蔣璐璐， 魏 萱， 趙艷茹， 邵詠妮， 裘正軍， 何 勇*

1. 浙江經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 浙江 杭州 310018

2. 福建農(nóng)林大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院， 福建 福州 350002

3. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310058

小球藻、球等鞭金藻和螺旋藻生物量高光譜成像的可視化研究

蔣璐璐1， 魏 萱2, 3， 趙艷茹3， 邵詠妮3， 裘正軍3， 何 勇3*

1. 浙江經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 浙江 杭州 310018

2. 福建農(nóng)林大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院， 福建 福州 350002

3. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310058

微藻高效培養(yǎng)是微藻生物能源開發(fā)利用的關(guān)鍵和前提， 而在營養(yǎng)充足的培養(yǎng)條件下生長迅速但較易受到環(huán)境污染和影響， 因此微藻生長過程中對(duì)其生長狀況進(jìn)行監(jiān)測意義重大。 高光譜成像技術(shù)同時(shí)擁有豐富物質(zhì)品質(zhì)信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)和圖像包含豐富品質(zhì)分布空間信息的優(yōu)點(diǎn)， 可為微藻的快速無損檢測提供新的方法和手段。 分別采集小球藻、 球等鞭金藻和螺旋藻三種微藻各45個(gè)樣本的高光譜圖像， 并提取樣本感興趣區(qū)域(ROI)的平均光譜。 利用連續(xù)投影算法(SPA)波長優(yōu)選之后， 取30個(gè)建模集樣本的光譜數(shù)據(jù)與其相應(yīng)的生物量建立多元線性回歸(MLR)模型， 對(duì)15個(gè)預(yù)測集樣本的生物量進(jìn)行預(yù)測， 小球藻、 球等鞭金藻和螺旋藻預(yù)測相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.950， 0.969和0.961， 預(yù)測均方根誤差(RMSEP)為0.010 2， 0.010 7和0.017 1， 獲得了較好的預(yù)測精度。 最后， 用所建MLR模型對(duì)預(yù)測集圖像上每個(gè)像素點(diǎn)的生物量加以預(yù)測， 采用Matlab圖像編程處理將不同的生物量用不同的顏色表示， 最終以偽彩圖的形式實(shí)現(xiàn)藻液生物量的可視化。 研究結(jié)果表明， 高光譜成像技術(shù)對(duì)小球藻和螺旋藻藻液生物量的可視化效果較好， 對(duì)球等鞭金藻的預(yù)測效果還需要進(jìn)一步改進(jìn)。 本研究為實(shí)現(xiàn)微藻生長信息的快速獲取和進(jìn)一步開展微藻生物質(zhì)能源利用奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

小球藻； 球等鞭金藻； 螺旋藻； 高光譜圖像； 生物量

引 言

在眾多的生物質(zhì)原料中， 微藻具有光合作用效率高、 生長周期短、 生長迅速、 占地面積小、 單位面積生產(chǎn)力高、 易于培養(yǎng)及生長過程中可高效固定二氧化碳同時(shí)減少環(huán)境污染等顯著優(yōu)勢[1]， 將微藻轉(zhuǎn)化為潔凈能源——生物柴油得到了越來越廣泛的關(guān)注和重視[2-4]。

微藻高效培養(yǎng)是微藻生物能源開發(fā)利用的關(guān)鍵和前提[5]。 微藻是一種介于微生物與植物之間的一種生物[6]， 在營養(yǎng)充足的培養(yǎng)條件下生長迅速但較易受到其他環(huán)境微生物的污染和影響， 對(duì)微藻的生長狀況進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測意義重大。 而微藻形態(tài)微小， 生長于水環(huán)境中， 生命生長信息獲取難度較大。 因此， 如果能夠快速得到微藻生長品質(zhì)信息， 將有助于養(yǎng)殖者對(duì)微藻的生長環(huán)境參數(shù)(如光照、 溫度、 營養(yǎng)元素等)進(jìn)行優(yōu)化， 制定適宜微藻生長的管理和控制策略， 從而提高微藻生產(chǎn)效率， 增加產(chǎn)量。 高光譜成像技術(shù)既擁有高光譜包含物質(zhì)品質(zhì)信號(hào)豐富的優(yōu)點(diǎn)， 又擁有圖像包含豐富品質(zhì)分布空間信息的優(yōu)點(diǎn)， 能實(shí)現(xiàn)快速信息采集， 獲取數(shù)據(jù)量大， 檢測過程無損、 無污染、 無需預(yù)處理的綠色分析技術(shù)[7]， 可為微藻的快速無損檢測提供新的方法和手段。

通過對(duì)三種微藻的可見-近紅外高光譜圖像分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和Matlab圖像編程， 通過對(duì)微藻圖像上每個(gè)像素點(diǎn)預(yù)測生物量的可視化， 考察了高光譜成像技術(shù)對(duì)于微藻生物量預(yù)測的應(yīng)用潛力， 為微藻生長信息的快速獲取和進(jìn)一步開展微藻生物質(zhì)能源提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

小球藻(Chlorellasp.)、 球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和螺旋藻(Spirulinasp.)， 三種藻種購買于中國科學(xué)院淡水藻種庫(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology， FACHB-collection)分別培養(yǎng)于BG11培養(yǎng)基、 Erdschreiber’s培養(yǎng)基和Spirulina培養(yǎng)基。

1.1.1 BG11培養(yǎng)基

1 L BG11培養(yǎng)基中包含100 mL濃度為15.0 g·L-1的NaNO3， 10 mL濃度為1 g·L-1的K2HPO4， 10 mL濃度為1.875 g·L-1的MgSO4·7H2O， 10 mL濃度為0.9 g·L-1的CaCl2·2H2O， 10 mL濃度為0.15 g·L-1的檸檬酸， 10 mL濃度為0.5 g·L-1的EDTANa2， 1 mL微量元素混合液A5。 其中， 每1 L的A5微量元素混合溶液包括A52.86 g的H3BO3， 1.86 g的MnCl2， 0.22 g的ZnSO4·7H2O， 0.39 g的Na2MoO4·2H2O， 0.08 g的CuSO4·5H2O， 0.05 g的Co(NO3)2·6H2O。

1.1.2 Erdschreiber’s培養(yǎng)基

由Plymouth海水培養(yǎng)基配方改制而成。 總量為3L的培養(yǎng)基中包括3 L滅菌海水， 36 mL P-IV金屬溶液， 10 mL NaNO3， Na2HPO4·7H2O， 150 mL土壤提取液， 3 mL維生素B12。 其中， 1 L金屬溶液中包括950 mL水， 待加入0.75 g Na2EDTA·2H2O， 0.097 g FeCl3·6H2O， 0.041 g MnCl2·4H2O， 0.005 g ZnCl2， 0.002 g CoCl2·6H2O和0.004 g Na2MoO4·2H2O后， 定容1 L。 土壤提取液： 取花園土(未施過肥)200 g置于燒杯或三角瓶中， 加入蒸餾水1 L， 瓶口用透氣塞封口， 在水浴沸水加熱3 h， 冷卻， 沉淀24 h， 此過程連續(xù)進(jìn)行3次， 后過濾， 取上清液， 于高壓滅菌鍋中滅菌后4 ℃冰箱中保存。

1.1.3Spirulina培養(yǎng)基

每1 L的Spirulina培養(yǎng)基包括13.61 g NaHCO3， 4.03 g Na2CO3， 0.50 g K2HPO4， 2.50 g NaNO3， 1.00 g K2SO4， 1.00 g NaCl， 0.20 g MgSO4·7H2O， 0.04 g CaCl2·2H2O， 0.01 g FeSO4·7H2O， 1 mL微量金屬混合液A5。 由1 L去離子水配制的微量金屬混合液A5包括2.86 g H3BO3， 1.81 g MnCl2·4H2O， 0.222 g ZnSO4·7H2O， 0.039 g NaMoO4·2H2O， 0.079 g CuSO4·5H2O和0.049 g Co(NO3)2·6H2O。

1.1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基用去離子水配制后置于高溫高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌30 min， 待冷卻至室溫后， 在超凈臺(tái)內(nèi)接種。 室內(nèi)溫度保持于25 ℃， 相對(duì)濕度約80%， 光強(qiáng)2 500 Lux， 光照周期12 L∶12 D。 每個(gè)培養(yǎng)瓶中放入磁轉(zhuǎn)子， 利用磁力攪拌器分為早中晚各三次進(jìn)行攪拌， 以確保CO2在瓶中的溶解量。

1.2 主要儀器及裝置

高光譜成像系統(tǒng)獲取微藻高光譜圖像示意圖如圖1所示。 將儀器預(yù)熱30 min， 儀器穩(wěn)定之后再進(jìn)行光譜采集。 可見-近紅外光譜相機(jī)的光譜分辨率為2.8 nm， 所采集的光譜范圍為380～1 030 nm。 采用可見-近紅外光譜相機(jī)采集光譜數(shù)據(jù)時(shí)， 高光譜儀器采集裝置的參數(shù)設(shè)置為： 曝光時(shí)間2.0 ms， 載物移動(dòng)平臺(tái)移動(dòng)速度為8 mm·s-1。 在獲取藻液的反射光譜時(shí)， 為了消除光源等儀器差異因素等對(duì)樣本的影響， 在采集高光譜圖像前進(jìn)行黑白板校正， 對(duì)獲得的圖像用式(1)校正

(1)

其中，I0是樣本原始光譜，Idark是黑板的反射率(約0%)；Iwhite是白色聚四氟乙烯板的反射率(約100%)。

Fig.1 The hyperspectral images acquisition of microalgae

1.3 微藻生物量的測定

采集高光譜圖像之后， 將離心管烘干至恒重并稱重； 測定培養(yǎng)皿內(nèi)微藻懸液的體積并轉(zhuǎn)移至離心管中； 在3 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心5 min， 去除上清液； 藻液和離心管一起放入烘箱， 在80 ℃烘干至恒重并稱重計(jì)算。 微藻生物量計(jì)算公式

(2)

式中：m2是微藻干物質(zhì)重，m0是離心管重量，m1是藻粉和離心管重量。 將計(jì)算得到的生物量除以藻液體積即為單位體積的生物量(g·L-1)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 多元線性回歸

多元線性回歸(multiple linearregression， MLR)是多元統(tǒng)計(jì)分析中的一個(gè)重要方法， 被廣泛應(yīng)用于社會(huì)、 經(jīng)濟(jì)、 技術(shù)以及眾多自然科學(xué)領(lǐng)域的研究。 在回歸分析中， 如果有兩個(gè)或兩個(gè)以上的自變量， 由多個(gè)自變量的最優(yōu)組合共同來預(yù)測或估計(jì)因變量， 稱為多元回歸[8]。 多元線性回歸模型的表達(dá)方程為式(3)， 本研究中回歸模型的建立是基于UnscramblerV9.7(CAMO, Proces, AS, OSLO, Norway)軟件。

(3)

1.4.2 連續(xù)投影算法

連續(xù)投影算法(successive projections algorithm， SPA)是一種變量提取方法， 該算法目的是降低變量彼此之間的共性， 從而達(dá)到改進(jìn)多變量線性回歸的效果[9]。 SPA通過對(duì)光譜數(shù)據(jù)投影映射構(gòu)造新的變量集， 能夠從光譜信息中充分尋找含有最低限度冗余信息的變量組， 并能最大程度避免信息重疊[10]。 在本研究中為了減少變量以利于建立生物量預(yù)測的多元線性回歸模型。

1.4.3 微藻生物量的可視化

高光譜圖像上每個(gè)像素點(diǎn)都有一條光譜曲線， 利用波長優(yōu)選后選出的最具有代表性的特征波段建立的微藻生物量預(yù)測模型預(yù)測15個(gè)預(yù)測集樣本的每個(gè)像素點(diǎn)的生物量， 即使每個(gè)像素點(diǎn)的光譜變量得到對(duì)應(yīng)的微藻生物量， 再采用Matlab圖像編程方法將不同的生物量用不同的顏色表示， 最終得到微藻生物量的預(yù)測偽彩圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物量分析

每種微藻采集45個(gè)樣本， 分別將樣本的2/3作為建模集， 剩余1/3作為預(yù)測集， 以確保建模集的生物量范圍包含預(yù)測集的所有生物量。 三種微藻總樣本的生物量平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差結(jié)果如表1所示。

2.2 三種微藻高光譜圖像

通過高光譜成像系統(tǒng)獲取的高光譜RGB圖像如圖2所示， 從圖2可以看出， 無論是微藻生長形態(tài)還是外觀顏色， 三種微藻都表現(xiàn)出顯著差異。 小球藻高光譜RGB圖像整體藻液顏色較濃； 球等鞭金藻的藻液顏色較淡， 少數(shù)藻體有聚

Table 1 The average and standard deviation of

Fig.2 The hyperspectral images of the three microalgae

集現(xiàn)象； 螺旋藻藻液中分布著藻體， 并呈現(xiàn)出成片聚集的現(xiàn)象， 三種微藻具有一定代表性。

2.3 感興趣區(qū)域范圍可見-近紅外光譜

在獲取圖像的培養(yǎng)皿范圍內(nèi)盡量提取較大的感興趣區(qū)域， 避開藻液的反光范圍。 感興趣區(qū)域的可見-近紅外光譜在380～420 nm范圍有一部分噪音， 420～1 020 nm范圍內(nèi)的光譜吸光度平均光譜圖如圖3所示。 從光譜可以看到在屬于色素吸收波段的430和680 nm[11]， 以及在屬于水的吸收范圍的980 nm附近有比較明顯的吸收峰[12]。

Fig.3 Mean VIS/NIR absorbance curves of the three microalgae

2.4 特征波段提取及多元線性回歸模型建立

對(duì)三種微藻的高光譜感興趣區(qū)域可見-近紅外光譜分別利用SPA進(jìn)行特征波長優(yōu)選， 并建立多元線性回歸模型。 建立的模型及最終得到的微藻生物量預(yù)測多元線性回歸方程結(jié)果如表2所示。 結(jié)果表明， 利用SPA優(yōu)選出的特征波長所建立的生物量預(yù)測的多元線性回歸模型精度較好， 可以用來進(jìn)行下一步的藻液生物量的可視化研究。

Table 2 Results of MLR model for the biomass prediction using the variables selected by SPA

2.5 微藻生物量的可視化

用所建立的MLR模型預(yù)測預(yù)測集樣本的高光譜圖像上每個(gè)像素點(diǎn)的生物量， 并以偽彩圖的形式將其可視化， 如圖4所示。 各方形圖中由下而上顏色深淺發(fā)生變化， 表示生物量濃度逐漸增大。 可視化圖像的某色素點(diǎn)對(duì)應(yīng)右邊的進(jìn)度條可以得到該點(diǎn)的預(yù)測生物量值。 從圖4中可以看出， 小球藻[圖4(a)]和螺旋藻[圖4(c)]不同濃度的藻液高光譜的可視化結(jié)果較好， 而球等鞭金藻的結(jié)果相對(duì)較差， 還有待于提高， 球等鞭金藻藻液仍含有較多生物量， 但是在圖4(b)中卻顯示出許多部分都沒有或含有極低濃度的藻液， 這與實(shí)際并不十分符合， 出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是因?yàn)榍虻缺藿鹪逶逡旱念伾容^淡， 在進(jìn)行信息采集時(shí)受背景的干擾可能比較大， 需要更多的技術(shù)手段去除背景等的干擾或改進(jìn)高光譜圖像采集方式。 從圖像整體來看， 三種微藻可視化效果與之前得到的高光譜圖像RGB波段下的圖像特征較一致： 小球藻藻液藻體分布較均勻， 藻體聚集程度不十分明顯； 球等鞭金藻有少數(shù)藻體聚集； 螺旋藻成片聚集的現(xiàn)象比較明顯。 可視化結(jié)果為實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行微藻培養(yǎng)時(shí)制定管理策略提供了一種有效的方法： 微藻在生長過程中需要吸收光能， 若藻體聚集在一起則會(huì)影響微藻的光合作用， 實(shí)際生產(chǎn)中高光譜相機(jī)可以采集更大面積區(qū)域的藻液， 利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行可視化分析可以直觀地獲取培養(yǎng)池中微藻的生物量分布信息， 基于獲取的信息可及時(shí)進(jìn)行攪拌或者收獲。

Fig.4 Visualization of the predicted biomass of the microalgae in prediction set

3 結(jié) 論

采用了高光譜成像分技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)小球藻、 球等鞭金藻和螺旋藻三種微藻生物量的快速無損檢測方法和可視化進(jìn)行了分析。 研究結(jié)果表明利用該高光譜成像系統(tǒng)獲得的樣本的平均光譜對(duì)微藻生物量建立的MLR預(yù)測模型， 取得了較好的結(jié)果。 在建立模型的基礎(chǔ)上， 通過圖像處理分析， 對(duì)小球藻和螺旋藻藻液中微藻生物量分布取得了較好的可視化分析結(jié)果， 而對(duì)球等鞭金藻的可視化分析結(jié)果卻相對(duì)較差， 信息獲取過程與圖像分析需進(jìn)一步優(yōu)化。 本研究為實(shí)現(xiàn)微藻的生長信息快速獲取和進(jìn)一步開展能源利用奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

[1] Yusuf C. Biotechnology Advances， 2007， 25(3)： 294.

[2] Hill J， Nelson E， Tilman D， et al. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2006， 103(30)： 11206.

[3] Zou Shuping， Wu Yulong， Yang Mingde， et al. Energy & Fuels， 2009， 23(7)： 3753.

[4] YOU Jin-kun， YU Xu-ya， CUI Jia-li(游金坤， 余旭亞， 崔佳麗). China Oils and Fats(中國脂肪)， 2011， (3)： 47.

[5] Brennan L， Owende P. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2010， 14(2)： 557.

[6] Falkowski P G， Katz M E， Knoll A H， et al. Science， 2004， 305(5682)： 354.

[7] Wei Xuan， Liu Fei， Qiu Zhengjun， et al. Food and Bioprocesss Technology， 2013， 118， 387.

[8] YU Jia-jia， HE Yong(虞佳佳， 何 勇). Spectroscopy and Spectral Analysis(光譜學(xué)與光譜分析)， 2013， 33(8)： 2168.

[9] Liu Fei， He Yong. Food Chemistry， 2009， 115(4)： 1430.

[10] Wu Di， He Yong， Nie Pengcheng， et al. Analytica Chimica Acta， 2010， 659(1-2)： 229.

[11] Birth G S， Dull G G， Magee J B， et al. Journal American Society for Horticultural Science， 1984， 109(1)： 62.

[12] Jie Dengfei， Xie Lijuan， Rao Xiuqin， et al. Postharvest Biology and Technology， 2014， 90： 1.

*Corresponding author

Study on the Visualization of the Biomass ofChlorellasp. ，Isochrysisgalbana， andSpirulinasp. Based on Hyperspectral Imaging Technique

JIANG Lu-lu1， WEI Xuan2,3， ZHAO Yan-ru3， SHAO Yong-ni3， QIU Zheng-jun3， HE Yong3*

1. Zhejiang Technology Institute of Economy, Hangzhou 310018, China

2. College of Mechanical and Electronic Engineering, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

3. College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Effective cultivation of the microalgae is the key issue for microalgal bio-energy utilization. In nutrient rich culture conditions, the microalge have a fast growth rate, but they are more susceptible to environmental pollution and influence. So to monitor the the growth process of microalgae is significant during cultivating. Hyperspectral imaging has the advantages of both spectra and image analysis. The spectra contain abundant material quality signal and the image contains abundant spatial information of the material about the chemical distribution. It can achieve the rapid information acquisition and access a large amount of data. In this paper, the authors collected the hyperspectral images of forty-five samples ofChlorellasp.,Isochrysisgalbana, andSpirulinasp., respectively. The average spectra of the region of interest (ROI) were extracted. After applying successive projection algorithm (SPA), the authors established the multiple linear regression (MLR) model with the spectra and corresponding biomass of 30 samples, 15 samples were used as the prediction set. ForChlorellasp.,Isochrysisgalbana, andSpirulinasp., the correlation coefficient of prediction (rpre) are 0.950, 0.969 and 0.961, the root mean square error of prediction (RMSEP) for 0.010 2, 0.010 7 and 0.007 1, respectively. Finally, the authors used the MLR model to predict biomass for each pixel in the images of prediction set; images displayed in different colors for visualization based on pseudo-color images with the help of a Matlab program. The results show that using hyperspectral imaging technique to predict the biomass ofChlorellasp. andSpirulinasp. were better, but for theIsochrysisgalbanavisualization needs to be further improved. This research set the basis for rapidly detecting the growth of microalgae and using the microalgae as the bio-energy.

Chlorellasp.；Isochrysisgalbana；Spirulinasp., Hyperspectral images； Biomass

Sep. 26, 2014; accepted Jan. 30, 2015)

2014-09-26，

2015-01-30

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY14C130008)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31072247)資助

蔣璐璐， 女， 1973年生， 浙江經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授 e-mail: abbyu111@sina.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: yhe@zju.edu.cn

S216.2， TK6

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)03-0795-05