付小娟　楊凱　李晗雪　趙欽　陳丹重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400016

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生物鐘基因Per1對人口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡、細胞周期和體內(nèi)成瘤的影響及機理

付小娟楊凱李晗雪趙欽陳丹
重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400016

[摘要]目的探討生物鐘基因Per1對細胞周期相關基因的調(diào)控作用，以及對人口腔鱗狀細胞癌細胞SCC15增殖、凋亡、細胞周期和體內(nèi)成瘤的影響。方法構建3組針對Per1 RNA的短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒重組質(zhì)粒，轉染SCC15細胞，用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測篩選RNA干擾作用最強組為實驗組，對照組（Control-shRNA）為對任何基因均無干擾效應的shRNA序列的質(zhì)粒，空白組為未做任何處理的SCC15細胞。用qRT-PCR檢測各組細胞中細胞周期相關基因Per1、p53、Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A2、Cyclin B1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p16、p21、Wee1、cdc25、E2F、Rb1 mRNA的表達；用流式細胞儀檢測各組細胞增殖、凋亡和細胞周期分布；將實驗組和空白組細胞分別接種于裸鼠背部皮下，觀察成瘤情況。結果成功構建了3組Per1-shRNA慢病毒質(zhì)粒，通過qRT-PCR和Western blot證明Per1-shRNA-Ⅰ組沉默效果最佳，作為實驗組。Per1-shRNA-Ⅰ組中Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin B1、CDK1和Wee1 mRNA的表達水平高于Control-shRNA組和SCC15組（P<0.05），p53、Cyclin A2、p16、p21和cdc25 mRNA的表達水平降低（P<0.05）；Control-shRNA組和SCC15組中各基因mRNA的表達水平無差異（P>0.05）。CDK2、CDK4、CDK6、E2F和Rb1 mRNA的表達水平在3組中均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。Per1-shRNA-Ⅰ組中細胞增殖指數(shù)高于Control-shRNA組和SCC15組（P<0.05），凋亡指數(shù)降低（P<0.05），S期的細胞數(shù)降低（P<0.05），G2/M期的細胞數(shù)增加（P<0.05）。Control-shRNA組和SCC15組細胞的增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。Per1-shRNA-Ⅰ組細胞體內(nèi)成瘤能力顯著增強（P<0.05）。結論生物鐘基因Perl是重要的抑癌基因，Perl能調(diào)控下游眾多的細胞周期基因，其表達變化影響細胞周期進程、增殖和凋亡的平衡失調(diào)及體內(nèi)成瘤能力，對Per1深入研究有可能進一步明確癌癥的發(fā)生發(fā)展機制，為癌癥的治療提供新的有效分子靶點。

[關鍵詞]生物鐘；Per1；細胞周期；基因；口腔癌

Correspondence: Yang Kai, E-mail: cqfyyk@aliyun.com.

生物體內(nèi)的許多生命活動，如激素分泌、細胞增殖等，均表現(xiàn)出近24 h的周期波動，稱為晝夜節(jié)律[1-3]。晝夜節(jié)律是生物適應外界環(huán)境長期進化的結果，是生命活動的基本特征之一。晝夜節(jié)律的產(chǎn)生由細胞內(nèi)生物鐘基因呈晝夜節(jié)律性表達所導致[1-4]。目前人們已發(fā)現(xiàn)14個生物鐘基因：Per1、Per2、Per3、Cryl、Cry2、Clock、Bmal1、TIM、CK1ε、NPAS2，REV-ERBs、Dec1、Dec2、RORs[1,3-4]，這些生物鐘基因通過周期性表達產(chǎn)生的晝夜節(jié)律使復雜的生命活動相互協(xié)調(diào)有序。Per1是重要的生物鐘基因，具有維持晝夜節(jié)律穩(wěn)定和調(diào)控晝夜節(jié)律周期的作用[5-6]。研究表明：Per1不僅與生物體晝夜節(jié)律有關，而且還能調(diào)控下游許多重要的細胞周期蛋白[7]，Per1的異常表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[7-9]。

細胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生的主要原因[4,10]。正常細胞周期的運行依賴于細胞周期蛋白（Cyclins）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）組成的細胞周期分子網(wǎng)絡調(diào)控系統(tǒng)[4,10-11]。Cyclins包括Cyclin A-Y，其中起主要作用的有Cyclin A2、B1、D1、E；CDKs包括CDK1-CDK16，起重要作用的有CDK1、2、4、6；CKIs包括Ink4家族和Cip/Kip家族，其中起重要作用的主要有Ink4家族中p16和Cip/Kip家族中p21[10-11]。在Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡系統(tǒng)中，CDKs是調(diào)控細胞周期的核心，Cyclins和CKIs分別對CDKs具有正向調(diào)控作用和負向調(diào)控作用[10-11]。

研究表明：生物鐘基因Per1在多種癌癥中表達降低[8-9]，Per1能調(diào)控下游許多重要的細胞周期蛋白[7]，從而導致細胞周期進程和細胞增殖水平改變，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關[4,7,10]。在Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡系統(tǒng)中，人們的研究主要集中在Per1對細胞周期蛋白的調(diào)控，如Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E和Wee1等[7]，但關于Per1對CDKs和CKIs中分子的調(diào)控還了解甚少。為了進一步探討Per1基因與癌癥發(fā)生的關系以及晝夜節(jié)律與細胞周期兩大周期活動之間的相互作用，本研究通過對人口腔鱗狀細胞癌細胞內(nèi)的Per1基因沉默，檢測Per1沉默后細胞的細胞周期、增殖、凋亡和體內(nèi)成瘤能力的改變，并全面檢測Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡系統(tǒng)中各重要分子的改變情況，以闡明Per1與癌癥發(fā)生的機制。

1　材料和方法

1.1細胞和主要試劑

人口腔鱗狀細胞癌SCC15細胞（重慶醫(yī)科大學生命科學院），慢病毒表達載體PLKO.1（Sigma公司，美國），質(zhì)粒提取試劑盒（Invitrogen公司，美國），逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR）試劑盒（Bio-Rad公司，美國），BCA蛋白濃度測定試劑盒、鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），單克隆抗體（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗人Per1單克隆抗體（Genetex公司，美國），辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），低溫冷凍離心機（Z223-MK-Z，HERMLE公司，德國），熒光定量PCR儀（C1000TMThermal Cycler，Bio-Rad公司，美國），核酸蛋白分析儀（UV-GeneQuant，安瑪西亞公司，瑞典），流式細胞儀（FACSVantage SE，BD公司，美國）。

1.2Per1短發(fā)夾RNA（Per1-short hairpin RNA，Per1-shRNA）慢病毒干擾質(zhì)粒載體構建和鑒定

根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中人的Per1 mRNA序列（GeneID: NM_002616），遵循RNA干擾序列設計原則[12]，選擇Per1 RNA干擾靶序列后進行BLAST基因組同源性分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），確定3個干擾作用位點為本實驗Per1基因的靶序列，用軟件BLOCK-iT? RNAi Designer（Invitrogen公司，美國）設計3條Per1 RNA干擾序列和1條對照序列，Per1-Ⅰ：3’-CAGCACCACTAAGCGTAAATG-5’；Per1-Ⅱ：3’-CCAGCACCACTAAGCGTAAAT-5’；Per1-Ⅲ：3’-CCATGGACATGTCCACCTATA-5’；對照序列：3’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-5’。通過Genbank數(shù)據(jù)庫驗證該對照序列對任何基因均無干擾效應。在DNA連接酶的作用下將各條序列5’末端添加CCGG序列，3’末端添加TTTTTG序列，各條序列的正義鏈與反義鏈之間用Loop環(huán)（CTCGAG）連接，然后在5’和3’末端用DNA連接酶分別連接含限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點的黏性末端。將上述合成的shRNA行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ對慢病毒載體PLKO.1進行雙酶切，得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離、割膠回收和純化，然后與shRNA片段在DNA連接酶作用下連接形成Per1-shRNA-PLKO.1。將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后涂布于含氨基核苷類抗生素的LB固體培養(yǎng)基上抗性培養(yǎng)，將形成的單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖菌過夜，離心（8 000 r·min-1，3 min）后收集細菌并裂解細胞，提取質(zhì)粒DNA，然后用Age Ⅰ和EcoR Ⅰ行雙酶切后用Chromas軟件（Technelysium公司，澳大利亞）測序鑒定。

1.3Per1-shRNA慢病毒質(zhì)粒包裝及轉染SCC15細胞

取對數(shù)生長期的293T細胞，以2×106個·mL-1的細胞數(shù)接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，放于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細胞生長飽和度達到70%～80%時，加入各質(zhì)粒DNA溶液10 μg和20 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進行共轉染，48 h后收集293T細胞上清液，離心10 min（4 ℃，4 000 r·min-1）后用直徑0.45 μm的濾器過濾上清液，即獲得慢病毒包裝的Per1-shRNA重組質(zhì)粒病毒液。取對數(shù)生長期的SCC15細胞，接種于6孔板中，加入4 mL血清新鮮培養(yǎng)基、10 μL Polybrene和1 mL重組質(zhì)粒病毒液，混勻培養(yǎng)24 h，再向各孔中加入嘌呤霉素（終濃度2.0 μg·mL-1）進行傳代篩選。實驗分為5組：Per1-shRNA-Ⅰ組、Per1-shRNA-Ⅱ組和Per1-shRNA-Ⅲ組分別為轉染Per1-shRNA-Ⅰ、Per1-shRNA-Ⅱ和Per1-shRNA-Ⅲ質(zhì)粒病毒的SCC15細胞，對照組（ControlshRNA）為轉染Control-shRNA質(zhì)粒（對照質(zhì)粒，即只含對任何基因均無干擾效應的shRNA序列的質(zhì)粒）的SCC15細胞，SCC15組為未作任何處理的SCC15細胞（空白對照）。

1.4蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

收集各組細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將提取蛋白與其1/4體積的蛋白上樣緩沖液混合后變性5 min （100 ℃）。取50 μg蛋白上樣，在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）100 V電壓下電泳，所得電泳產(chǎn)物轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗兔抗人Per1多克隆抗體（1︰200）和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1︰3 000）過夜，用TBST（Tris Buffered Saline with Tween-20）液洗膜3次，每次10 min，然后加入二抗為辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（1︰1 000），37 ℃孵育1 h。用TBST液洗膜3遍后，電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯影。最后用Quantity One軟件（Bio-Rad公司，美國）分析條帶灰度值，計算 PER1和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比值。以上實驗重復3次。

1.5實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）檢測

按Trizol說明書分別提取各組細胞的總RNA，將總RNA溶解于焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）處理的雙蒸水中，用紫外分光光度儀測定RNA濃度和純度。用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，按試劑盒說明進行操作，反應體系為10 μL，反應條件：37 ℃，15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 4 min。用Primer Premier 5.0軟件設計并合成目的基因Per1、p53、Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A2、Cyclin B1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p16、p21、Wee1、cdc25、E2F、Rb1和內(nèi)參基因GAPDH的引物序列（表1）。用熒光定量PCR儀進行PCR擴增，反應體系為10 μL：Premix Ex TapTM5 μL，上下游引物各0.5 μL，50 ng·μL-1cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水3 μL補足體積至10 μL。擴增參數(shù)為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40個循環(huán)。每次qRT-PCR反應都設有以相同體積的滅菌雙蒸水取代cDNA作為空白對照，每個樣本設3個復孔，檢測重復3次。用Pfaffl法[13]計算各基因mRNA的表達。

表1　各基因qRT-PCR引物序列Tab 1　The primers for qRT-PCR of the genes

1.6流式細胞儀檢測

根據(jù)Per1 mRNA和蛋白檢測結果，篩選RNA干擾作用最強的Per1-shRNA-Ⅰ組作為實驗組。取對數(shù)生長期的Per1-shRNA-Ⅰ、Control-shRNA和SCC15組細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單細胞懸液，調(diào)整各組細胞濃度為1×106個·mL-1，分別取1 mL各組細胞懸液離心（1 000 r·min-1，4 ℃）5 min，去掉上清液，PBS液洗滌細胞2次。

細胞周期分布和細胞增殖檢測：在各組細胞中加入0.5 mL70%乙醇（-20 ℃預冷）固定，4 ℃冰箱過夜，離心（1 000 r·min-1，4 ℃）5 min，用PBS液洗滌細胞2遍，加入碘化丙啶染色液1 mL，4 ℃避光30 min后用流式細胞儀檢測細胞周期分布，并計算細胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI），PI=（S+ G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

細胞凋亡檢測：在各組細胞中加入200 μL膜聯(lián)蛋白（Annexin）Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）染色液，4 ℃避光孵育15 min，再加入碘化丙啶染色液1 mL混勻，5 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）=（凋亡細胞數(shù)/所測細胞總數(shù)）×100%。實驗重復3次。

1.7體內(nèi)成瘤實驗

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別BALB/c nu/nu品系雌性裸鼠10只，4～6周齡，體重18～22 g（重慶醫(yī)科大學實驗動物研究所）。隨機分為Per1-shRNA-Ⅰ組（實驗組）和SCC15組（空白組），每組5只。采用0.25%胰酶分別消化對數(shù)生長期的Per1-shRNA-Ⅰ和SCC15細胞，冷凍低速離心（4 ℃，1 000 r·min-1）5 min后，用PBS液調(diào)整細胞濃度為5×106個·mL-1的單細胞懸液。將0.2 mL Per1-shRNA-Ⅰ和SCC15細胞懸液分別注入實驗組和空白組裸鼠的右背部皮下。3周明顯成瘤后，用頸椎脫位法處死裸鼠，取出腫瘤，用電子天平（A250型，Denver公司，美國）稱重量，用游標卡尺測量腫瘤的最大長徑（a）和最小短徑（b），按公式計算腫瘤體積（V）：V=0.5×a×b2。然后將腫瘤用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后在200倍光學顯微鏡下觀察。所有實驗操作程序均經(jīng)過重慶醫(yī)科大學實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準。

1.8統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對3組及以上實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗；對體內(nèi)成瘤2組實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2　結果

2.1Per1-shRNA載體構建及鑒定

測序鑒定表明，3條Per1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ重組質(zhì)粒DNA測序與設計的干擾靶序列片段一致（圖1），表明3條Per1-shRNA（Ⅰ～Ⅲ）-PLKO.1重組慢病毒載體構建成功。

圖1　Per1-shRNA重組質(zhì)粒測序圖譜Fig 1　The sequencing atlas of Per1-shRNA recombinant plasmids

2.2Per1基因沉默后SCC15細胞中Per1 mRNA和蛋白的表達

Per1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ、Control-shRNA和SCC15組細胞中Per1 mRNA的表達分別為1.00±0.00、1.45± 0.34、1.50±0.23、2.11±0.31、2.20±0.34，Per1蛋白的灰度值比值分別為1.05±0.21、1.50±0.15、1.63± 0.11、2.18±0.24、2.21±0.33（圖2）。Per1-shRNA-Ⅰ組細胞中Per1 mRNA和蛋白的表達均低于其他組（P<0.05），表明Per1-shRNA-Ⅰ組的Per1沉默效果最佳，作為實驗組。

圖2　Western blot檢測各組Per1蛋白表達水平Fig 2　Per1 protein levels of each group analyzed by Western blot

2.3Per1沉默后SCC15細胞內(nèi)細胞周期相關基因mRNA的表達

qRT-PCR檢測結果見表2。Per1-shRNA-Ⅰ組中Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin B1、CDK1和Wee1 mRNA的表達水平高于Control-shRNA組和SCC15組（P<0.05），p53、Cyclin A2、p16、p21和cdc25 mRNA的表達水平降低（P<0.05）；Control-shRNA組和SCC15組中各基因mRNA的表達水平無差異（P>0.05）。CDK2、CDK4、CDK6、E2F和Rb1 mRNA的表達水平在3組中均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

表2　Per1-shRNA-Ⅰ、Control-shRNA和SCC15組中細胞周期相關基因mRNA的表達Tab 2　The mRNA expressions of cell cycle related genes in Per1-shRNA-Ⅰ, Control-shRNA, and SCC15 groups

2.4Per1基因沉默后SCC15細胞的細胞周期分布、增殖、凋亡的變化

流式細胞儀檢測結果見表3。Per1-shRNA-Ⅰ組中細胞增殖指數(shù)高于Control-shRNA組和SCC15組（P<0.05），凋亡指數(shù)降低（P<0.05），S期細胞數(shù)降低（P<0.05），G2/M期細胞數(shù)增加（P<0.05）。Control-shRNA組和SCC15組細胞的增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)和細胞周期分布無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

表3　Per1-shRNA-Ⅰ、Control-shRNA和SCC15組中細胞周期分布、細胞增殖、細胞凋亡Tab3　　The cell cycle distribution, cell proliferation, and apoptosis in Per1-shRNA-Ⅰ, Control-shRNA, and SCC15 groups

2.5體內(nèi)成瘤

體內(nèi)成瘤結果見圖3：Per1-shRNA-Ⅰ組和SCC15組腫瘤的體積分別為（0.25±0.09）cm3和（0.08± 0.02）cm3，質(zhì)量分別為（0.50±0.16）g和（0.18± 0.04）g，均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。表明Per1-shRNA-Ⅰ組細胞體內(nèi)成瘤能力顯著增強（P<0.05）。

圖3　Per1-shRNA-Ⅰ和SCC15組細胞的體內(nèi)成瘤能力Fig 3　The tumorigenic ability in vivo of Per1-shRNA-Ⅰand SCC15 group cells

3　討論

細胞周期紊亂導致細胞增殖和凋亡的平衡改變，這是腫瘤發(fā)生的主要原因[4,10]。正常細胞在Cyclins-CDKs-CKIs細胞周期分子網(wǎng)絡系統(tǒng)的精確調(diào)控下按嚴格的時間順序沿著G1-S-G2-M時相運轉[4,10,14]。在Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡中，CDKs是調(diào)控細胞周期的核心，在細胞周期的不同時相，不同的Cyclins與不同的CDKs結合形成Cyclins/CDKs復合物，激活CDKs的功能，促進細胞由一個細胞周期時相向另一個細胞周期時相有序轉換，而不同的CKIs可通過與相應的CDKs或Cyclins/CDKs復合物結合，抑制CDKs的活性，從而抑制細胞周期時相轉換[10-11]。如果正性調(diào)節(jié)因子Cyclins和負性調(diào)節(jié)因子CKIs的協(xié)同調(diào)控作用發(fā)生異常，細胞增殖和凋亡的平衡就會發(fā)生改變，最終導致腫瘤的發(fā)生。

研究[7-8]證明：Per1異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，其機理是Per1能調(diào)控下游許多重要細胞周期蛋白。Yang等[7]報道，下調(diào)Per1基因表達導致小鼠乳腺癌細胞中Cyclin D1和Cyclin E的表達水平增高，細胞增殖及生長能力增加；過表達Per1導致結腸癌細胞HCT116中Cyclin B1和Wee1的表達水平降低，從而誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖；Cao等[8]也發(fā)現(xiàn)，過表達Per1基因能抑制前列腺癌細胞增殖和促進細胞凋亡。但在Cyclins-CDKs-CKIs細胞周期分子網(wǎng)絡系統(tǒng)中，Per1對CDKs和CKIs這兩方面的調(diào)控作用目前還了解甚少。

G1期的啟動是啟動細胞周期運行的關鍵，Cyclin D1與CDK4或CDK6結合，激活CDK4或CDK6的活性，啟動G1期，然后Cyclin E與CDK2結合，激活CDK2的活性，使細胞從G1期向S期過渡[10,14]，同時CKIs中屬于Ink4家族的p16能與Cyclin D1競爭與CDK4 或CDK6結合，特異性抑制CDK4或CDK6活性，而CKIs中屬于Cip/Kip家族的p21具有廣泛激酶抑制活性，能抑制各種Cyclins-CDKs復合物的活性，因而在G1期對CyclinE/CDK2復合體活性有抑制作用，從而阻滯細胞周期進程[10-11,15]。本研究顯示：SCC15細胞中沉默Per1基因后，雖然CDK2、CDK4和CDK6的表達水平無顯著改變，但Cyclin D1和Cyclin E表達顯著增高，激活了CDK2、CDK4或CDK6的活性，同時p16和p21表達顯著降低，對CDK2、CDK4和CDK6活性的抑制能力減弱，從而增強了細胞G1期的啟動能力，促進細胞由G1期向S期加速過渡，促進細胞增殖。本研究也證明：Per1基因沉默后，SCC15細胞體內(nèi)成瘤能力增強。

在細胞周期的S期，Cyclin A2與CDK2結合激活CDK2，Cyclin A2/CDK2復合物驅(qū)動細胞延續(xù)S期，并促進細胞從S期向G2期轉化[10,14]。本研究顯示：沉默Per1基因后，SCC15細胞中CDK2表達無明顯改變，但Cyclin A2表達顯著降低，同時抑制Cyclin A2/ CDK2復合物活性的p21表達也顯著降低，導致Cyclin A2/CDK2復合物對細胞S期的延續(xù)作用減弱，因而S期進程縮短，從而導致S期細胞數(shù)降低。

在G2期，Cyclin B1與CDK1結合激活CDK1，CDK1/Cyclin B1復合體驅(qū)動細胞從G2期向M期轉化。cdc25能增強CDK1的活性，促進G2期向M期的轉化進程[10,14]，Weel能抑制CDK1的活性，導致M期延遲或?qū)⒓毎芷谧铚贕2/M期[10]。本研究顯示：沉默Per1基因后，SCC15細胞中CDK1、Cyclin B1和Wee1表達顯著增高，而p21和cdc25表達顯著降低，提示沉默Per1基因后，Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡調(diào)控系統(tǒng)中的三方面均發(fā)生了改變。同時本研究結果還顯示，細胞在G2/M期數(shù)量增多，證明Wee1對Cyclin B1/CDK1復合體的負性調(diào)控作用占有優(yōu)勢。

在Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡調(diào)控的細胞周期運行中，p53是G1/S細胞周期檢查點的重要因子。在G1/S細胞周期檢查點，有DNA損傷的細胞通過激活p53使細胞周期停滯進行DNA修復，不能修復者誘導其凋亡[10]。本研究結果顯示：沉默Per1基因后SCC15細胞中p53表達降低，導致細胞對損傷DNA的修復能力減弱和誘導細胞凋亡能力下降，增加了受損DNA未經(jīng)修復的細胞進入S期，使細胞基因組的完整性和穩(wěn)定性受到影響，促進細胞惡性轉化。本研究也證明：Per1基因沉默后，SCC15細胞增殖指數(shù)顯著增高，凋亡指數(shù)顯著下降，并且體內(nèi)成瘤能力增強。

本研究證明：生物鐘基因Per1是重要的抑癌基因。Per1沉默后，SCC15癌細胞中CDK2、CDK4、CDK6、E2F和Rb1 mRNA表達水平無顯著改變，但Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin B1、CDK1和Wee1 mRNA的表達水平顯著增高，而p53、Cyclin A2、p16、p21和cdc25 mRNA的表達水平顯著降低，最終導致細胞增殖水平增高，凋亡水平下降，細胞周期進程改變，細胞體內(nèi)成瘤能力增強。本研究從轉錄水平證明了生物鐘基因Per1對Cyclins-CDKs-CKIs細胞周期分子網(wǎng)絡中的三方面及細胞周期G1/S檢查點均有重要的調(diào)控作用。在此基礎上對Per1的深入研究有可能進一步明確晝夜節(jié)律與細胞周期兩大周期活動之間的相互作用以及與癌變發(fā)生的關系，為癌癥的治療提供新的有效分子靶點。

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（本文編輯李彩）

·臨床研究·

Effects and mechanism of the circadian clock gene Per1 on the proliferation, apoptosis, cycle, and tumorigenicity in vivo of human oral squamous cell carcinoma

Fu Xiaojuan, Yang Kai, Li Hanxue, Zhao Qin, Chen Dan.(Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

[Key words]circadian clock;Per1;cell cycle;gene;oral carcinoma

[Abstract]Objective To determine the regulatory effects of the circadian clock gene Per1 on cell cycle-related genes and its influence on the proliferation, apoptosis, cycle, and tumorigenicity in vivo of human oral squamous cell carcinoma SCC15 cells.MethodsThree groups of the short hairpin RNA (shRNA) of lentivirus recombinant plasmids were designed against the RNA of Per1 and then transfected to the SCC15 cells.The optimum interference group was screened through Western blot and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and assigned as the experimental group.The transfected lentivirus plasmid without an interference effect on any gene was set as the control group (Control-shRNA).Untreated SCC15 cells were set as the blank group.The mRNA expressions of cell cycle-related genes, namely, Per1, p53, Cyclin D1, Cyclin E, Cyclin A2, Cyclin B1, CDK1, CDK2, CDK4, CDK6, p16, p21, Wee1, cdc25, E2F, and Rb1, in each group were detectedthrough qRT-PCR.The cell proliferation, apoptosis, and cell cycle distribution in each group were evaluated through flow cytometry.The cells of the experimental group andthe blank group were subcutaneously inoculated in nude mice to observe tumorigenesis.ResultsThree groups of Per1-shRNA lentivirus plasmids were constructed successfully.Among the groups, the Per1-shRNA-Ⅰgroup exhibited the highest interference effect, as indicated by qRT-PCR and Western blot analysis.As such, this group was set as the experimental group.The mRNA expression levels of CyclinD1, CyclinE, CyclinB1, CDK1, and Wee1 gene in the Per1-shRNA-Ⅰgroup were significantly higher than those in the Control-shRNA group and the SCC15 group (P<0.05).By contrast, the mRNA expression levels of p53, Cyclin A2, p16, p21, and cdc25 in the Per1-shRNA-Ⅰgroup were significantly lower than those in the Control-shRNA group and the SCC15 group (P<0.05).The mRNA expression levels of each gene between the Control-shRNA group and the SCC15 group did not significantly differ (P>0.05).The mRNA expression levels of CDK2, CDK4, CDK6, E2F, and Rb1 did not significantly differed in the three groups (P>0.05).The proliferation index of the Per1-shRNA-Ⅰgroup was significantly higher than those of the Control-shRNA group and the SCC15 group (P<0.05).The apoptosis index of the Per1-shRNA-Ⅰgroup was significantly lower than those of the Control-shRNA group and the SCC15 group (P<0.05).The number of S-phase cells in the Per1-shRNA-Ⅰgroup was significantly lower than those of S-phase cells in the Control-shRNA group and the SCC15 group (P<0.05).The number of G2/M-phase cells in the Per1-shRNA-Ⅰgroup was significantly higher than those of G2/M-phase cells in the Control-shRNA group and the SCC15 group (P<0.05).Conversely, the proliferation index, apoptotic index, and cell cycle distribution of the cells in the Control-shRNA group did not significantly differ from those of the SCC15 group (P>0.05).The tumorigenic ability in vivo was significantly enhanced in the Per1-shRNA-Ⅰgroup (P<0.05).ConclusionPer1 is an important tumor suppressor gene.Perl can regulate a large number of downstream cell cycle-related genes.The alteration of its expression can affect cell cycle progression, proliferation, apoptosis imbalance, and tumorigenic ability in vivo.Further studies on Per1 may elucidate cancer development and provide novel effective molecular targets for cancer treatment.

[中圖分類號]R 739.8

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.008

[收稿日期]2015-10-16； [修回日期]2016-02-28

[作者簡介]付小娟，碩士，E-mail：466133758@qq.com

[通信作者]楊凱，教授，博士，E-mail：cqfyyk@aliyun.com