凌淑萍， 趙 健， 陳 國， 葉宇飛， 許秀琴， 呂 燕， 吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315000)

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熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2型主要毒力因子方法的建立

凌淑萍， 趙 健， 陳 國， 葉宇飛， 許秀琴， 呂 燕， 吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315000)

摘要[目的]建立熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2 型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein,MRP) 和胞外因子(Extracellular protein factor，EF)3種主要毒力因子的方法。[方法]根據(jù)cps2j、mrp和ef基因的基因序列，分別設(shè)計(jì)并合成3對引物及相應(yīng)的Taqman探針,其中cps2j和mrp的5′端標(biāo)記FAM熒光發(fā)射基團(tuán)，ef的5′端標(biāo)記HEX熒光發(fā)射基團(tuán)，3種基因的3′端都標(biāo)記BHQ1淬滅熒光基團(tuán)。通過優(yōu)化反應(yīng)體系和程序，建立了一種基于Taqman探針法的熒光定量PCR方法檢測上述3種主要毒力因子，其中cps2j單獨(dú)檢測，mrp與ef的實(shí)行雙重?zé)晒釶CR 方法檢測。[結(jié)果]cps2j、mrp和ef的最低檢測限分別為12、51和51 CFU，靈敏度很高；與其他病原菌無交叉反應(yīng)，重復(fù)性及特異性均較好；此外，整個(gè)檢測過程在60 min內(nèi)即可完成。[結(jié)論]該試驗(yàn)所建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法的敏感性、重復(fù)性及特異性均較好，可用于同時(shí)快速檢測豬鏈球菌2型3種主要毒力因子。

關(guān)鍵詞豬鏈球菌2型；熒光定量PCR；毒力因子

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，豬鏈球菌分為33個(gè)血清型，其中以豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2，SS2)致病力最強(qiáng)，也是全世界范圍內(nèi)引起人類疾病最常見的致病血清型[1-2]。SS2可引發(fā)豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和肺炎等，各年齡段豬均可感染豬鏈球菌病。SS2不僅是影響各國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，同時(shí)該病還可感染養(yǎng)豬相關(guān)從業(yè)人員，引起細(xì)菌性敗血癥、休克、腦膜炎、永久性聽力喪失，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)及公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。

SS2在很多國家均受到廣泛重視，對其研究主要集中在毒力相關(guān)因子(Virulence correlated facters， VAFs)的研究上。研究表明，VAFs與豬鏈球菌引起的病癥密切相關(guān)[4]。其中，莢膜多糖(CPS)是目前已確定的豬鏈球菌2型主要的細(xì)菌毒力相關(guān)因子，具有抗吞噬的作用[5-6]，因其具有很高的種特異性，csp2j常被作為檢測豬鏈球菌2型的靶基因[7]。此外，溶菌酶相關(guān)蛋白(MRP)和細(xì)胞外蛋白因子(EPF)也是主要毒力相關(guān)因子，人工感染小鼠和豬的試驗(yàn)表明MRP+EF+菌株可致豬產(chǎn)生典型腦膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性漿液炎等疾病，MRP+EF-菌株僅引起的疾病則較為溫和，而MRP-EF-菌株則無致病性[8]。另外，mrp與ef基因串聯(lián)表達(dá)蛋白具有重要的免疫保護(hù)作用[9]。目前,對豬鏈球菌2型的檢測包括細(xì)菌培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)和qPCR等分子生物學(xué)檢測方法，與傳統(tǒng)的方法相比qPCR方法能夠快速、準(zhǔn)確檢測豬鏈球菌2型，被廣泛應(yīng)用于豬鏈球菌病的檢測與診斷方面[10]。筆者針對豬鏈球菌2型3個(gè)主要的毒力相關(guān)因子(cps2j、mrp、ef)分別設(shè)計(jì)引物與Taqman探針，cps2j單獨(dú)實(shí)行熒光定量法，用以檢測豬鏈球菌2型是否存在，而mrp和ef實(shí)行雙重?zé)晒舛縋CR方法，檢測豬鏈球菌2型的毒力情況，以期為豬鏈球菌的疾病防控與公共衛(wèi)生提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。豬鏈球菌2型ATCC43765，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌ATCC6538、單增李斯特菌ATCC29212、沙門氏菌ATCC14028、大腸埃希氏菌ATCC25922、乙型溶血性鏈球菌ATCC21059，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器。腦心浸液肉湯和瓊脂粉，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA(上海生工股份有限公司)；Premix ExTaqTM試劑盒(TaKaRa)；steponeplusTM定量PCR儀(ABI)；溶菌酶(BIOSHARP)；蛋白酶K(上海生工股份有限公司)。

1.2引物和TaqMan 探針根據(jù)GenBank 公布的豬鏈球菌2 型csp2j基因序列鑒定菌種參考基因序列(登錄號JX986792.1)，其他2個(gè)毒力因子基因mrp(登錄號 X64450.1)、ef(登錄號JF813371.1)，探針的5’端分別標(biāo)記FAM、FAM、HEX；3’端標(biāo)記BHQ1。使用Beacon Designer 7設(shè)計(jì)引物和探針，均由Life公司合成。引物和探針序列如表1所示。

表1　引物和探針序列

1.3細(xì)菌計(jì)數(shù)豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于腦心浸液肉湯，37 ℃下培養(yǎng)24 h。取1 mL培養(yǎng)液置于9 mL生理鹽水中，搖勻，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度的菌液1 mL置于培養(yǎng)皿中，加入含1.5%瓊脂的腦心浸液肉湯，混合均勻，每個(gè)稀釋度的細(xì)菌做2個(gè)平行，37 ℃下培養(yǎng)24 h ，取合適細(xì)菌生長數(shù)的培養(yǎng)皿，計(jì)算每毫升菌落形成單位(Colony forming units,CFU)。

1.4熒光定量PCR

1.4.1豬鏈球菌2型基因組DNA的提取。取2 mL細(xì)菌增菌培養(yǎng)液，10 000×g 離心1 min，棄上清，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體方法參照使用說明書。

1.4.2熒光定量PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在Stepone Plus(ABI)上進(jìn)行，單熒光反應(yīng)體系(20 μL)：Premix ExTaqTM10 μL、10 μmol/L引物各0.4 μL、probe 0.8 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、DNA模板2 μL、超純水6.0 μL；雙重?zé)晒夥磻?yīng)體系(20 μL)：Premix ExTaqTM10 μL、10 μmol/L引物1、引物2各0.4 μl，probe 1、probe 2各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，超純水4.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的60 ℃時(shí)收集熒光信號。

1.4.3特異性試驗(yàn)。運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室保存的金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、乙型溶血性鏈球菌作為特異性試驗(yàn)的對照組進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與靈敏度檢測。取1 mL 37 ℃過夜培養(yǎng)的菌液，用生理鹽水進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋；取適量稀釋液做細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)，使用試劑盒法提取細(xì)菌基因組，提取基因組通過熒光PCR進(jìn)行檢測。

2結(jié)果與分析

圖1　S.suis 2 cps2j、mrp、ef實(shí)時(shí)熒光定量PCR的動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.1　The dynamic curve of the triple real-time qPCR for cps2j,mrp,ef in S.suis serotype 2

圖2　純培養(yǎng)豬鏈球菌2型DNA的實(shí)時(shí)PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Real-time PCR standard curve of S.suis serotype 2 DNA

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的豬鏈球菌2 型基因組DNA 進(jìn)行定量擴(kuò)增。擴(kuò)增曲線如圖1所示。取10-5、10-6稀釋度的豬鏈球菌2 型菌進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果表明10-5稀釋度細(xì)菌數(shù)多不可計(jì)，10-6稀釋度的細(xì)菌拷貝數(shù)為120 CFU。以起模板數(shù)的對數(shù)為X軸，以Ct值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到cps2j、mrp、ef3種基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-3.185 9x+39.901(R=0.999 2)、y=-3.165x+ 41.533(R= 0.997 5)、y=-3.275 7x+40.689(R2= 0.997 2)(圖2)。

2.2靈敏度檢測根據(jù)陽性對照細(xì)菌數(shù)計(jì)算拷貝數(shù)，檢測倍比稀釋的陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此體系中cps2j最低可檢測細(xì)菌拷貝數(shù)為12 CFU，而mrp和ef最低可檢測細(xì)菌拷貝數(shù)均為51 CFU(圖3)。

2.3特異性試驗(yàn)運(yùn)用保存的金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、乙型溶血性鏈球菌作為特異性試驗(yàn)的對照組進(jìn)行試驗(yàn)。 結(jié)果表明，該方法能夠特異地檢測出豬鏈球菌2型，而其他對照組的檢測結(jié)果均為陰性，說明該體系具有良好的特異性。

3討論與結(jié)論

豬鏈球菌是一種危害嚴(yán)重的條件性致病菌，亞臨床的病原攜帶者是豬鏈球菌的主要傳染源。該病原對我國食品安全、畜牧業(yè)生產(chǎn)安全以及相關(guān)從業(yè)人員具有巨大威脅。1998年和2005年已經(jīng)分別在我國江蘇省和四川省引起了豬鏈球菌2型2次大規(guī)模的爆發(fā)，并伴隨著豬群大規(guī)模的鏈球菌中毒性休克綜合癥和異常升高的死亡率[11-13]，引起了公眾對豬鏈球菌2型的極大關(guān)注。加強(qiáng)對豬鏈球菌尤其是對豬鏈球菌2型的檢測力度，對于預(yù)防和控制豬鏈球菌病具有重要的意義[14]。目前，PCR技術(shù)在病原菌的檢測與診斷方面已被廣泛應(yīng)用。

圖3　豬鏈球菌2型最低檢出限D(zhuǎn)NA的實(shí)時(shí)PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Real-time PCR standard curve of detection limit of S.suis serotype 2 DNA

該試驗(yàn)采用的qPCR技術(shù)是PCR技術(shù)中的一種，它不僅有常規(guī)PCR技術(shù)的擴(kuò)增高效率的特點(diǎn)，還具有探針的高度特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和精確性等特點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于醫(yī)療、藥物研究、病原菌的檢測等體外擴(kuò)增技術(shù)[15]。此外，整個(gè)反應(yīng)過程是由儀器自動(dòng)控制并進(jìn)行結(jié)果分析，避免了后續(xù)電泳等步驟，減少污染。豬鏈球菌菌株根據(jù)毒力因子的差異，可分為強(qiáng)毒力株(MRP+EF+)、弱毒力株(MRP+EF-)和無毒力株(MRP-EF-)[16]。該試驗(yàn)參照GenBank中豬鏈球菌2型3種毒力因子cps2j、mrp和ef基因序列，選擇其高度保守區(qū)，利用Beacon Designer 7軟件分別設(shè)計(jì)3對特異性的引物及相應(yīng)的Taqman探針。cps2j基因采用單重?zé)晒釶CR技術(shù)，用于檢測SS2是否存在。另外，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和程序，建立一種基于Taqman探針法的雙重?zé)晒舛縋CR方法檢測mrp和ef2個(gè)毒力因子基因。優(yōu)化反應(yīng)體系后mrp和ef基因的擴(kuò)增效率基本與單重qPCR相一致，而且2種熒光信號的收集不存在互相干擾，可建立良好動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。該試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性、重復(fù)性及特異性均較好，而且操作方便，簡單快速，可為豬鏈球菌2型菌株的分離和毒力鑒定提供參考。

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Establishment of the Real-time qPCR method for Detection of Main Virulence Factors ofStreptococcussuisSerotype 2

LING Shu-ping,ZHAO Jian,CHEN Guo et al

(Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo,Zhejiang 315000)

Abstract[Objective] Taq Man real-time qPCR was established for detection of Streptococcus suis serotype 2(SS2),muramidase-released protein(MRP) and extracellular protein factor(EF).[Method] The double Taq Man real-time PCR assay was developed to simultaneously detect virulence genes cps2j,mrp and ef of S.suis serotype 2.Three pairs of specific primers and fluorogenic-labeled probes were designed and synthesized in accordance with the above target genes.The 5′-ends of probes for cps2j and mrp were labeled with FAM,while the 5′-ends of ef were individually labeled with HEX,and their 3′-ends were all labeled with quencher BHQ1.The reaction system and procedures were optimized.[Result] The detection limits for purified recombinant plasmids of cps2j,mrp and ef were 12,51 and 51 CFU,respectively.There was no cross reaction between S.suis serotype 2 and other pathogens.The entire detection could be completed within 60 min.[Conclusion] The double Taq Man real-time PCR assay developed in this study is fast,sensitive,repeatable and specific,which can be used for rapid detection of three kinds of virulence factors of S.suis serotype 2.

Key wordsStreptococcus suis serotype 2; Real-time qPCR; Virulence factors

基金項(xiàng)目寧波市農(nóng)科教結(jié)合項(xiàng)目(2015NK24)。

作者簡介凌淑萍(1987- )，女，浙江寧波人，碩士研究生，研究方向：微生物檢測。

收稿日期2016-02-24

中圖分類號S 852.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-138-03