duo芯片和Illumina 610芯片對(duì)455例孤獨(dú)癥患者(孤獨(dú)癥組)和1 097例無(wú)孤獨(dú)癥及相關(guān)精神疾病兒童(對(duì)照組)的Shank3基因SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)，對(duì)基因分型數(shù)據(jù)采用haploview4.1軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果Shank3基因的rs736334、rs8137951位點(diǎn)的等位基因頻率和rs9616816-rs736334的G-G、A-A及rs715586-rs8137951的G-A單體型頻率在兩組間的傳遞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但經(jīng)1 000次模擬置換檢驗(yàn)后的結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論Shank3基因與漢族兒童孤獨(dú)癥的致病不存在相關(guān)性，Shank3基因可能不是漢族兒童孤獨(dú)癥的易感基因。

[關(guān)鍵詞]Shank3基因；多態(tài)性，單核苷酸；病例對(duì)照研究

孤獨(dú)癥是一種廣泛發(fā)育障礙性疾病，其主要臨床特征為語(yǔ)言交流障礙，刻板的行為模式和興趣狹窄[1]。孤獨(dú)癥的病因復(fù)雜，且具有明顯的多基因病的特點(diǎn)，其病因至今未明，其遺傳力高達(dá)90%[2]。Shank3基因是SHANK突觸骨架蛋白的一員，Shank3的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與多種膜蛋白和胞質(zhì)蛋白相互作用，在神經(jīng)樹突成熟、功能性突觸的形成及突觸的功能發(fā)揮中具有重要的作用[3-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道在自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)患者中發(fā)現(xiàn)了Shank3基因的點(diǎn)突變和基因拷貝數(shù)變異，Shank3基因單倍劑量不足患者表現(xiàn)出孤獨(dú)癥的相關(guān)癥狀[6-9]。已有研究提示，Shank3基因與孤獨(dú)癥的致病可能相關(guān)，作者對(duì)該基因與漢族兒童孤獨(dú)癥的相關(guān)性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2008年1月至2009年12月中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室遺傳門診、中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院精神衛(wèi)生研究所精神衛(wèi)生門診和青島以琳培訓(xùn)中心收治的漢族孤獨(dú)癥兒童共455例(孤獨(dú)癥組)，其中男365例，女90例；年齡3～10歲，平均(5.12±1.23)歲。455例孤獨(dú)癥患兒診斷均符合DSM-IV標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際疾病分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除脆性X染色體綜合征、染色體畸變及由于藥物或神經(jīng)疾病導(dǎo)致的與孤獨(dú)癥癥狀相似的疾病。選擇同期中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室遺傳門診無(wú)孤獨(dú)癥及相關(guān)的精神疾病，無(wú)腦發(fā)育異常、精神或重大軀體疾病的漢族兒童共1 097例，其中男 876例，女221 例；年齡3～10歲，平均(5.24±1.36)歲。兩組研究對(duì)象的父母或監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究均知情同意并簽署知情同意書。兩組兒童性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA 提取采集研究對(duì)象靜脈血 3 mL，常規(guī)氯仿-飽和酚白細(xì)胞提取法提取 DNA，置于-80 ℃ 冰箱保存。

1.2.2基因分型采用Illumina CNV 370-Duo芯片和Illumina 610芯片檢測(cè)所有樣本的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)的等位基因型，獲取Shank3基因的6個(gè)SNPs位點(diǎn)：即rs9616816、rs736334、rs2040487、rs6009951、rs715586、rs8137951的基因分型數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間的年齡比較采用t檢驗(yàn)。哈德溫伯格遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)、等位基因頻率及單體型頻率比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用haploview 4.1分析軟件對(duì)Shank3基因的6個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖不平衡和單體型分析。

2結(jié)果

2.1哈德溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)采用Haploview 4.1軟件對(duì)兩組對(duì)象的Shank3基因分型結(jié)果進(jìn)行哈德溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)，Shank3基因的6個(gè)SNPs分型的基因型頻率分布均未偏離哈德溫伯格平衡(P>0.05)，見表1。

表1　Shank3基因分型結(jié)果的哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)

2.2Shank3基因SNPs的配對(duì)連鎖不平衡檢測(cè)與病例對(duì)照關(guān)聯(lián)分析采用Haploview 4.1軟件對(duì)Shank3基因的6個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，見表2。病例對(duì)照關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，rs736334、rs8137951位點(diǎn)在病例對(duì)照間傳遞與未傳遞的等位基因比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但經(jīng)1 000次模擬置換檢驗(yàn)后的結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Shank3基因的6個(gè)SNPs的病例對(duì)照分析結(jié)果，見表3。

表2　Shank3基因的6個(gè)SNPs的配對(duì)連鎖不平衡D′值

-：此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

表3　Shank3基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)病例對(duì)照分析結(jié)果

2.3Shank3基因病例對(duì)照單體型分析Shank3基因病例對(duì)照單體型分析結(jié)果顯示，rs9616816-rs736334的G-G、A-A單體型及rs715586-rs8137951的G-A單體型在病例對(duì)照間的傳遞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但經(jīng)1 000次模擬置換檢驗(yàn)后的結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，單體型分析結(jié)果，見表4。

表4　Shank3基因病例對(duì)照單體型分析結(jié)果

3討論

Shank3是重要的突觸后致密結(jié)構(gòu)骨架蛋白，是構(gòu)建突觸后密度復(fù)合體的主要成員，在神經(jīng)信號(hào)的傳遞中起橋梁作用，并在突觸的裝配及樹突的形成和成熟中起了重要作用。Shank3基因與突觸的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，與語(yǔ)言發(fā)育相關(guān)[3-6]。已有研究報(bào)道了在部分孤獨(dú)癥患者中Shank3基因存在突變，而在對(duì)照中則沒有發(fā)現(xiàn)該基因的突變[7-8]。且在鼠模型中對(duì)Shank3基因進(jìn)行的功能研究顯示Shank3基因可能與孤獨(dú)癥的致病相關(guān)[10-11]。以上研究結(jié)果提示，Shank3基因可能是孤獨(dú)癥的一個(gè)重要的候選基因，但關(guān)于該基因的多態(tài)性與孤獨(dú)癥的相關(guān)性研究在不同人群中的研究結(jié)果并不一致。

本研究結(jié)果顯示，在未經(jīng)置換檢驗(yàn)前，Shank3基因單核苷酸多肽性位點(diǎn)rs736334、rs8137951的等位基因頻率，rs9616816-rs736334的G-G、A-A單體型頻率和rs715586-rs8137951的G-A單體型頻率在孤獨(dú)癥的病例對(duì)照間的傳遞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但經(jīng)1 000次模擬置換檢驗(yàn)后，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。盡管對(duì)Shank3基因功能研究的結(jié)果提示該基因可能參與孤獨(dú)癥的致病，且在部分孤獨(dú)癥樣本中發(fā)現(xiàn)了該基因的點(diǎn)突變和CNVs的變異，以上研究均提示Shank3基因可能與孤獨(dú)癥的致病相關(guān)。但本研究在漢族人群中未發(fā)現(xiàn)所研究的6個(gè)SNPs與孤獨(dú)癥存在相關(guān)性。本研究所選擇的SNPs位點(diǎn)與Qin等[12]研究所選擇的位點(diǎn)不同，但二者在漢族人群中的研究結(jié)果具有一致性。導(dǎo)致各研究結(jié)果不一致的可能原因有：(1)基因型分布在不同種族中存在差異，不同種族的孤獨(dú)癥致病基因存在差異。(2)由于孤獨(dú)癥的高度異質(zhì)性，盡管在孤獨(dú)癥的患者中發(fā)現(xiàn)了Shank3基因的突變，但其所占的比例少，本研究樣本中可能存在該種變異的樣本少，Shank3基因可能不是孤獨(dú)癥致病的主效基因。此外，本研究樣本只納入了典型孤獨(dú)癥的患兒，不包括非典型孤獨(dú)癥患者、阿斯伯格綜合征患者，樣本的差異可能導(dǎo)致研究結(jié)果不一致。

本研究結(jié)果提示，在漢族人群中Shank3基因可能不是漢族人群孤獨(dú)癥的致病基因，至少不是其致病的主效基因。然而，本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性可能受到以下原因的影響。(1)采用病例對(duì)照研究方法本身受到人群分層的影響，可能導(dǎo)致本研究結(jié)果出現(xiàn)偏差。(2)研究樣本量的限制可能導(dǎo)致微效基因效應(yīng)不能檢出。(3)可能Shank3基因的表觀遺傳修飾在孤獨(dú)癥的致病中起了作用，而本研究不能檢出?；谝陨显?，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)該基因進(jìn)行家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究和表觀遺傳方面的研究。

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A case-control study on Shank3 gene polymorphism and autism in Han children*

LiXiaoping1,HaoChaoliang1,GuoHui2

(1.ReproductiveMedicineCenter,FirstAffiliatedHospital,SouthChinaUniversity,Hengyang,Hunan421001,China;2.StateKeyLaboratoryofMedicalGenetics,CentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410078,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the correlation between the single nucleotide polymorphisms(SNPs) of Shank3 gene with autism in the Han children.MethodsThe SNPs loci of Shank3 gene in 455 Han autistic children(autism group)and 1 097 Han children with no autism and related mental illness(control group) were detected by using Illumina CNV 370-Duo and Illumina 610 chips,the genotyping data were performed the association analysis by using the haploview4.1 software.ResultsThe transmission of allelic frequency of rs736334 and rs8137951 in Shank3 gene and the haplotype frequencies of G-G,A-A in rs9616816-rs736334 and G-A in rs715586-rs8137951 had statistically significant difference between the autism group and the control group (P<0.05),but after the replacement of 1 000 times of simulation test,the results was no longer statistically significant(P>0.05).ConclusionShank3 gene has no correlation with the pathogenesis of autism in the Han children.The Shank3 gene may not be the pathogenic gene of autism in Han children.

[Key words]Shank3 gene;polymorphism,single nucleotide;case-control study

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.013

*基金項(xiàng)目：湖南省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(B2011-067)。

作者簡(jiǎn)介：李小平(1975-)，助理研究員，博士研究生，主要從事人類疾病遺傳致病機(jī)制方面的研究。

[中圖分類號(hào)]R729

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)04-0469-03

(收稿日期：2015-07-02修回日期：2015-10-24)