吳昕彧　陳曉丹　趙望泓　侯晉　陳璇南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣州 510515

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變異鏈球菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)ptxA、ptxB基因?qū)?xì)菌生長(zhǎng)能力的影響

吳昕彧陳曉丹趙望泓侯晉陳璇
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣州 510515

[摘要]目的研究變異鏈球菌（S.mutans）磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）中抗壞血酸家族ptxA、ptxB基因?qū)?xì)菌生長(zhǎng)能力的影響。方法構(gòu)建ptxA、ptxB和ptxAB雙重基因缺陷菌株以及ptxAB功能補(bǔ)償菌株。在僅以抗壞血酸作為唯一碳源時(shí)，使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)野生株中ptxA、ptxB基因的表達(dá)情況。連續(xù)監(jiān)測(cè)野生株、缺陷株和補(bǔ)償株的菌液OD600值，比較其生長(zhǎng)能力。結(jié)果經(jīng)過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)和測(cè)序鑒定，結(jié)果證明缺陷株和補(bǔ)償株構(gòu)建成功。在以抗壞血酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，野生株ptxA、ptxB基因的表達(dá)量均明顯增高（P<0.01）。缺陷株的生長(zhǎng)能力較野生株有所下降，但是在補(bǔ)償株中可以得到補(bǔ)償。結(jié)論ptxA、ptxB基因與S.mutans對(duì)抗壞血酸的吸收利用密切相關(guān)，缺陷株和補(bǔ)償株的構(gòu)建為進(jìn)一步研究目的基因在S.mutans抗壞血酸代謝中的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]變異鏈球菌；磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；ptxA基因；ptxB基因；抗壞血酸

Supported by:The National Natural Science Foundation of China(81050035);Project of Talent Introduction in Universities of Guangdong Province (C1030636);President Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University(2013B003).Correspondence: Zhao Wanghong, E-mail: zhaowh@smu.edu.com.

齲病是人類發(fā)病率最高的口腔疾病。目前較為公認(rèn)的致齲菌之一是變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）。S.mutans可代謝碳水化合物，從而發(fā)揮產(chǎn)酸、黏附、生物膜形成等與致齲相關(guān)的生物學(xué)特性。2002年，S.mutans血清c型UA159菌株的全基因組測(cè)序工作全部完成。通過(guò)對(duì)基因組的分析表明，S.mutans與碳水化合物代謝相關(guān)的基因占了15%，與現(xiàn)有其他已測(cè)序的革蘭陽(yáng)性菌基因組相比，其呈現(xiàn)出更強(qiáng)的碳水化合物代謝能力[1]。而S.mutans對(duì)碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)，主要是通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）完成的[2]。鑒于PTS對(duì)S.mutans代謝碳水化合物的重要作用，研究PTS相關(guān)基因?qū)斫釹.mutans的致齲作用有重要意義。

ptxA基因（NCBI GeneID：1027857）與ptxB基因（NCBI GeneID：1027854）分別編碼S.mutans UA159 PTS中抗壞血酸家族酶Ⅱ復(fù)合體中的酶ⅡA和酶ⅡB。有學(xué)者[3]曾對(duì)這兩個(gè)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并通過(guò)體外酶活性實(shí)驗(yàn)證明它們對(duì)抗壞血酸的磷酸化具有特異性?？箟难嵩谧匀唤缰蟹植紡V泛，尤其在水果及蔬菜中含量豐富。目前已知大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）[4]、乳酸桿菌[5]等可在無(wú)氧條件下發(fā)酵抗壞血酸，以獲得維持生命活動(dòng)的碳源，但未見(jiàn)關(guān)于S.mutans通過(guò)PTS吸收利用抗壞血酸以獲得碳源的報(bào)道。本研究擬構(gòu)建ptxA、ptxB和ptxAB雙重基因缺陷菌株，以及ptxAB功能補(bǔ)償菌株，研究其在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，以揭示ptxA、ptxB基因在S.mutans利用代謝抗壞血酸中發(fā)揮的作用，并為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1菌株及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)所用菌株S.mutans UA159（北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）采用腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）培養(yǎng)，或采用添加不同濃度葡萄糖（Sigma公司，美國(guó)）或抗壞血酸（Sigma公司，美國(guó)）的TV培養(yǎng)基（含3.5%胰蛋白胨、0.04 μg·mL-1對(duì)氨基苯甲酸、0.2 μg·mL-1鹽酸硫胺酸、1 μg·mL-1煙酰胺和0.2 μg·mL-1核黃素）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）進(jìn)行培養(yǎng)。選擇性BHI培養(yǎng)基采用壯觀霉素（spectinomycin，spe）（Sigma公司，美國(guó)）抗性，spe的濃度為1 mg·mL-1。S.mutans的培養(yǎng)條件為37 ℃，厭氧培養(yǎng)（10%CO2、10%H2、80%N2）。E.coli DH5α［天根生化科技（北京）有限公司］采用Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）培養(yǎng)，選擇性LB培養(yǎng)基采用spe抗性，spe的濃度為0.1 mg·mL-1。E.coli的培養(yǎng)條件為37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)。

1.2ptxA、ptxB、ptxAB缺陷菌株及ptxAB功能補(bǔ)償菌株的構(gòu)建

根據(jù)NCBI提供的S.mutans UA159全基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件針對(duì)ptxA、ptxB及ptxAB設(shè)計(jì)引物，具體見(jiàn)表1。

表1　引物序列Tab 1　Sequences of primers

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增各基因相應(yīng)的上、下游片段，經(jīng)雙酶切后與pFW5質(zhì)粒（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院余擎教授惠贈(zèng)）進(jìn)行連接，使用E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用選擇性LB培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。將構(gòu)建成功的ptxA、ptxB 及ptxAB雙基因缺陷重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入S.mutans。使用1 μg·mL-1的感受態(tài)刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）對(duì)野生型S.mutans UA159進(jìn)行刺激，兩者混合后進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化[6]。利用選擇性BHI培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的基因組DNA進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。利用類似方法，將啟動(dòng)子序列及ptxAB片段克隆至pDL278質(zhì)粒（美國(guó)路易斯安那州立大學(xué)牙學(xué)院Zezhang T.Wen教授惠贈(zèng)），轉(zhuǎn)化入ptxAB雙重基因缺陷菌株，構(gòu)建ptxAB功能補(bǔ)償菌株。

1.3抗壞血酸作為S.mutans生長(zhǎng)唯一碳源時(shí)的最適濃度探究

分別檢測(cè)含有5、10、15、20、30 mmol·L-1抗壞血酸的TV培養(yǎng)基的pH值。將培養(yǎng)24 h后的野生型S.mutans UA159使用無(wú)菌PBS溶液洗滌2次，TV培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)菌液OD600≈0.8，按1︰100分別加入到含有上述濃度抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，每隔2 h測(cè)量各組菌液OD600值，重復(fù)3次，繪制細(xì)菌在含不同濃度抗壞血酸的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

1.4檢測(cè)ptxA、ptxB基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中的表達(dá)情況

將培養(yǎng)24 h后的野生型S.mutans UA159用無(wú)菌PBS溶液洗滌2次，TV培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)菌液OD600≈ 0.8，按1︰100分別加入到含有15 mmol·L-1抗壞血酸或葡萄糖的TV培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。使用RNAiso試劑盒（Takara公司，日本）提取細(xì)菌總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ptxA、ptxB基因的引物，16S rRNA作為內(nèi)參（表1），進(jìn)行qPCR，檢測(cè)ptxA、ptxB基因的表達(dá)情況，重復(fù)3次。使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

1.5各菌株在以抗壞血酸為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng)能力比較

將培養(yǎng)24 h后的野生型S.mutans UA159、ptxA基因缺陷菌株、ptxB基因缺陷菌株、ptxAB雙重基因缺陷菌株及ptxAB功能補(bǔ)償菌株使用無(wú)菌PBS溶液洗滌菌體2次，TV培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)菌液OD600≈0.6，按1︰100比例分別加入至含有15 mmol·L-1抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，每隔2 h測(cè)量各菌液OD600值，重復(fù)3次，繪制各基因缺陷菌株和補(bǔ)償菌株在以抗壞血酸作為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng)曲線。

2　結(jié)果

2.1ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株的鑒定

ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，各缺陷菌株P(guān)CR擴(kuò)增的片段大小與使用相應(yīng)重組質(zhì)粒作為模版所擴(kuò)增的片段大小一致，大小與預(yù)計(jì)相符。將片段測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST對(duì)比，結(jié)果顯示99%相符。

圖1　ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株的PCR鑒定Fig 1　Identification of ptxA-, ptxB- and ptxAB-deficient mutant by PCR

2.2抗壞血酸作為S.mutans生長(zhǎng)唯一碳源時(shí)的最適濃度

含5、10、15、20、30 mmol·L-1抗壞血酸的TV培養(yǎng)基的pH值分別為6.26、5.90、5.53、5.17、4.79。隨著抗壞血酸濃度的上升，培養(yǎng)基的pH值隨之下降。野生型S.mutans UA159在以不同濃度的抗壞血酸作為唯一碳源時(shí)，其生長(zhǎng)情況有所不同（圖2）。隨著抗壞血酸濃度的增加，遲緩期逐漸延長(zhǎng)。5 mmol·L-1組與10 mmol·L-1組的遲緩期較短，約為6 h，其達(dá)到穩(wěn)定期所需的時(shí)間亦較短，約為16 h，但5 mmol·L-1組與10 mmol·L-1組的終末菌密度均較低。15 mmol·L-1組的遲緩期約為12 h，其達(dá)到穩(wěn)定期所需的時(shí)間約為34 h，菌液終末OD600值約為0.6。20 mmol·L-1組的遲緩期約為24 h，但在監(jiān)測(cè)的48 h內(nèi)，未進(jìn)入穩(wěn)定期。而30 mmol·L-1組在監(jiān)測(cè)的48 h內(nèi)，細(xì)菌未見(jiàn)明顯增長(zhǎng)。綜合考慮含不同濃度抗壞血酸的培養(yǎng)基的pH值、細(xì)菌生長(zhǎng)的遲緩期、達(dá)到穩(wěn)定期所需的時(shí)間及終末菌密度，選擇15 mmol·L-1作為S.mutans生長(zhǎng)的最適抗壞血酸濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2　野生型S.mutans UA159在以不同濃度抗壞血酸作為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng)情況Fig 2　Growth study of wild-type S.mutans UA159 using L-ascor-bate as the only carbon source at various concentrations

2.3ptxA、ptxB基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中的表達(dá)情況

在以15 mmol·L-1抗壞血酸作為唯一碳源的TV培養(yǎng)基中，ptxA、ptxB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于15 mmol·L-1葡萄糖組（圖3）?？箟难峤MptxA基因的表達(dá)量約為葡萄糖組的2倍，ptxB基因的表達(dá)量約為葡萄糖組的5倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4野生株與缺陷株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力

在以15 mmol·L-1抗壞血酸作為唯一碳源的TV培養(yǎng)基中，缺陷株的生長(zhǎng)能力與野生株相比，受到明顯影響（圖4）。ptxA缺陷菌株的遲緩期延長(zhǎng)，終末菌密度降低。而ptxB缺陷菌株與ptxAB缺陷菌株在監(jiān)測(cè)的72 h內(nèi)，未見(jiàn)明顯增長(zhǎng)。ptxAB功能補(bǔ)償菌株能在一定程度上補(bǔ)償缺陷菌株的生長(zhǎng)能力，但仍未達(dá)到野生型的水平。

圖3　ptxA、ptxB基因在含15 mmol·L-1抗壞血酸或葡萄糖特異性培養(yǎng)基中mRNA的表達(dá)情況Fig 3　The mRNA expression of ptxA and ptxB gene in the medium with 15 mmol·L-1L-ascorbate or glucose

圖4　野生型S.mutans UA159與ptxA、ptxB、ptxAB基因缺陷菌株及ptxAB功能補(bǔ)償菌株在含15 mmol·L-1抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力Fig 4　Growth of wild-type S.mutans UA159, ptxA-, ptxB-, ptxAB-deficient mutant and ptxAB-complemented strain in the me-dium with 15 mmol·L-1L-ascorbate

3　討論

目前在S.mutans UA159中已發(fā)現(xiàn)超過(guò)14種PTS，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖等[7-10]。PTS一般由酶Ⅰ、含組氨酸的磷酸載體蛋白（histidinecontaining phosphocarrier protein，HPr）和酶Ⅱ復(fù)合體3部分組成。其中酶Ⅱ復(fù)合體具有糖特異性，負(fù)責(zé)對(duì)特定底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及磷酸化，一般由3個(gè)蛋白組成：ⅡA、ⅡB 和ⅡC[11]。關(guān)于PTS磷酸轉(zhuǎn)移的過(guò)程目前已較為清楚：首先酶Ⅰ通過(guò)自身磷酸化，從磷酸烯醇式丙酮酸中獲得磷酸，然后把磷酸依次傳遞給HPr、ⅡA、ⅡB，最后ⅡB把磷酸傳遞給通過(guò)ⅡC轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)來(lái)的糖類[12]。ptxA、ptxB基因編碼S.mutans UA159 PTS中抗壞血酸家族酶Ⅱ復(fù)合體中的酶ⅡA和酶ⅡB。有學(xué)者[3]曾對(duì)ptxA、ptxB基因編碼的蛋白的作用底物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)在抗壞血酸、甘露醇、蔗糖、木糖、木糖醇和果糖6種底物中，這兩種蛋白僅對(duì)抗壞血酸有活性。

本研究通過(guò)“雙次交換”同源重組的方法，將目的基因的上、下游片段插入至pFW5載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)中，使目的基因被壯觀霉素抗性基因aad9替換，從而構(gòu)建ptxA、ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株?！半p次交換”同源重組能使所得的轉(zhuǎn)化株傳代穩(wěn)定，有效避免了極性效應(yīng)[13]。關(guān)于抗壞血酸作為S.mutans生長(zhǎng)唯一碳源時(shí)的最適濃度的研究表明，隨著抗壞血酸濃度的升高，野生株的遲緩期隨之延長(zhǎng)，這可能與抗壞血酸濃度越高時(shí)，培養(yǎng)基的pH值越低，細(xì)菌需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)適應(yīng)這種酸性環(huán)境有關(guān)，亦可能是在高濃度時(shí)細(xì)菌胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)改變的結(jié)果[4]，也可能是高濃度提高了氧化應(yīng)激水平，對(duì)細(xì)菌胞體造成了損傷所致[14]。qPCR檢測(cè)ptxA、ptxB基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中mRNA的表達(dá)差異，結(jié)果顯示野生株目的基因在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的表達(dá)水平明顯增高，表明抗壞血酸對(duì)ptxA、ptxB基因的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。當(dāng)培養(yǎng)基中僅存在抗壞血酸作為唯一碳源時(shí)，細(xì)菌為維持自身生長(zhǎng)，上調(diào)ptxA、ptxB基因的表達(dá)量，以保證對(duì)抗壞血酸的充分利用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ptxA、ptxB基因與S.mutans抗壞血酸代謝相關(guān)。ptxA基因缺陷菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力明顯低于野生株，ptxB及ptxAB雙重基因缺陷菌株甚至無(wú)法生長(zhǎng)，原因?yàn)榧?xì)菌體內(nèi)抗壞血酸特異性PTS過(guò)程的完整性和連續(xù)性受到破壞，細(xì)菌對(duì)抗壞血酸的吸收利用受到影響，從而影響生長(zhǎng)，而功能補(bǔ)償菌株則能在一定程度上減少這種影響。但ptxA、ptxB基因在S.mutans抗壞血酸代謝中的具體調(diào)控機(jī)制及在細(xì)菌內(nèi)是否存在其他代償機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯杜冰）

Effect of ptxA and ptxB genes of phosphotransferase system on growth of Streptococcus mutans

Wu Xinyu, Chen Xiaodan, Zhao Wanghong, Hou Jin, Chen Xuan.(Nanfang Hospital, School of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

[Key words]Streptococcus mutans;phosphotransferase system;ptxA gene;ptxB gene;L-ascorbate

[Abstract]Objective This study aims to evaluate the effect of ptxA and ptxB genes, which are important genes in the L-ascorbate phosphotransferase system (PTS) of Streptococcus mutans (S.mutans).MethodsThe ptxA-, ptxB-, and ptxAB-double deficient mutant as well as ptxAB-complemented strain were constructed.Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis was performed to evaluate the expression of the target genes of wild-type S.mutans when L-ascorbate was used as the sole carbohydrate source.The OD600values of the wild type, deficient, and complemented strains were continuously monitored, and their growth curves were constructed to compare growth capacity.ResultsPolymerase chain reaction and sequencing analyses suggested that deficient and complemented strains were successfully constructed.The expression levels of ptxA and ptxB significantly increased (P<0.01) when L-ascorbate was used as the sole carbohydrate source.The growth capacity of the deficient mutants decreased compared with that of the wild-type strain.However, the wild-type phenotype could be restored in the complemented strain.ConclusionptxA and ptxB genes are associated with L-ascorbate metabolism of S.mutans.The construction of deficient strains and complemented strain lay a foundation for further mechanism study on L-ascorbate metabolism in S.mutans.

[中圖分類號(hào)]Q 786

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.017

[收稿日期]2015-08-11； [修回日期]2016-03-05

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81050035）；廣東省高校人才引進(jìn)項(xiàng)目（C1030636）；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目（20-13B003）

[作者簡(jiǎn)介]吳昕彧，碩士，E-mail：michely-wxywxy@163.com

[通信作者]趙望泓，教授，博士，E-mail：zhaowh@smu.edu.com