吳昕彧　陳曉丹　趙望泓　侯晉　陳璇南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣州 510515

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變異鏈球菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)ptxA、ptxB基因?qū)毦L能力的影響

吳昕彧陳曉丹趙望泓侯晉陳璇
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣州 510515

[摘要]目的研究變異鏈球菌（S.mutans）磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）中抗壞血酸家族ptxA、ptxB基因?qū)毦L能力的影響。方法構(gòu)建ptxA、ptxB和ptxAB雙重基因缺陷菌株以及ptxAB功能補償菌株。在僅以抗壞血酸作為唯一碳源時，使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測野生株中ptxA、ptxB基因的表達情況。連續(xù)監(jiān)測野生株、缺陷株和補償株的菌液OD600值，比較其生長能力。結(jié)果經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)和測序鑒定，結(jié)果證明缺陷株和補償株構(gòu)建成功。在以抗壞血酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，野生株ptxA、ptxB基因的表達量均明顯增高（P<0.01）。缺陷株的生長能力較野生株有所下降，但是在補償株中可以得到補償。結(jié)論ptxA、ptxB基因與S.mutans對抗壞血酸的吸收利用密切相關(guān)，缺陷株和補償株的構(gòu)建為進一步研究目的基因在S.mutans抗壞血酸代謝中的作用機制提供了理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]變異鏈球菌；磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；ptxA基因；ptxB基因；抗壞血酸

Supported by:The National Natural Science Foundation of China(81050035);Project of Talent Introduction in Universities of Guangdong Province (C1030636);President Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University(2013B003).Correspondence: Zhao Wanghong, E-mail: zhaowh@smu.edu.com.

齲病是人類發(fā)病率最高的口腔疾病。目前較為公認的致齲菌之一是變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）。S.mutans可代謝碳水化合物，從而發(fā)揮產(chǎn)酸、黏附、生物膜形成等與致齲相關(guān)的生物學(xué)特性。2002年，S.mutans血清c型UA159菌株的全基因組測序工作全部完成。通過對基因組的分析表明，S.mutans與碳水化合物代謝相關(guān)的基因占了15%，與現(xiàn)有其他已測序的革蘭陽性菌基因組相比，其呈現(xiàn)出更強的碳水化合物代謝能力[1]。而S.mutans對碳水化合物的轉(zhuǎn)運，主要是通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）完成的[2]。鑒于PTS對S.mutans代謝碳水化合物的重要作用，研究PTS相關(guān)基因?qū)斫釹.mutans的致齲作用有重要意義。

ptxA基因（NCBI GeneID：1027857）與ptxB基因（NCBI GeneID：1027854）分別編碼S.mutans UA159 PTS中抗壞血酸家族酶Ⅱ復(fù)合體中的酶ⅡA和酶ⅡB。有學(xué)者[3]曾對這兩個蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)進行解析，并通過體外酶活性實驗證明它們對抗壞血酸的磷酸化具有特異性?？箟难嵩谧匀唤缰蟹植紡V泛，尤其在水果及蔬菜中含量豐富。目前已知大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）[4]、乳酸桿菌[5]等可在無氧條件下發(fā)酵抗壞血酸，以獲得維持生命活動的碳源，但未見關(guān)于S.mutans通過PTS吸收利用抗壞血酸以獲得碳源的報道。本研究擬構(gòu)建ptxA、ptxB和ptxAB雙重基因缺陷菌株，以及ptxAB功能補償菌株，研究其在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長情況，以揭示ptxA、ptxB基因在S.mutans利用代謝抗壞血酸中發(fā)揮的作用，并為進一步研究其作用機制提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1菌株及培養(yǎng)條件

本實驗所用菌株S.mutans UA159（北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實驗室惠贈）采用腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）培養(yǎng)，或采用添加不同濃度葡萄糖（Sigma公司，美國）或抗壞血酸（Sigma公司，美國）的TV培養(yǎng)基（含3.5%胰蛋白胨、0.04 μg·mL-1對氨基苯甲酸、0.2 μg·mL-1鹽酸硫胺酸、1 μg·mL-1煙酰胺和0.2 μg·mL-1核黃素）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）進行培養(yǎng)。選擇性BHI培養(yǎng)基采用壯觀霉素（spectinomycin，spe）（Sigma公司，美國）抗性，spe的濃度為1 mg·mL-1。S.mutans的培養(yǎng)條件為37 ℃，厭氧培養(yǎng)（10%CO2、10%H2、80%N2）。E.coli DH5α［天根生化科技（北京）有限公司］采用Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）培養(yǎng)，選擇性LB培養(yǎng)基采用spe抗性，spe的濃度為0.1 mg·mL-1。E.coli的培養(yǎng)條件為37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)。

1.2ptxA、ptxB、ptxAB缺陷菌株及ptxAB功能補償菌株的構(gòu)建

根據(jù)NCBI提供的S.mutans UA159全基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件針對ptxA、ptxB及ptxAB設(shè)計引物，具體見表1。

表1　引物序列Tab 1　Sequences of primers

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增各基因相應(yīng)的上、下游片段，經(jīng)雙酶切后與pFW5質(zhì)粒（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院余擎教授惠贈）進行連接，使用E.coli DH5α感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化。利用選擇性LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，提取陽性克隆的質(zhì)粒進行測序鑒定。將構(gòu)建成功的ptxA、ptxB 及ptxAB雙基因缺陷重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入S.mutans。使用1 μg·mL-1的感受態(tài)刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）對野生型S.mutans UA159進行刺激，兩者混合后進行自然轉(zhuǎn)化[6]。利用選擇性BHI培養(yǎng)基篩選陽性克隆，提取陽性克隆的基因組DNA進行PCR及測序鑒定。利用類似方法，將啟動子序列及ptxAB片段克隆至pDL278質(zhì)粒（美國路易斯安那州立大學(xué)牙學(xué)院Zezhang T.Wen教授惠贈），轉(zhuǎn)化入ptxAB雙重基因缺陷菌株，構(gòu)建ptxAB功能補償菌株。

1.3抗壞血酸作為S.mutans生長唯一碳源時的最適濃度探究

分別檢測含有5、10、15、20、30 mmol·L-1抗壞血酸的TV培養(yǎng)基的pH值。將培養(yǎng)24 h后的野生型S.mutans UA159使用無菌PBS溶液洗滌2次，TV培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)菌液OD600≈0.8，按1︰100分別加入到含有上述濃度抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，每隔2 h測量各組菌液OD600值，重復(fù)3次，繪制細菌在含不同濃度抗壞血酸的培養(yǎng)基中的生長曲線。

1.4檢測ptxA、ptxB基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中的表達情況

將培養(yǎng)24 h后的野生型S.mutans UA159用無菌PBS溶液洗滌2次，TV培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)菌液OD600≈ 0.8，按1︰100分別加入到含有15 mmol·L-1抗壞血酸或葡萄糖的TV培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。使用RNAiso試劑盒（Takara公司，日本）提取細菌總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，日本）進行逆轉(zhuǎn)錄。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計ptxA、ptxB基因的引物，16S rRNA作為內(nèi)參（表1），進行qPCR，檢測ptxA、ptxB基因的表達情況，重復(fù)3次。使用SPSS 13.0軟件進行兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

1.5各菌株在以抗壞血酸為唯一碳源時的生長能力比較

將培養(yǎng)24 h后的野生型S.mutans UA159、ptxA基因缺陷菌株、ptxB基因缺陷菌株、ptxAB雙重基因缺陷菌株及ptxAB功能補償菌株使用無菌PBS溶液洗滌菌體2次，TV培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)菌液OD600≈0.6，按1︰100比例分別加入至含有15 mmol·L-1抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，每隔2 h測量各菌液OD600值，重復(fù)3次，繪制各基因缺陷菌株和補償菌株在以抗壞血酸作為唯一碳源時的生長曲線。

2　結(jié)果

2.1ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株的鑒定

ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株的PCR鑒定結(jié)果見圖1。由圖1可見，各缺陷菌株P(guān)CR擴增的片段大小與使用相應(yīng)重組質(zhì)粒作為模版所擴增的片段大小一致，大小與預(yù)計相符。將片段測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST對比，結(jié)果顯示99%相符。

圖1　ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株的PCR鑒定Fig 1　Identification of ptxA-, ptxB- and ptxAB-deficient mutant by PCR

2.2抗壞血酸作為S.mutans生長唯一碳源時的最適濃度

含5、10、15、20、30 mmol·L-1抗壞血酸的TV培養(yǎng)基的pH值分別為6.26、5.90、5.53、5.17、4.79。隨著抗壞血酸濃度的上升，培養(yǎng)基的pH值隨之下降。野生型S.mutans UA159在以不同濃度的抗壞血酸作為唯一碳源時，其生長情況有所不同（圖2）。隨著抗壞血酸濃度的增加，遲緩期逐漸延長。5 mmol·L-1組與10 mmol·L-1組的遲緩期較短，約為6 h，其達到穩(wěn)定期所需的時間亦較短，約為16 h，但5 mmol·L-1組與10 mmol·L-1組的終末菌密度均較低。15 mmol·L-1組的遲緩期約為12 h，其達到穩(wěn)定期所需的時間約為34 h，菌液終末OD600值約為0.6。20 mmol·L-1組的遲緩期約為24 h，但在監(jiān)測的48 h內(nèi)，未進入穩(wěn)定期。而30 mmol·L-1組在監(jiān)測的48 h內(nèi)，細菌未見明顯增長。綜合考慮含不同濃度抗壞血酸的培養(yǎng)基的pH值、細菌生長的遲緩期、達到穩(wěn)定期所需的時間及終末菌密度，選擇15 mmol·L-1作為S.mutans生長的最適抗壞血酸濃度，用于后續(xù)實驗。

圖2　野生型S.mutans UA159在以不同濃度抗壞血酸作為唯一碳源時的生長情況Fig 2　Growth study of wild-type S.mutans UA159 using L-ascor-bate as the only carbon source at various concentrations

2.3ptxA、ptxB基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中的表達情況

在以15 mmol·L-1抗壞血酸作為唯一碳源的TV培養(yǎng)基中，ptxA、ptxB基因的mRNA相對表達量顯著高于15 mmol·L-1葡萄糖組（圖3）?？箟难峤MptxA基因的表達量約為葡萄糖組的2倍，ptxB基因的表達量約為葡萄糖組的5倍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.4野生株與缺陷株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長能力

在以15 mmol·L-1抗壞血酸作為唯一碳源的TV培養(yǎng)基中，缺陷株的生長能力與野生株相比，受到明顯影響（圖4）。ptxA缺陷菌株的遲緩期延長，終末菌密度降低。而ptxB缺陷菌株與ptxAB缺陷菌株在監(jiān)測的72 h內(nèi)，未見明顯增長。ptxAB功能補償菌株能在一定程度上補償缺陷菌株的生長能力，但仍未達到野生型的水平。

圖3　ptxA、ptxB基因在含15 mmol·L-1抗壞血酸或葡萄糖特異性培養(yǎng)基中mRNA的表達情況Fig 3　The mRNA expression of ptxA and ptxB gene in the medium with 15 mmol·L-1L-ascorbate or glucose

圖4　野生型S.mutans UA159與ptxA、ptxB、ptxAB基因缺陷菌株及ptxAB功能補償菌株在含15 mmol·L-1抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長能力Fig 4　Growth of wild-type S.mutans UA159, ptxA-, ptxB-, ptxAB-deficient mutant and ptxAB-complemented strain in the me-dium with 15 mmol·L-1L-ascorbate

3　討論

目前在S.mutans UA159中已發(fā)現(xiàn)超過14種PTS，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖等[7-10]。PTS一般由酶Ⅰ、含組氨酸的磷酸載體蛋白（histidinecontaining phosphocarrier protein，HPr）和酶Ⅱ復(fù)合體3部分組成。其中酶Ⅱ復(fù)合體具有糖特異性，負責對特定底物的跨膜轉(zhuǎn)運及磷酸化，一般由3個蛋白組成：ⅡA、ⅡB 和ⅡC[11]。關(guān)于PTS磷酸轉(zhuǎn)移的過程目前已較為清楚：首先酶Ⅰ通過自身磷酸化，從磷酸烯醇式丙酮酸中獲得磷酸，然后把磷酸依次傳遞給HPr、ⅡA、ⅡB，最后ⅡB把磷酸傳遞給通過ⅡC轉(zhuǎn)運進來的糖類[12]。ptxA、ptxB基因編碼S.mutans UA159 PTS中抗壞血酸家族酶Ⅱ復(fù)合體中的酶ⅡA和酶ⅡB。有學(xué)者[3]曾對ptxA、ptxB基因編碼的蛋白的作用底物進行體外實驗研究，發(fā)現(xiàn)在抗壞血酸、甘露醇、蔗糖、木糖、木糖醇和果糖6種底物中，這兩種蛋白僅對抗壞血酸有活性。

本研究通過“雙次交換”同源重組的方法，將目的基因的上、下游片段插入至pFW5載體的兩個多克隆位點中，使目的基因被壯觀霉素抗性基因aad9替換，從而構(gòu)建ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株?！半p次交換”同源重組能使所得的轉(zhuǎn)化株傳代穩(wěn)定，有效避免了極性效應(yīng)[13]。關(guān)于抗壞血酸作為S.mutans生長唯一碳源時的最適濃度的研究表明，隨著抗壞血酸濃度的升高，野生株的遲緩期隨之延長，這可能與抗壞血酸濃度越高時，培養(yǎng)基的pH值越低，細菌需要更長的時間來適應(yīng)這種酸性環(huán)境有關(guān)，亦可能是在高濃度時細菌胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)改變的結(jié)果[4]，也可能是高濃度提高了氧化應(yīng)激水平，對細菌胞體造成了損傷所致[14]。qPCR檢測ptxA、ptxB基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中mRNA的表達差異，結(jié)果顯示野生株目的基因在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的表達水平明顯增高，表明抗壞血酸對ptxA、ptxB基因的表達有誘導(dǎo)作用。當培養(yǎng)基中僅存在抗壞血酸作為唯一碳源時，細菌為維持自身生長，上調(diào)ptxA、ptxB基因的表達量，以保證對抗壞血酸的充分利用。該實驗結(jié)果進一步證實了ptxA、ptxB基因與S.mutans抗壞血酸代謝相關(guān)。ptxA基因缺陷菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長能力明顯低于野生株，ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株甚至無法生長，原因為細菌體內(nèi)抗壞血酸特異性PTS過程的完整性和連續(xù)性受到破壞，細菌對抗壞血酸的吸收利用受到影響，從而影響生長，而功能補償菌株則能在一定程度上減少這種影響。但ptxA、ptxB基因在S.mutans抗壞血酸代謝中的具體調(diào)控機制及在細菌內(nèi)是否存在其他代償機制仍有待進一步研究。

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（本文編輯杜冰）

Effect of ptxA and ptxB genes of phosphotransferase system on growth of Streptococcus mutans

Wu Xinyu, Chen Xiaodan, Zhao Wanghong, Hou Jin, Chen Xuan.(Nanfang Hospital, School of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

[Key words]Streptococcus mutans;phosphotransferase system;ptxA gene;ptxB gene;L-ascorbate

[Abstract]Objective This study aims to evaluate the effect of ptxA and ptxB genes, which are important genes in the L-ascorbate phosphotransferase system (PTS) of Streptococcus mutans (S.mutans).MethodsThe ptxA-, ptxB-, and ptxAB-double deficient mutant as well as ptxAB-complemented strain were constructed.Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis was performed to evaluate the expression of the target genes of wild-type S.mutans when L-ascorbate was used as the sole carbohydrate source.The OD600values of the wild type, deficient, and complemented strains were continuously monitored, and their growth curves were constructed to compare growth capacity.ResultsPolymerase chain reaction and sequencing analyses suggested that deficient and complemented strains were successfully constructed.The expression levels of ptxA and ptxB significantly increased (P<0.01) when L-ascorbate was used as the sole carbohydrate source.The growth capacity of the deficient mutants decreased compared with that of the wild-type strain.However, the wild-type phenotype could be restored in the complemented strain.ConclusionptxA and ptxB genes are associated with L-ascorbate metabolism of S.mutans.The construction of deficient strains and complemented strain lay a foundation for further mechanism study on L-ascorbate metabolism in S.mutans.

[中圖分類號]Q 786

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.017

[收稿日期]2015-08-11； [修回日期]2016-03-05

[基金項目]國家自然科學(xué)基金項目（81050035）；廣東省高校人才引進項目（C1030636）；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長基金項目（20-13B003）

[作者簡介]吳昕彧，碩士，E-mail：michely-wxywxy@163.com

[通信作者]趙望泓，教授，博士，E-mail：zhaowh@smu.edu.com