袁雪明　劉陸濱▲　趙志香.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)院牙體二科，黑龍江佳木斯　54002；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯　54002

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內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞TNF-α、IL- 6表達(dá)的影響

袁雪明1劉陸濱1▲趙志香2△
1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)院牙體二科，黑龍江佳木斯154002；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154002

［摘要］目的研究內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)HPLFs細(xì)胞，將細(xì)胞分為LPS刺激0 mg/L（對(duì)照組）、1 mg/L（實(shí)驗(yàn)Ⅰ組）、10 mg/L（實(shí)驗(yàn)Ⅱ組），應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α因子的表達(dá)情況。結(jié)果LPS刺激6 h時(shí)，HPLFs中TNF-α、IL-6的表達(dá)量顯示：Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS刺激12 h時(shí)，HPLFs中TNF-α、IL-6的表達(dá)量顯示：Ⅰ、Ⅱ組也顯著高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HPLFs細(xì)胞中TNF-α、IL-6的表達(dá)隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對(duì)照組、及Ⅰ組、Ⅱ組經(jīng)LPS刺激12 h的TNF-α、IL-6表達(dá)均顯著高于刺激6 h，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論內(nèi)毒素脂多糖（LPS）能夠刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6炎癥因子。

［關(guān)鍵詞］內(nèi)毒素脂多糖（LPS）；人牙周膜成纖維細(xì)胞；TNF-α；IL-6

▲通訊作者

△在讀碩士研究生

革蘭陰性菌的內(nèi)毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是一種公認(rèn)的重要的牙周病致病因子，研究發(fā)現(xiàn)，其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、合成代謝，并刺激巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌IL-6、TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的作用［1］。牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal fibroblast，HPLFs）是牙周組織中數(shù)量最多的細(xì)胞，牙周膜成纖維細(xì)胞（HPLFs）在牙周組織健康中發(fā)揮著重要作用［2］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討經(jīng)脂多糖刺激后的牙周膜成纖維細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1一般材料

DMEM培養(yǎng)液（Gibco，USA）；牛血清（Gibco，USA）；LPS從細(xì)菌Salmonella minnesota Re595中提取并保存。鼠SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒；CO2培養(yǎng)箱（Yamato，Japan）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；倒置顯微鏡（廣西梧洲市光學(xué)儀器廠）；酶標(biāo)分析儀（Thermo corporation，USA）；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)（Media Cybernetics，USA）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（R&D systems，美國），白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒（R&D systems，美國）。

1.2方法

1.2.1HPLFs的取材、體外分離和培養(yǎng)選擇2013年1月～2014年1月我院因阻生齒而行拔除術(shù)中分離的新鮮健康牙周膜組織，入選患者共12例，其中男7例，女5例，年齡范圍18～28歲，無齲病、牙周病和根尖周病，3個(gè)月內(nèi)未使用抗生素類、激素類藥物，無糖尿病史、心血管病史、吸煙史等。將牙周膜組織在超凈臺(tái)內(nèi)剪碎，應(yīng)用含有100 U雙抗PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，去除表面的凝血塊及殘留物質(zhì)，用2 U/mL的DispaseⅡ分散酶浸泡16～18 h，剝除牙周膜上皮組織，采用組織塊法進(jìn)行HPLFs的原代細(xì)胞培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件：37℃，950 mL/L空氣，50 mL/L CO2，100%濕度，取第2～3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組將培養(yǎng)的HPLFs細(xì)胞以5×105/孔密度接種于6孔板，加入適量DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)至細(xì)胞生長達(dá)80%匯合后棄原培養(yǎng)液，對(duì)照組為不含LPS的20 mL/L胎牛血清DMEM，PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，細(xì)胞用0.25%戊二醛固定。實(shí)驗(yàn)組加入預(yù)先配置的LPS，使其濃度分別為1 mg/L、10 mg/L，將細(xì)胞分為LPS刺激0 mg/L（對(duì)照組）、1 mg/L（實(shí)驗(yàn)Ⅰ組）、10 mg/L（實(shí)驗(yàn)Ⅱ組），分別于LPS刺激6 h和12 h后每孔加入1 mL Trizol進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取總RNA及合成cDNA。1.2.3 IL-6、TNF-α的檢測(cè)加入LPS刺激6、12 h收集上清液150 μL，應(yīng)用據(jù)ELISA間接夾心法檢測(cè)IL-6、TNF-α因子的表達(dá)情況，按試劑盒說明嚴(yán)格操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，其中計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

見表1。LPS刺激6 h時(shí)，HPLFs中TNF-α的表達(dá)量顯示：Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS刺激12 h時(shí)，HPLFs中TNF-α的表達(dá)量顯示：Ⅰ、Ⅱ組也顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HPLFs細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對(duì)照組、Ⅰ組、Ⅱ組經(jīng)LPS刺激12 h的TNF-α表達(dá)均顯著高于刺激6 h，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響

見表2。LPS刺激6 h時(shí)，HPLFs中IL-6的表達(dá)量顯示：Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS刺激12 h時(shí)，HPLFs中IL-6的表達(dá)量顯示：Ⅰ、Ⅱ組也顯著高于對(duì)照組，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HPLFs細(xì)胞中IL-6的表達(dá)隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對(duì)照組、Ⅰ組、Ⅱ組經(jīng)LPS刺激12 h的IL-6表達(dá)均顯著高于刺激6 h，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1　內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響（±s，ng/L）

表1　內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響（±s，ng/L）

注：各組刺激6 h：F=23.539，P＜0.01；各組刺激12 h：F=31.532，P＜0.01；分別與對(duì)照組比較，t=23.643、45.213、51.364、45.321，*P＜0.01；分別與刺激6 h比較，t=8.342、19.235、94.342，#P＜0.01

組別　LPS刺激6 h　LPS刺激12 h對(duì)照組（0 mg/L）Ⅰ組（1 mg/L）Ⅱ組（10 mg/L）26.32±3.64 157.80±24.97*263.30±39.25*62.36±11.29#392.3±95.41*#428.27±71.32*#

表2　內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響（±s，ng/L）

表2　內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響（±s，ng/L）

注：各組刺激6 h：F=11.342，P＜0.01；各組刺激12 h：F=21.53，P＜0.01；分別與對(duì)照組比較，t=7.342、8.231、36.231、32.643，*P＜0.01；分別與刺激6 h比較，t=5.321、12.932、23.984，#P＜0.01

組別　刺激6 h　刺激12 h對(duì)照組（0 mg/L）Ⅰ組（1 mg/L）Ⅱ組（10 mg/L）21.63±4.22 62.27±11.39*83.11±13.26*38.23±5.38#112.62±23.75*#127.34±22.97*#

3　討論

牙周炎癥是以革蘭陰性厭氧桿菌為主要致病菌的混合感染，革蘭陰性厭氧桿菌的主要毒力因子之一是其細(xì)菌外膜成分脂多糖（LPS）。且研究發(fā)現(xiàn)，齦溝液中IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子參與了牙周炎的炎癥過程。

本實(shí)驗(yàn)采用LPS作為刺激源，檢測(cè)重要炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α在體外培養(yǎng)牙周膜成纖維細(xì)胞（HPLFs）中的表達(dá)，以探討LPS對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞的牙周炎癥的作用［3-5］。牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周組織內(nèi)主要的細(xì)胞成分，近年來的研究表明，成纖維細(xì)胞可與脂多糖直接作用，作為免疫輔助細(xì)胞參與牙周組織的破壞過程，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展，在LPS引起的牙周炎組織病理損害過程中具有重要作用［6-8］。

TNF-α和IL-6是牙周炎病理發(fā)生的關(guān)鍵炎癥因子，僅能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生前列腺E2，活化破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收，抑制膠原合成，加速牙周組織破壞，還可以增強(qiáng)血管的通透性誘導(dǎo)白細(xì)胞移出，在牙周組織的局部炎癥破壞中具有重要作用［9-11］。

本研究通過培養(yǎng)HPLFs細(xì)胞，將細(xì)胞分為LPS刺激0 mg/L（對(duì)照組）、1 mg/L（實(shí)驗(yàn)I組）、10 mg/L（實(shí)驗(yàn)Ⅱ組），應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α因子的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，LPS刺激6 h時(shí)，1mg/L LPS 和10 mg/L LPS兩組中的IL-6、TNF-α水平分別顯著高于對(duì)照組，LPS刺激12 h時(shí)，1 mg/L LPS和10 mg/L LPS兩組中的IL-6、TNF-α水平也分別顯著高于對(duì)照組，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明HPLFs細(xì)胞中TNF-α、IL-6的表達(dá)隨LPS刺激濃度呈劑量依賴性；且對(duì)照組、Ⅰ組、Ⅱ組經(jīng)LPS刺激12 h的TNF-α、IL-6表達(dá)均顯著高于刺激6 h，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明LPS能通過刺激HPLFs產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)牙周炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

HPLFs可能作為免疫激活輔助細(xì)胞，在LPS作用下產(chǎn)生TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，參與局部免疫反應(yīng)，在牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。HPLFs獲得免疫輔助細(xì)胞活性的同時(shí)，可能會(huì)喪失其多向分化潛能活性，影響牙周組織代謝和修復(fù)過程［12-14］。

綜上，我們認(rèn)為，內(nèi)毒素脂多糖（LPS）能夠刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6炎癥因子，參與了牙周炎的發(fā)生和發(fā)展過程。脂多糖的細(xì)胞毒作用直接影響著牙周膜成纖維細(xì)胞的生長與增殖，還能刺激巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等多種炎性細(xì)胞因子，對(duì)炎性反應(yīng)起決定作用［15］，因此，研究阻斷細(xì)胞因子的分泌對(duì)未來預(yù)防和治療牙周病具有十分重要的意義，值得進(jìn)一步深入開展研究。

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Effect of lipopolysaccharide（LPS）on the expression of TNF-α and IL-6 in Human periodontal fibroblast cells

YUAN Xueming1LIU Lubin1ZHAO Zhixiang2
1.Department of 2nd Dental，the Stomatology Hospital of Second Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China；2.Jiamusi University，Jiamusi 154002，China

［Abstract］Objective To study the effect of lipopolysaccharide（LPS）on the expression of TNF-α and IL-6 in human periodontal fibroblast cells. Methods HPLFs cells were cultured. The cells were divided into LPS stimulated 0 mg/L （control group），1 mg/L（experimental groupⅠ）and 10 mg/L（experimental groupⅡ）. The expression of IL-6 and TNF-α was detected by ELISA method. Results The expression of LPS，TNF-α and IL-6 in HPLFs was significantly higher than that in control group at 6 hours，the expression of groupⅡand groupⅠwas significantly higher than that in control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）. The expression of I and TNF-in HPLFs was significantly higher than that in control group，the difference was statistically significant in the expression groupⅡand IL-6 in LPS in 12 hours（P＜0.01）. The expression of TNF-α and IL-6 in HPLFs cells with LPS stimulus concentration in a dosedependent manner；and the control group，and groupⅠ，groupⅡby LPS stimulation the expressions of 12 hours of TNF-α and IL-6 were significantly higher than those in the 6 h of stimulation，the difference was statistically significant（P＜0.01）. Conclusion Lipopolysaccharide（LPS）can stimulate the secretion of TNF-α and IL-6 inflammatory factors in human periodontal fibroblast cells.

［Key words］Lipopolysaccharide lipopolysaccharide（LPS）；Human periodontal fibroblast；TNF-α；IL-6

［中圖分類號(hào)］R780.2

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］B

［文章編號(hào)］1673-9701（2016）10-0001-03

收稿日期：（2016-01-08）