郭　鵬，李琳琳，金　華，鄒吉祥，鮑雅靜

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院 ，遼寧 大連 1166005)

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鹽脅迫下紫花苜蓿突變體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和水分利用效率的研究

郭鵬，李琳琳，金華，鄒吉祥，鮑雅靜

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院 ，遼寧 大連 1166005)

摘要：通過鹽脅迫實(shí)驗(yàn)對紫花苜蓿突變體根部各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了研究，進(jìn)一步深刻了解了紫花苜蓿的耐鹽性。利用根系掃描儀和根系分析系統(tǒng)，測定了鹽堿混合脅迫下紫花苜蓿突變體根系形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，包括根總面積、根總長度、平均直徑和根尖數(shù)。通過測定鹽脅迫下氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、蒸騰速率和水分利用效率，分析其與根系響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果顯示，不同鹽濃度下苜蓿根系形態(tài)均有不同程度的變化，輕度鹽脅迫可以促進(jìn)其生長，當(dāng)鹽分持續(xù)升高時(shí)才表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞：鹽脅迫 ；紫花苜蓿 ；蒸騰速率(Tr) ；氣孔導(dǎo)度(Gs) ；光合速率(Pn) ；水分利用效率(WUE)

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，它具有營養(yǎng)價(jià)值高，粗蛋白、維生素和礦物質(zhì)含量豐富，氨基酸的組成齊全，適口性好等特點(diǎn)，是中國重要的植物性蛋白飼料，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮著巨大作用[1-5]。紫花苜蓿在豆科牧草中的抗鹽性較強(qiáng)，種植紫花苜蓿的草地表層土壤中可溶性鹽含量明顯下降，土壤肥力有所提高。由于紫花苜蓿品種的耐鹽性鑒定和篩選是紫花苜蓿耐鹽品種選育的基礎(chǔ)，近年來國內(nèi)外許多學(xué)者對紫花苜蓿耐鹽性及相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了研究[6-9]。

本研究以紫花苜蓿為研究對象，利用形態(tài)學(xué)、生理學(xué)等技術(shù)手段以及耐鹽指標(biāo)的測定，研究了紫花苜蓿突變體適應(yīng)鹽分變化的形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)特征和細(xì)胞內(nèi)生理特性變化規(guī)律，從植物耐鹽性基礎(chǔ)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和植物耐鹽性表征的生理特性綜合探討了紫花苜蓿的耐鹽特性。通過揭示鹽脅迫下紫花苜蓿的適應(yīng)性變化規(guī)律，為擴(kuò)大鹽漬地上紫花苜蓿的種植面積并有效提高其產(chǎn)量和品質(zhì)提供了參考。通過本項(xiàng)研究可初步判定紫花苜蓿的耐鹽性能，將其應(yīng)用到國內(nèi)鹽堿地改造的工程中，對改善生態(tài)環(huán)境，增加可用土地面積，增加糧食產(chǎn)量，造福人類，具有重大的意義。

1材料與方法

1.1材料

供試紫花苜蓿為耐鹽突變體ZHMX-MY-24。以紫花苜蓿公農(nóng)二號 (耐鹽指數(shù)≤0.5，耐鹽級別為4級)下胚軸為外植體，誘導(dǎo)獲得愈傷組織，經(jīng)甲基磺酸乙酯(EMS)處理后，在1/2海水濃度MS培養(yǎng)基上篩選獲得了耐半海水的突變體，經(jīng)鹽池反復(fù)選擇，得到了耐鹽株系ZHMX-MY-24(耐鹽指數(shù)≥1.3，耐鹽級別為1級)。

1.2方法

1.2.1發(fā)苗

將所需的苜蓿種子取若干，挑選大小一致、飽滿的不同品種紫花苜蓿種子，經(jīng)消毒處理后放入有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中置于光照培養(yǎng)箱，晝夜培養(yǎng)溫度25℃，每天補(bǔ)充所失水分，培養(yǎng)10 d左右，胚根突破種皮2 mm并至少有1片或2片子葉保留2/3以上(不包括2/3)認(rèn)為萌發(fā)。

1.2.2移栽

為保證在取出根系時(shí)不使其受損，使用蛭石作為基質(zhì)。培養(yǎng)土為營養(yǎng)土和蛭石以2:1的比例混合體。每盆放入適量的培養(yǎng)土，用玻璃棒在盆中按出均勻的5個(gè)洞，將兩個(gè)品種萌發(fā)好的幼苗移栽到每個(gè)花盆里，每個(gè)洞放入2～5棵苗。移栽后用曬好的自來水澆透，緩苗3 d，使幼苗可以適應(yīng)新環(huán)境。每隔3 d澆水一次。

1.2.3脅迫

移栽后30 d需要進(jìn)行鹽堿脅迫。脅迫前2 d不澆水。NaCl鹽溶液：A對照 (0 mmol·L-1)、B低鹽(50 mmol·L-1)、C中鹽(150 mmol·L-1)、D高鹽(250 mmol·L-1)各100 mL分別進(jìn)行處理。每個(gè)處理重復(fù)3次。鹽濃度及對應(yīng)的質(zhì)量見表1。

表1　鹽濃度及對應(yīng)的質(zhì)量

1.2.4取樣及測量數(shù)據(jù)

根系形態(tài)實(shí)驗(yàn)：鹽脅迫30 d后，將整盆植株完整倒出并用去離子水清洗干凈，吸干表面水分，將其浸入1 %的結(jié)晶紫溶液中染色后，放入50 %的乙醇溶液中置冰箱備用。掃描前需再用去離子水沖洗根系，而后將根系放入裝有去離子水的透明盤中進(jìn)行掃描。掃描圖片用Delta-t scan軟件進(jìn)行分析，包括根系形態(tài)學(xué)參數(shù)：根總面積、根總長度、平均直徑和根尖數(shù)。

蒸騰和水分利用效率實(shí)驗(yàn)：鹽脅迫24 d以后，選取倒數(shù)第3片完全展開的健康完整葉片活體測定紫花苜蓿葉片的光合生理指標(biāo)，每個(gè)處理重復(fù)3次，利用Licor-6400 光合便攜儀(美國)分別測定田間和盆栽苜蓿在不同鹽濃度的光合參數(shù)，所有測定均在09:00 —11:00 內(nèi)完成。光合有效輻射( PAR) 控制在800 μmol ·m-2s-1，實(shí)驗(yàn)參比氣體采自溫室頂部，CO2濃度約為400 μmol ·mol-1，環(huán)境溫度和大氣濕度沒有特別控制。測定的主要光合作用參數(shù)有：凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)。植物水分利用效率(WUE)的測定：WUE=Pn /Tr。

2結(jié)果與分析

2.1不同鹽脅迫對全株根系形態(tài)特征的影響

盆栽鹽脅迫對紫花苜蓿根系形態(tài)特征的影響見表2。

表2　盆栽鹽脅迫對紫花苜蓿根系形態(tài)特征的影響

從表2中的全株根系形態(tài)指標(biāo)可以看出，鹽分對紫花苜蓿根總面積、根總長度、平均直徑及根尖數(shù)均有影響。輕度鹽處理下，根總面積都增加，而根總長度和根尖數(shù)的增加與對照相比呈現(xiàn)顯著性差異，說明在此鹽濃度下紫花苜蓿根系受到輕微的水分脅迫，為緩解這一傷害，根總面積、根總長度、根系的平均直徑和根尖數(shù)隨之增加，以便從土壤中吸收更多的水分。而中度鹽處理時(shí)，通過對根系的觀察，根系的平均直徑和根總長度顯著低于輕度鹽處理(P<0.05)，但還高于對照。根系在中度鹽處理時(shí)的上述根系指標(biāo)都低于對照，這可能是由于盆栽紫花苜蓿的根系還未發(fā)育成熟，更容易受到鹽分的影響。重度鹽處理下的紫花苜蓿幼苗根系的各項(xiàng)參數(shù)下降明顯。

2.2根系形態(tài)特征與鹽濃度的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步確定根系形態(tài)特征和鹽濃度的關(guān)系，對根系形態(tài)特征和鹽濃度的相關(guān)性(見表3)進(jìn)行分析。由表3可以清晰的反映出各參數(shù)之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)得出，鹽濃度與根總面積顯著負(fù)相關(guān)，與平均直徑和根尖數(shù)極顯著負(fù)相關(guān)，但未與根總長度達(dá)到顯著水平。

表3　盆栽試驗(yàn)中鹽濃度與紫花苜蓿根系

注：*代表相關(guān)；**代表極相關(guān)

田間紫花苜蓿根系在鹽處理后的形態(tài)變化如圖1?？梢钥吹?，對照組與輕度鹽脅迫組的根系發(fā)達(dá)，輕度鹽處理下的根長度和側(cè)根數(shù)量要比對照組多，而中度鹽和重度鹽處理則明顯少于對照組，且有部分根已經(jīng)死亡。

2.3不同濃度鹽脅迫對紫花苜蓿水分利用效率(WUE)的影響

氣孔導(dǎo)度表示氣孔張開的程度，其影響光合作用及蒸騰作用，同時(shí)與蒸騰作用呈正比。潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)可以在一定程度上表示植物葉片最大的光合能力。各處理的紫花苜蓿葉片潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)見表4。在輕度鹽處理下氣孔導(dǎo)度要高于對照，而隨著鹽濃度的增高，氣孔導(dǎo)度開始下降。這說明，輕度鹽處理下，植物受到輕度的水分脅迫，由于根系的變化導(dǎo)致植物體內(nèi)的水分含量增加，導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度也增加。

圖1　田間紫花苜蓿根系在鹽處理后的形態(tài)變化

A. 未加鹽處理; B. 輕度鹽處理;C. 中度鹽處理; D. 重度鹽處理

表4　各處理的紫花苜蓿葉片潛在氣孔導(dǎo)度指數(shù)

蒸騰作用(transpiration)是水分從活的植物體表面(主要是葉子)以水蒸氣狀態(tài)散失到大氣中的過程，與物理學(xué)的蒸發(fā)過程不同，蒸騰作用不僅受外界環(huán)境條件的影響，而且還受植物本身的調(diào)節(jié)和控制，因此它是一種復(fù)雜的生理過程[10-11]。太陽輻射和大氣CO2濃度等環(huán)境因子直接地控制植物的光合作用、蒸騰作用、氣孔導(dǎo)度和水分利用效率,同時(shí)它們也對環(huán)境變化做出相應(yīng)的反應(yīng)，具有很強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)和適應(yīng)能力[12-15]。氣孔作為CO2和水氣進(jìn)出的共同通道，微妙地調(diào)節(jié)著碳固定和水分平衡關(guān)系,但光合產(chǎn)物和水分的運(yùn)輸系統(tǒng)和方向是不相同的:一方面,葉片通過調(diào)節(jié)氣孔導(dǎo)度可以使碳固定達(dá)到最大,另一方面,氣孔行為還受光合產(chǎn)物的反饋抑制,這就造成了氣孔對CO2和水氣擴(kuò)散的不同步,進(jìn)而影響植物的水分利用效率。植物遭受多種逆境脅迫時(shí),最終都直接或間接歸結(jié)到水分代謝的紊亂,因此WUE的高低較好的體現(xiàn)了抗逆境的能力。為了進(jìn)一步了解鹽脅迫下紫花苜蓿根系與地上植物體內(nèi)水分的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)測定了盆栽條件下不同鹽濃度處理的蒸騰速率和光合速率并計(jì)算出水分利用效率。三者隨鹽濃度的變化規(guī)律如圖2-圖4。

圖2　蒸騰速率隨鹽濃度的變化規(guī)律

圖3　紫花苜蓿凈光合速率隨鹽濃度變化規(guī)律

圖4　水分利用效率隨鹽濃度變化規(guī)律

Tr和WUE在不同鹽濃度脅迫下的變化趨勢是一致的，即WUE先上升后下降, Tr一直呈下降趨勢。在無脅迫處理時(shí)，第25 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)測得的WUE數(shù)值為3.44 μmol·mmol-1。但在輕度鹽處理下，除了第15 h外，WUE均高于對照。隨著鹽濃度的增加，WUE不斷下降，重度鹽處理下降至最低。而Tr試驗(yàn)中隨著鹽脅迫的加重一直不斷降低，直到嚴(yán)重鹽脅迫時(shí)降至最低。這說明，輕度鹽脅迫促進(jìn)了植物WUE、Tr、Pn都有所上升，而中度和重度鹽脅迫則嚴(yán)重影響了植物的水分利用效率，導(dǎo)致所有指標(biāo)都有所下降，重度時(shí)為急劇下降。

3討論

(1)在不同鹽脅迫對田間不同土壤深度根系影響過程中，在輕度鹽處理下均較對照顯著增加，隨著鹽處理程度的加大，根總面積開始下降，且重度鹽處理時(shí)顯著低于對照。上述數(shù)據(jù)說明輕度鹽處理對紫花苜蓿根總面積有促進(jìn)作用，中度脅迫對根總面積影響與對照比較差異不顯著，重度鹽處理使紫花苜蓿根總面積下降。根系平均直徑在輕度和中度鹽處理下，變化不顯著，在重度鹽處理下才顯著低于對照。其原因歸結(jié)為在輕度鹽脅迫下，紫花苜蓿根系相應(yīng)機(jī)制啟動(dòng)，包括相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)根系的生長[12]。

(2)在不同鹽處理下全株根系形態(tài)的特征參數(shù)分析過程中，輕度鹽處理下促進(jìn)了根系的生長發(fā)育，增加了其對鹽分的適應(yīng)性。而中度鹽處理下紫花苜蓿根總面積和根尖數(shù)開始顯著低于對照(r<0.05)，但根總長度和平均直徑并未與對照達(dá)到顯著水平，重度鹽處理下除平均直徑未與對照達(dá)到顯著差異外，根總面積、根總長度和根尖數(shù)均顯著低于對照(r<0.05)，說明此時(shí)紫花苜蓿根系的生長受到極大地抑制。鹽脅迫下紫花苜蓿根面積、根長度、根尖數(shù)、根平均半徑等形態(tài)上的變化雖然趨勢不一, 而彼此相互協(xié)調(diào)維系了根系的吸水功能進(jìn)而提高對鹽脅迫的適應(yīng)性，但這種適應(yīng)能力是有限的，隨著鹽濃度不斷增加，根系質(zhì)膜透性持續(xù)升高, 根系生長受到抑制, 根系吸收能力明顯減弱。而這種情況不是一定在所有植物里都存在。Brock等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，即使在輕度鹽脅迫下，擬南芥的根系都出現(xiàn)了較為明顯生長抑制[15]。

(3)田間試驗(yàn)條件下，除平均直徑外，其他根系形態(tài)均與鹽濃度呈極顯著的負(fù)相關(guān)。根總面積除與根總長度顯著正相關(guān)外，與其他各根系形態(tài)指標(biāo)均極顯著正相關(guān)。這說明鹽分對紫花苜蓿根系的生長有一定的抑制作用，且各根系形態(tài)指標(biāo)的變化規(guī)律相一致。而在盆栽實(shí)驗(yàn)中，紫花苜蓿根系各形態(tài)指標(biāo)的變化規(guī)律不是很一致，其原因可能在于盆栽試驗(yàn)中，紫花苜蓿相應(yīng)鹽脅迫的敏感性大大增加，規(guī)律性變化起伏大[13]。

(4)在輕度鹽脅迫下，田間和盆栽苜蓿葉片Tr和WUE分別會下降和升高。這是由于Tr顯著下降有利于減少地上部水分散失,在光合速率下降不顯著的情況下，導(dǎo)致WUE在輕度鹽脅迫下升高,而WUE的提高有利于干物質(zhì)積累,且由于Na+進(jìn)入植物體的量與Tr成比例,降低Tr可限制Na+進(jìn)入葉片,相對減少了毒害離子(Na+)的吸收。因此,輕度鹽脅迫下,苜蓿葉片Tr下降和WUE提高是一種適應(yīng)性反應(yīng),既屬于非鹽生植物的避Na+機(jī)制,也是植物適應(yīng)滲透脅迫的重要機(jī)制之一，但非鹽生植物的這種適應(yīng)能力是有限的,隨著鹽脅迫濃度的加大,植株水分失衡加劇,葉片膨壓降低,葉片含水量進(jìn)一步下降，光合能力持續(xù)下降,導(dǎo)致WUE降低?？傊}脅迫下,紫花苜蓿根系形態(tài)的改變是一種開源策略;而蒸騰耗水量的下降以及WUE的提高則是節(jié)流的一種表現(xiàn)。開源體現(xiàn)在鹽脅迫下根系形態(tài)的適應(yīng)性變化上，節(jié)流體現(xiàn)在鹽逆境下捕獲最大限度的水源并用最少量的水分消耗而獲得最高的產(chǎn)量。

4結(jié)論

(1)低濃度鹽脅迫下根系面積、總根長、根直徑、根尖數(shù)的升高有利于提高根系吸水能力。

(2)葉片Tr 的下降和WUE 的升高有利于減少地上部水分散失, 補(bǔ)償根系水分供應(yīng)的不足,是苜蓿對滲透脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。

(3)隨著鹽脅迫濃度時(shí)間的加大,上述根系形態(tài)指標(biāo)受抑制程度加大,根系吸收能力持續(xù)下降,同時(shí)Tr的進(jìn)一步下降導(dǎo)致蒸騰拉力持續(xù)降低,水分失衡加劇，導(dǎo)致光合速率進(jìn)一步降低,進(jìn)而導(dǎo)致WUE降低,鹽脅迫對植株的傷害加重。

(4)鹽脅迫下，根系(地下部分)吸收能力的下降是導(dǎo)致水分(地上部分)失衡的主要原因,是決定苜蓿品種耐鹽性的關(guān)鍵因素。

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(責(zé)任編輯鄒永紅)

Study on Morphological Structure Characteristics and Water Use Efficiency of Medicago Sativa under Different Salt Stress

GUO Peng, LI Lin-lin, JIN Hua, ZOU Ji-xiang, BAO Ya-jing

(School of Environment and Resources, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Abstract:Through experimental studies on physiological characteristics of root system of alfalfa under the salt stress, we can really understand the salt tolerance of alfalfa. Delta-t scan software is used to scan the picture and analyze specific root morphological parameters including total root area, root length density, mean diameter and the number of root tips. 6400 photosynthetic apparatus was used to observe the stomatal conductance, net photosynthetic rate, transpiration rate and water use efficiency and measure different germination under salt stress in alfalfa. The results showed that changes of root morphology were different under different salt concentration. Mild salt stress can promote their growth, while the salinity increased it showed obvious inhibition. This experiment laid the foundation for screening salt tolerant alfalfa germplasm resources, and it has a profound significance to expand the utilization of alfalfa in saline alkali land.

Key words:salt stress; medicago sativa; transpiration rate (Tr); stomatal conductance (Gs); photosynthetic rate (Pn); water use efficiency (WUE)

收稿日期：2016-01-07；最后修回日期：2016-03-07

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170168)；科技部火炬計(jì)劃(2012GH531899)；國家星火計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013GA651006)；遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011209001)；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀科技人才項(xiàng)目(LR2013055)。

作者簡介：郭鵬(1980-)，男，山東膠州人，講師，博士，主要從事植物生物抗逆學(xué)研究。

文章編號：2096-1383(2016)03-0193-05

中圖分類號：S541.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A