吳秀文， 郝艷淑， 雷 晶， 姜存?zhèn)}

華中農業(yè)大學微量元素研究中心， 農業(yè)部長江中下游耕地保育重點實驗室， 湖北 武漢 430070

鉀硼脅迫對棉花功能葉物質成分影響的FTIR表征

吳秀文， 郝艷淑， 雷 晶， 姜存?zhèn)}*

華中農業(yè)大學微量元素研究中心， 農業(yè)部長江中下游耕地保育重點實驗室， 湖北 武漢 430070

鉀和硼均是植物必需的營養(yǎng)元素， 對植物的生長、 發(fā)育與生理代謝等起著重要作用。 棉花對鉀和硼都有較高的需求量， 而棉花缺鉀或缺硼時有發(fā)生。 以鄂抗8號品種的棉花作為研究材料， 利用傅里葉變換探討鉀硼脅迫對棉花功能葉片物質成分的影響。 紅外光譜(FTIR)對鉀硼脅迫下棉花葉片的物質成分進行研究， 分析鉀硼缺乏情況下葉片紅外光譜的差異。 結果表明： (1)缺鉀處理時， 1 546.86, 1 438.85, 1 153.39和1 024.17 cm-1這4個特征峰消失， 且其他特征峰的相對吸光度值與正常處理相比均減小， 表明缺鉀時棉花功能葉片蛋白質、 纖維素、 可溶性糖和核糖的結構發(fā)生變化且含量降低。 (2)缺硼條件下， 葉片的特征峰的相對吸光度均有所升高， 因而， 缺硼則導致蛋白質及可溶性糖、 纖維素等碳水化合物等的運輸受阻而在葉片中積累。 (3)鉀硼同時缺乏， 棉花功能葉片特征峰的位置和相對吸收強度與正常處理相比有很大差異， 表現(xiàn)為棉花功能葉片蛋白質和可溶性糖等碳水化合物的含量升高， 而核酸和多糖分子等含量下降。 因此缺鉀導致棉花功能葉片蛋白質、 纖維素、 可溶性糖和核糖結構變化的含量降低； 缺硼時蛋白質及可溶性糖、 纖維素等碳水化合物等在葉片中積累； 缺鉀缺硼時蛋白質和可溶性糖等碳水化合物含量升高， 而核酸和多糖分子等含量下降。

鉀； 硼； 功能葉片物質成分； FTIR

引 言

棉花既是重要的纖維作物， 又是優(yōu)良的油料作物， 棉花產業(yè)對整個國民經(jīng)濟的發(fā)展具有非常重要的作用[1]。 棉花對鉀有較高的需求量， 且對缺鉀較敏感， 利用能力偏低[2]。 低鉀脅迫下棉花生長受阻， 體內代謝發(fā)生變化， 葉片結構相應地也受到影響， 同時， 葉面積、 厚度變化及葉片光合熒光特性等也有影響[3-5]。 棉花對硼的需求也較高， 適宜的硼營養(yǎng)是其高產優(yōu)質的保證[6]。

傅里葉紅外光譜(FTIR)技術是近年來興起的研究植物生長發(fā)育的一項重要且方便快捷技術， 能基于化合物中官能團和極性鍵的振動進行定量分析， 可以幫助判斷分子中含有何種官能團， 更重要的是可以比較不同處理樣品的紅外光譜差異， 從而反映樣品在植物化學組成上的差異程度[7]。 植物體內核酸、 脂類和碳水化合物等生物大分子， 具有特征性的官能團和獨特的分子振動模式[8]， 通過對官能團和分子振動模式的判斷， 可以反映生物大分子的變化。 歐全宏等利用FTIR對水稻稻瘟病葉、 玉米和蠶豆銹病葉的研究發(fā)現(xiàn)， 感病葉片中糖類、 蛋白質和脂類化合物發(fā)生了明顯變化。 王盛鋒等[9]利用FTIR研究了玉米缺鋅時碳水化合物、 脂類、 蛋白質及核酸含量的變化。 Abidi[10]利用FTIR研究棉花生長過程中細胞壁纖維素含量的變化。 薛生國等[11]對植物葉片F(xiàn)TIR 譜圖的特征峰的研究發(fā)現(xiàn)植物葉片主要由多糖、 脂類、 蛋白質的振動吸收譜帶組成。 然而， 利用FTIR探討鉀硼對作物器官中生物大分子的組成、 含量及結構等影響的研究甚少。 因此， 本試驗用常規(guī)棉花為材料， 以FTIR技術來表征鉀硼脅迫下棉花功能葉的化學組分的變化特點， 為棉花鉀硼生理代謝的機制研究提供新的思路與方法。

1 實驗部分

1.1 材料和設計

試驗材料為華中農業(yè)大學棉花遺傳育種研究室提供的鄂抗8號。 用阿夫多寧和Arnon配方： 0.240 g·L-1NH4NO3, 0.100 g·L-1Na2HPO4·12H2O, 0.100 g·L-1NaH2PO4·H2O, 0.360 g·L-1CaCl2·2H2O, 0.500 g·L-1MgSO4·7H2O， 1.81 mg·L-1MnCl2·4H2O， 0.22 mg·L-1ZnSO4·7H2O， 0.08 mg·L-1CuSO4·5H2O， 0.09 mg·L-1Na2MoO4， 48.5 mg·L-1EDTA-Fe。 設正常(20 mg·L-1KCl, 0.2 mg·L-1B)、 缺鉀(-K， 2 mg·L-1KCl)、 缺硼(-B， 0.002 mg·L-1B)、 缺鉀缺硼(-K-B， 2 mg·L-1KCl、 0.002 mg·L-1B)4個處理， 重復3次。 選取均勻飽滿的種子， 于50～60 ℃水中浸泡24 h， 露白后在濕潤的紗布上催芽后轉入3 L黑塑料袋避光的塑料桶， 定植1株， 脫脂棉固定。 開始先用1/4全量濃度營養(yǎng)液預培養(yǎng)， 第二周開始用1/2 濃度營養(yǎng)液處理， 從第三周開始之后用全量濃度營養(yǎng)液處理。 上午、 下午各通氣20 min， 營養(yǎng)液每周更換1次， 培養(yǎng)35天。

培養(yǎng)過程中要注意防治病蟲害的發(fā)生， 定期記錄植株的生長動態(tài)， 收獲后葉片經(jīng)105 ℃殺青0.5 h ， 再在70 ℃下烘干至恒重。

1.2 樣品處理

選取棉花倒4片葉烘干研磨備用， 使用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR-NEXUSTM， 測定區(qū)域為4 000～400 cm-1， 掃描次數(shù)32次， 分辨率4 cm-1)進行測定， 重復6次。 具體步驟為： 葉片烘干磨碎過0.2 mm 篩， 取少量樣品與KBr放入瑪瑙研缽中研磨并混合均勻后小心倒入壓模中， 使樣品在模中均勻堆積， 在真空條件下， 用壓桿緩慢加壓至約為15 Mpa， 維持1 min， 即可得樣品薄片。 將所得到的薄片放入準備好的紅外光譜儀測定系統(tǒng)中， 即測得各組樣品的原始紅外光譜數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用OPUS 6.5軟件采集數(shù)據(jù)并進行基線校正， Omnic8.0 軟件對不同樣品的FTIR譜圖進行數(shù)據(jù)處理， Origin8.6軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 鉀硼共同脅迫下棉花功能葉片的FTIR全圖譜分析

棉花功能葉片中各化學鍵的吸收處于中紅外區(qū)(圖1)， 即波數(shù)為4 000～400 cm-1。 4個不同處理的棉花功能葉片有一些典型的共有峰， 但各處理間特征峰的數(shù)量以及特征峰對應的相對吸光度值的大小存在明顯差異。 如表1所示， 與正常處理相比， 棉花缺鉀時功能葉片缺失了1 547， 1 438， 1 153和1 024 cm-1這4個吸收峰， 并且1 049 cm-1位置的吸收峰向低頻方向位移了16 cm后位于1 033 cm-1； 供硼不足時， 棉花功能葉片吸收峰的位置和數(shù)量沒有顯著變化， 但相對吸光度均有所升高； 鉀硼同時缺乏情況下， 1 547， 1 438， 1 153和1 024 cm-1這4個吸收峰也發(fā)生了缺失， 此外， 位于1 049 cm-1的吸收峰向低頻方向位移了16 cm。

Fig.1 FTIR spectra of cotton functional leaves under potassium and boron stress

處理波數(shù)cm-1CK3402292016371547143814021385124611531103107810491024?K340229231637--140213861246-110110761033-?B3400292016371545144014021385124611531105107810491024?K?B340029171637--140013861246-110310761033-

另外， 圖1顯示， 在4 000～1 800 cm-1波數(shù)范圍， 棉花功能葉特征峰的相對吸光度值在缺鉀時低于正常功能葉， 而在缺硼與鉀硼同缺時高于正常功能葉， 且缺硼時變化更加明顯； 波數(shù)處于900～400 cm-1時， 缺硼功能葉特征峰的相對吸光度值高于正常功能葉， 而缺硼與鉀硼同缺時低于正常功能葉； 不同鉀硼處理情況下棉花功能葉片的光譜在1 800～900 cm-1波數(shù)范圍內差異較大， 特征峰的數(shù)量和相對吸光度值變化幅度均最為劇烈。 為了提高譜圖的分辨率， 以便減少譜圖疊加， 對不同處理1 800～900 cm-1的FTIR圖譜需要精細表征。

2.2 缺鉀時功能葉片的1 800～900 cm-1FTIR圖譜分析

由圖2明顯看出， 與正常處理相比， 缺鉀處理的譜圖吸收峰的位置及吸收峰相對吸光度的大小等方面都發(fā)生了變化。 缺鉀處理1 546.86， 1 438.85， 1 153.39和1 024.17cm-1這4個位置的峰缺失， 結合紅外光譜特征峰歸屬表(表2)可知， 1 545 cm-1附近的吸收峰是酰胺Ⅱ帶吸收， 為C—N鍵和N—H鍵的彎曲振動， 1 438 cm-1附近的吸收峰為纖維素中飽和C—H鍵的彎曲振動， 1 153 cm-1是蛋白質分子氨基酸殘基、 纖維素糖苷中C—O鍵的伸縮振動， 1 024 cm-1附近是核酸和多糖分子中C—O鍵的伸縮振動， 由此可知缺鉀導致蛋白質、 纖維素、 核糖及多糖分子的結構發(fā)生了變化； 此外， 缺鉀時位于1 049.24 cm-1的吸收峰向低頻方向位移了16 cm后變?yōu)? 033.49 cm-1， 1 050 cm-1附近的強峰為碳水化合物中C—O鍵和C—O—C鍵的伸縮振動， 說明缺鉀破壞了棉花功能葉片可溶性糖和纖維素C—C鍵和C—O鍵的伸縮振動。 表明缺鉀對棉花功能葉片蛋白質、 核糖、 可溶性糖和纖維素等的影響較大。

Fig.2 FTIR spectra of cotton functional leaf without potassium application(1 800～900 cm-1)

Table 2 Functional groups of the cell wall and the corresponding infrared absorption frequencies

2.3 缺硼時功能葉片的1 800～900 cm-1FTIR圖譜分析

圖3表明， 缺硼處理的棉花功能葉片的FTIR圖譜與正常處理相比， 紅外光譜特征峰數(shù)量和位置沒有顯著差異， 但所對應的相對吸光度均顯著升高， 說明缺硼對蛋白質及可溶性糖、 纖維素、 果膠等碳水化合物等的結構沒有很大影響， 但缺硼條件下細胞壁多糖合成或降解受到抑制， 光合產物向其他部位的運輸受阻等原因使得在這些大分子物質較多的積累在葉片中， 造成其含量高于正常的棉花葉片。

Fig.3 FTIR spectra of cotton functional leaf without boron application(1800～900 cm-1)

2.4 鉀硼均供應不足時功能葉片的1 800～900 cm-1FTIR圖譜分析

圖4顯示， 與對照相比， 硼鉀同時缺乏時棉花功能葉片的FTIR圖譜1 546.86， 1 438.85， 1 153.39和1 024.17 cm-1這4個位置的峰缺失， 位于1 049.24 cm-1的吸收峰向低頻方向位移了16 cm-1變?yōu)? 033.49 cm-1， 這說明功能葉片的蛋白質、 纖維素、 可溶性糖和核糖等的結構發(fā)生了變化； 在1 750～1 500和1 438～1 384 cm-1范圍內及1 103和1 076 cm-1處缺鉀缺硼處理的吸收峰的相對吸光強度大于對照， 1386～1 155 cm-1范圍內及1 049和1 024 cm-1的吸收強度低于正常處理， 表明缺鉀缺硼時蛋白質和可溶性糖等碳水化合物在功能葉片中的含量升高， 但核酸和多糖分子的含量下降。

Fig.4 FTIR spectra of cotton functional leaf without potassium and boron application(1 800～900 cm-1)

FTIR能夠提供生物大分子特定的振動吸收譜帶， 可以得到植物細胞壁上非破壞性的聚合物性質及基團的特征， 且所需植物材料樣品很少， 可以快捷地鑒別植物體內蛋白質、 核酸、 脂類和碳水化合物等生物大分子的官能團， 進而敏銳地探測這些分子的相對含量及其構象等變化的信息[12]。 但不同波數(shù)范圍內的物質變化有很大差異， 本實驗對棉花功能葉片1 800～900 cm-1FTIR圖譜進行重點表征。 與本實驗相似， Liu[13]主要在1 800～800 cm-1波數(shù)范圍內對臍橙葉片細胞壁的物質組成展開了進一步分析， Barron等[14]主要在1 800～900 cm-1波數(shù)范圍內對小麥胚乳細胞壁成分進行了分析， 徐榮和孫彩霞也對1 800～900 cm-1波數(shù)范圍內的物質組成展開了分析， 說明了植物各器官物質成分的差異主要集中在該波數(shù)范圍內， 對主要差異范圍的研究減少了紅外譜圖的疊加， 有利于提高譜圖的分辨率， 更詳盡的分析物質成分的差異[15-16]。

利用棉花FTIR圖譜， 深入分析了棉花正常處理、 缺鉀、 缺硼和鉀硼同時缺乏時功能葉物質組成的差異。 其中， 在缺鉀時棉花功能葉片蛋白質、 纖維素、 可溶性糖和核糖的結構發(fā)生變化且含量降低， 這可能與鉀促進蛋白質、 糖類的合成運輸?shù)墓δ芟嚓P。 胡文河等[17]以大豆作為研究材料， 發(fā)現(xiàn)鉀能夠增加葉片可溶性糖和蛋白質的含量， 也有結果表明， 缺鉀的大蒜苗期莖葉中可溶性糖、 可溶性蛋白質含量顯著低于適鉀處理[18]， 缺鉀導致擬南芥功能葉蛋白質二級結構及纖維素相關官能團的含量降低[19]的研究也表明缺鉀導致棉花功能葉片蛋白質及細胞壁上果膠， 纖維素相關官能團的含量降低或缺失[10]， 因此可知， 缺鉀不利于植物功能葉片蛋白質、 可溶性糖、 果膠和纖維素等碳水化合物的的合成； 缺硼時功能葉片的特征峰的位置和數(shù)量基本沒有變化， 但相對吸光度均有所升高， 表明缺硼對蛋白質、 可溶性糖、 纖維素等碳水化合物等的結構影響不大， 但會導致其在葉片中積累， 這可能與缺硼阻礙光合產物等向其他部位的運輸， 影響碳水化合物在韌皮部的裝載有關[20]對缺硼棉花的研究發(fā)現(xiàn)， 在人工培養(yǎng)箱實驗中， 棉花葉片中葡萄糖、 果糖、 蔗糖和淀粉含量都升高[21]， 焦曉燕等[22]發(fā)現(xiàn)供硼不足時綠豆葉片中碳水化合物的含量升高， 劉鵬等[23]以大豆為研究對象也得出了相似結論， 而Liu等[24]對柑橘的研究結果表明， 缺硼時柑橘葉片細胞壁蛋白含量下降， 細胞壁果膠和纖維素結構改變， 由此可知， 缺硼對于植物葉片蛋白質、 可溶性糖等碳水化合物含量有很大影響， 但對于不同作物， 有可能是促進作用， 也有可能是抑制作用； 鉀硼均供應不足時棉花功能葉片蛋白質和可溶性糖等碳水化合物含量升高， 這與蛋白質和可溶性糖等碳水化合物的合成減少以及其向韌皮部的運輸或裝載受阻有關[25]， 而核酸和多糖分子含量下降的原因和機制仍需進一步探討。

3 結 論

缺鉀破壞了棉花功能葉片表皮結構， 蛋白質、 纖維素、 可溶性糖和核糖等的結構發(fā)生變化， 且含量降低； 缺硼時蛋白質及可溶性糖、 纖維素等碳水化合物等在葉片中積累； 缺鉀缺硼時蛋白質和可溶性糖等碳水化合物含量升高， 而核酸和多糖分子等含量下降。

[1] WANG De-peng, TANG Hao-yue, ZHOU Xiao-bin, et al(王德鵬, 唐浩月, 周曉彬, 等). China Cotton(中國棉花), 2011, 38(10): 2.

[2] ZHANG Zhi-yong, WANG Qing-lian, LI Zhao-hu, et al(張志勇, 王清連, 李召虎, 等). Acta Agron Sin(作物學報), 2009, 35(4): 718.

[3] JIANG Cun-cang, CHEN Fang, GAO Xiang-zhao, et al(姜存?zhèn)}, 陳 防, 高祥照, 等). Scientia Agricultura Sinica(中國農業(yè)科學), 2008, 41(2): 488.

[4] Pettigrew W T. Agronomy Journal, 1999, 91(6): 962.

[5] Reddy K R, Zhao D L. Field Crops Research, 2005, 94: 201.

[6] CAO Yu-lin, TIAN Shao-ren, YANG Shao-qun(操宇琳, 田紹仁, 楊紹群). Cotton Sciences(棉花科學), 2011, 33(6): 58.

[7] WANG Chen, JIANG Ze-ping, LI Wen-qing, et al(王 成, 蔣澤平, 李文青, 等). Journal of Agro-Environment Science(中國環(huán)境科學學報), 2014, 33(4): 673.

[8] Griffiths P, De Haseth J A. Fourier Transform Infrared Spectrometry(2nd ed). New Jersey, USA: John Wiley &Sons, Inc, 2006.

[9] WANG Sheng-feng, LIU Yun-xia, HAN Ya, et al(王盛鋒, 劉云霞, 韓 亞, 等). Plant Nutrition and Fertilizer Science(植物營養(yǎng)與肥料學報), 2014, 20(4): 1005.

[10] Abidi N, Cabrales L, Haigler C H. Carbohydrate Polymers, 2014， (100): 9.

[11] XUE Sheng-guo, ZHU Feng, YE Chen, et al(薛生國, 朱 鋒, 葉 晨, 等). Acta Ecologica Sinica(生態(tài)學報), 2011, 31(20): 6143.

[12] McCann M C, Defemez M, Urbanowicz B R, et al. Plant Physiology, 2007, 143: 1314.

[13] Liu Guidong, Dong Xiaochang, Liu Leichao, et al. Scientia Horticulturae, 2014, 174: 54.

[14] Barron C, Parker M L, Mills E N C, et al. Planta, 2005, 220: 667.

[15] XU Rong, LIU You-gang, SUN Su-qin, et al(徐 榮, 劉友剛, 孫素琴, 等). Journal of Nuclear Agricultural Sciences(核農學報), 2009, 23(2): 262.

[16] SUN Cai-xia, WU Xiao-fei, WANG Jie, et al(孫彩霞, 吳曉菲, 王 杰, 等). Journal of Northeastern University(東北大學學報), 2012, 33(7): 1060.

[17] HU Wen-he, SONG Hong-kai, MA Jin-hua, et al(胡文河, 宋紅凱, 馬金華, 等). Journal of Jilin Agricultural University(吉林農業(yè)大學學報), 201 1, 33(2): 130.

[18] CHEN Kun, LIU Shi-qi, ZHANG Zi-kun, et al(陳 昆, 劉世琦, 張自坤, 等). Plant Nutrition and Fertilizer Science(植物營養(yǎng)與肥料學報), 2011, 17(2): 506.

[19] Yang J, Yen H E. Plant Physiology, 2002， 130: 1032.

[20] Camacho-Cristobal J J, Lunar L, Lafont F, et al. Journal of Plant Physiology, 2004, 161: 879.

[21] Zhao D, Oosterhuis D M. Field Crop Research, 2002， (78): 75.

[22] JIAO Xiao-yan, WANG Jin-song, WU Ai-lian, et al(焦曉燕, 王勁松, 武愛蓮, 等). Plant Nutrition and Fertilizer Science(植物營養(yǎng)與肥料學報), 2013, 19(3): 615.

[23] LIU Peng, YANG Yu-ai(劉 鵬, 楊玉愛).Plant Nutrition and Fertilizer Science(植物營養(yǎng)與肥料學報), 2003, 9(4): 456.

[24] Liu G D, Dong X C, Liu L C, et al. Physiologia Plantarum, 2015, 153(4): 513.

[25] Christian Z?rb, Mehmet Senbayramb, Edgar Peiterc.Journal of Plant Physiology, 2014, 171: 656.

*Corresponding author

FTIR Spectroscopic Characterization of Material Composition in Functional Leaf of Cotton under Stress of Potassium and Boron

WU Xiu-wen, HAO Yan-shu, LEI Jing, JIANG Cun-cang*

Microelement Research Center, Huazhong Agricultural University, Key Laboratory of Arable Land Conservation Ministry of Agriculture, Wuhan 430070, China

Potassium (K) and boron (B) are essential nutrient elements for plants, and the elements play an important role for plant growth, development and physiological metabolism. Cotton has a higher demand for K and B; K deficiency or B deficiency often occurs in cotton though. To reveal the component changes in functional leaf of cotton under K and B stress and investigate effects on material composition from K and B. A pot experiment was conducted at Huazhong Agricultural University. (1) the characteristic peaks at 1 546.86,1 438.85, 1 153.39 and 1 024.17 cm-1disappeared due to B deficiency, and relative absorbance of other characteristic peaks was decreased compared with normal, which suggested that the structures of protein, fiber, soluble sugar and ribosome in cotton functional leaf changed and decreased in cotent when lack of K. (2) the relative absorbance of all characteristic peaks was increased in the B-deficient cotton leaves compared with normal, suggesting B deficiency leads to the accumulation in leaves of protein, and fiber, soluble sugar and other carbohydrates because of the hindered transportation. (3) lack of both potassium and boron, induced significant changes to both the locations and relative absorbance of characteristic peaks, and the content of protein, and soluble sugar and other carbohydrates increased , while the content of nucleic acids and polysaccharides dropped. K deficiency led to the structures of protein, fiber, soluble sugar and ribosome in cotton functional leaf changed and decreased in content ; B deficiency gave rise to the accumulation in leaves of protein, and fiber, soluble sugar and other carbohydrates; the content of protein and soluble sugar and other carbohydrates increased, while the content of nucleic acids and polysaccharides dropped when K and B were all in short supply .

Potassium; Boron; Material composition in functional leaf of cotton; FTIR

Nov. 17, 2014; accepted Mar. 11, 2015)

2014-11-17，

2015-03-11

國家自然科學基金項目(41271320), 公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項項目(201203013)資助

吳秀文, 女, 1989年生, 華中農業(yè)大學微量元素研究中心博士研究生 e-mail: wuxiaoxiu@webmail.hzau.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: jcc2000@mail.hzau.edu.cn

S562.01， Q946

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)03-0676-05