丁海霞　趙連梅　崔雯萱　丁　娟　單保恩

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究中心，石家莊050000)

?

CCL5在胃癌患者腫瘤組織和血清中的表達及臨床意義①

丁海霞趙連梅崔雯萱丁娟單保恩

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究中心，石家莊050000)

[摘要]目的：檢測胃癌患者組織及血清中的CCL5的表達并探討血清中CCL5表達的臨床意義。方法：選擇臨床病理資料齊全的胃癌蠟塊標本48例，取癌組織和癌旁組織(對照組)，采用SP免疫組化法檢測CCL5在胃癌組織及癌旁組織中的表達。抽取新診斷胃癌患者50例(均未行手術(shù)及放化療)及健康志愿者16例(對照組)的血清標本，采用ELISA檢測CCL5在胃癌患者及健康志愿者血清中的表達，研究血清中CCL5的表達水平與胃癌的病理因素及生物學行為之間的關(guān)系。結(jié)果：CCL5在胃癌患者組織及血清中呈高表達，與對照組相比，明顯升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.001)，胃癌患者血清中CCL5的表達水平與胃癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期情況及腫瘤分化程度均具有相關(guān)性(P<0.001)，與患者的性別及年齡無相關(guān)性。結(jié)論：CCL5 可能成為胃癌患者腫瘤分期及疾病進展的重要分子標志。

[關(guān)鍵詞]胃癌；CCL5：腫瘤組織；血清

胃癌是世界上導致腫瘤相關(guān)死亡的第二大疾病，是消化道最常見的惡性腫瘤之一，生長迅速，晚期預后差，腫瘤的浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與患者的預后密切相關(guān)，腫瘤生物學行為及預后的正確判斷對病人選擇最佳的治療方案至關(guān)重要[1]。腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于宿主細胞和腫瘤的復雜的相互作用，而趨化因子在腫瘤與宿主細胞的相互作用中扮演了重要的角色，趨化因子家族包含大量的具有趨化作用的低分子量蛋白，以趨化粒細胞遷移到炎癥部位。趨化因子家族按結(jié)構(gòu)分為四大類：C、CC、CXC、CX3C，至今已鑒別出50多種不同的趨化因子，大部分是CC和CXC家族成員。CC類趨化因子吸引單核細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞到達炎癥部位，但能否趨化中性粒細胞尚無定論[2]。

趨化因子配體5(CCL5/RANTES)屬于CC類趨化因子家族，其受體有CCR1、CCR3和 CCR5[2]。CCL5在腫瘤和炎性疾病中發(fā)揮重要作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌病人中CCL5的表達與疾病進展直接相關(guān)[3-8]，另外，在宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和黑色素瘤患者的組織和血清中CCL5的表達與疾病進展具有相關(guān)性[8-10]。目前對CCL5的表達與胃癌的關(guān)系研究極少[11-14]。在本研究中我們對比了CCL5在胃癌組織和癌旁組織及胃癌患者和健康志愿者血清中的表達差異，并對胃癌患者血清中CCL5的表達與胃癌的病理因素及生物學行為之間的關(guān)系進行分析，試圖為臨床判斷胃癌分期及疾病進展提供重要的分子生物學指標。

1資料與方法

1.1一般資料胃癌組織取材于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院2013年住院的48例胃癌患者，其中男28例，女20例，年齡50～75歲，術(shù)前均未行放化療及其他抗腫瘤治療。胃癌患者50例，女24例，男26例；年齡34～82歲，中位年齡54.5歲，收集于2013年10月～2014年3月就診于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科的患者，經(jīng)術(shù)后病理組織學明確診斷為胃癌，之前未經(jīng)過放、化療及生物治療，無合并其他疾病的胃癌患者。所有患者術(shù)后均依照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)制定的胃癌TNM分期第七版標準記錄病理類型、臨床分期及分化類型。健康對照組16例，女9例 ，男7例；年齡25～80歲， 中位年齡 52.5歲。均為河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院經(jīng)健康體檢中心體檢合格的健康人。

1.2主要的試劑及儀器CCL5兔抗人單克隆抗體購自上海拜力生物科技有限公司，SP免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋科技公司。人調(diào)節(jié)激活正常T-細胞表達分泌因子(RANTES)檢測試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司)。450 nm酶標儀(美國雷杜RT-6000)。

1.3方法胃癌組織及癌旁組織切片后常規(guī)HE染色，確定標本的組織分化程度，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)免疫組織化學法檢測CCL5在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平。石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化組織切片，采用枸櫞酸鹽緩沖液煮沸熱修復30 min后冷卻至室溫，3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗2×3 min；1∶100滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗2×3 min；滴加二抗,37℃30 min,PBS沖洗2×3 min;DAB顯色，自來水充分沖洗后，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

結(jié)果判定：依照細胞陽性著色程度(抗原含量)，可分為：弱陽性(+)┅1分；中等陽性(++)┅2分；強陽性(+++)┅3分。依照陽性細胞數(shù)量，可分為：弱陽性(+)，指陽性細胞總數(shù)在25%以下；中等陽性(++),指陽性細胞總數(shù)在25%～49%；強陽性(+++ )，指陽性細胞總數(shù)在50%以上)。 目前多采用積分綜合計量。計算公式為：(+)%x1 +(++)%x2+(+++)%x3；總數(shù)值<1.0者為(+)記為1分，1.0～1.5者為(++)記為2分,>1.5者為(+++)記為3分，表達陰性者記為0分。至少隨機觀察5～10個HPF。

手術(shù)前抽取經(jīng)胃鏡證實為胃癌的患者血液標本3 ml，室溫放置4 h，然后1 409 r/min離心20 min，取上清置于-80度保存，同時收集健康志愿者等量血液離心后凍存，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清中CCL5的含量。試驗前將所有試劑和標本緩慢均衡至室溫，加樣后37℃孵育2 h，棄去液體，甩干，不用洗滌，加入檢測液A 100 μl，37℃孵育1 h，洗板3次后加入檢測液B 100 μl，37℃孵育0.5 h，洗板5次，37℃避光顯色20 min后加入終止液，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)，制作標準曲線，根據(jù)標準曲線的回歸方程式計算出血清中CCL5的含量。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，CCL5在癌和癌旁組織的表達差異應用病理評分量化后采用配對設計的t檢驗，CCL5在胃癌及健康志愿者中的表達差異及與臨床病理特征的關(guān)系研究應用參數(shù)及非參數(shù)檢驗，P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1CCL5在胃癌患者組織中的表達根據(jù)胃癌組織間質(zhì)中巨噬細胞陽性著色程度和細胞數(shù)量進行積分統(tǒng)計，總數(shù)值<1.0者為(+)記為1分，1.0～1.5者為(++)記為2分,>1.5者為(+++)記為3分，表達陰性者記為0分，見圖1，兩者統(tǒng)計比較發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CCL5表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.001)，見表1。

2.2CCL5在胃癌患者血清中的表達胃癌患者血清中CCL5的表達量為(7.07±2.02) ng/ml，明顯高于健康對照組(1.97±0.22 )ng/ml (P<0.001)，見表2和圖2。

2.3胃癌患者血清中CCL5的表達與胃癌病理因素的關(guān)系胃癌患者血清中CCL5的表達水平在患者的年齡及性別比較中無明顯差別(P>0.05)，反之，在腫瘤大小、浸潤越深、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、瘤栓形成、病理分期方面的比較中有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，即腫瘤越大、浸潤越深、分化程度越低、分期越晚、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和瘤栓形成的患者其血清中CCL5的表達水平越高。具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見表3。

圖1　CCL5在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況(SP，×200)Fig.1　Expression of CCL5 in gastric cancer and precancerous tissues(SP，×200)Note: A.Precancerous tissues,pathological score=0;B.Gastric cancer,pathological score=1;C.Gastric cancer,pathological score=2;D.Gastric cancer,pathological score=3.The arrows show positive particles in cytoplasm of macrophage.

表1CCL5在胃癌組織及癌旁組織中的表達水平比較

Tab.1Expression of CCL5 in gastric cancer and adjacent tissues

GroupsExpressionofCCL5(n)-++++++PCancer0101721<0.0001Adjacentcancer44400

表2CCL5在胃癌患者及對照組血清中表達水平比較

Tab.2Comparison of serum level of CCL5 in gastric cancer group and control group

Groupsn(ng/ml)PvalveGastricancergroup507.07±2.02<0.001Controlgroup161.97±0.22

圖2　CCL5在胃癌患者及對照組血清中表達水平比較Fig.2　Comparison of serum level of CCL5 in gastric cancer group and control group

表3血清CCL5表達水平與胃癌病理因素的關(guān)系

Tab.3Relationship between expression of serum CCL5 levels and pathological factors of gastric cancer

FeaturenThelevelofCCL5(ng/ml)PAge(year)>0.01≤65227.75±1.69>65286.54±2.12Gender>0.01Male267.35±1.45Female247.05±1.87Tumorsize(cm)<0.01≤5236.05±1.31>5277.54±1.35Invasiondepth<0.01T1+T2256.24±1.42T3+T4257.48±1.38Degreeofdifferentiation<0.001High196.18±1.23Low318.47±1.33Lymphnodemetastasis<0.001No216.24±1.26Yes298.52±1.31Pathologicalgrade<0.01Ⅰ-Ⅱ276.08±1.32Ⅲ-Ⅳ237.35±1.35Tumorthrombus<0.01No206.28±1.28Yes307.42±1.23Envelop<0.01Without116.06±1.55With397.37±1.16

3討論

腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤和宿主細胞之間復雜的相互作用關(guān)系，而趨化因子在腫瘤向宿主遠處器官的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15-17]。CCL5作為趨化因子家族的一員參與腫瘤和炎癥的發(fā)生[2-4]，已有報道CCL5在胃癌前病變患者及胃炎患者血清中無高表達[16]，而其在胃癌中的表達的研究相對較少[17-20]，我們的研究中對胃癌組織和癌旁組織及胃癌患者和健康對照者的血清CCL5的表達水平進行了檢測，從而了解趨化因子與胃癌的關(guān)系，分析其與腫瘤的病理特征及生物學行為的關(guān)系。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，CCL5在胃癌組織中呈高表達，與癌旁組織相比具有統(tǒng)計學意義，與健康對照組相比，胃癌患者血清中CCL5的表達水平明顯升高，CCL5的高水平表達與患者年齡及性別無關(guān)，腫瘤體積越大、浸潤越深、分化越低、病理分期越晚、伴有瘤栓形成及淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的患者血清中CCL5的水平越高，說明CCL5與胃癌的生長、分化、病理分期及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

CCL5主要表達于T淋巴細胞、巨噬細胞、血小板、滑膜成纖維細胞、腎小管上皮細胞和一定類型的腫瘤細胞[19]。 NF-κB通路的激活誘導CCL5的產(chǎn)生。CCL5可以招募大量的粒細胞到達炎癥部位，包括T細胞、巨噬細胞、嗜堿性粒細胞，同時對由T細胞分泌的細胞因子如IL-2、IFN-γ也有趨化作用。CCL5也可以使特殊的自然殺傷細胞激活和增殖從而產(chǎn)生CC趨化-激活殺傷細胞[19]，由CD8+T細胞和其他免疫細胞產(chǎn)生的CCL5表現(xiàn)出抑制HIV進入靶細胞的能力。CCL5主要通過其受體發(fā)揮作用，目前發(fā)現(xiàn)的受體有CCR1、CCR3和 CCR5，而CCR5是最主要的[19]，CCL5/CCR5的相互作用導致胃癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展主要有以下幾種方式：作為生長因子促進血管發(fā)生；調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)，包括招募其他的基質(zhì)細胞和炎細胞；參與免疫逃逸機制[20]。因此以CCL5/CCR5軸為靶點的治療已經(jīng)在乳腺癌患者中得到應用，在其他腫瘤治療中的應用尚待進一步研究[21]。

總之，血清CCL5水平可能成為胃癌患者腫瘤行為及預后的重要分子標志，我們將進一步對其受體及CCL5的基因多態(tài)性進行研究，從而為胃癌的分子靶向藥物治療提供新的靶點。

參考文獻：

[1]Schall TJ,Bacon KB.Chemokines,leukocyte trafficking,and inflammation [J].Curr Opin Immunol,1994,6(6):865-873.

[2]Singh S,Sadanandam A,Singh R,etal.Chemokines in tumor angiogenesis and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26(3-4):453-467.

[3]Luboshits G,Shina S,Kaplan O,etal.Elevated expression of the CC chemokine regulated on activation,normal T cell expressed and secreted (RANTES) in advanced breast carcinoma[J].Cancer Res,1999,59(18):4681-4687.

[4]Azenshtein E,Luboshits G,Shina S,etal.The CC chemokine RANTES in breast carcinoma progression:regulation of expression and potential mechanisms of promalignant activity[J].Cancer Res，2002,62(4):1093-1102.

[5]Robinson SC,Scott KA,Wilson JL,etal.A chemokine receptor antagonist inhibits experimentalbreast tumor growth[J].Cancer Res，2003,63(23):8360-8365.

[6]Eissa SA,Zaki SA,El-Maghraby SM,etal.Importance of serum IL-18 and RANTES as markers for breast carcinoma progression[J].Egypt Nat Cancer Inst,2005,17(1):51-55.

[7]Yaal-Hahoshen N,Shina S,Leider-Trejo L,etal.The chemokine CCL5 as a potential prognostic factor predicting disease progression in stage II breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2006,12(15):4474-4478.

[8]Niwa Y,Akamatsu H,Niwa H.Correlation of tissue and plasma RANTES levels with disease course in patientswith breast or cervical cancer[J].Clin Cancer Res,2001,7(2):285-289.

[9]Tsukishiro S,Suzumori N,Nishikawa H.Elevated serum RANTES levels in patients with ovarian cancer correlate with the extent of the disorder[J].Gynecol Oncol,2006,102(3):542-545.

[10]Kwon KH，Lee YC，Chung JH，etal.Association study of chemokine(C-C motif)ligand 5 gene polymorphism and papillarythyroid Cancer[J].Invest Surg，2013,26(6):319-324.

[11]Kim HK,Song KS,Park YS,etal.Elevated levels of circulating platelet micro particles.VEGF,IL-6 and RANTES in patients with gastric cancer:possible role of ametastasis predictor[J].Eur J Cancer,2003,39(2):184-191.

[12]Okita K,Furuhata T,Kimura Y,etal.The interplay between gastric cancer cell lines and PBMCs mediated by the CC chemokine RANTES plays an important role in tumor progression[J].Exp Clin Cancer Res,2005,24(3):439-446.

[13]Sugasawa H,Ichikura T,Tsujimoto H,etal.Prognostic significance of expression of CCL5/RANTES receptors in patients with gastric cancer[J].Surg Oncol,2008,97(5):445.

[14]Sugasawa H,Ichikura T,Kinoshita M,etal.Gastric cancer cells exploit CD4+cell-derived CCL5 for their growth and prevention of CD8+cell-involved tumor eli mination[J].Int J Cancer,2008,122(11):2535-2541.

[15]Balkwill F.Chemokine biology in cancer[J].Se min Immunol,2007,15(1):49-55.

[16]Sima AR,Sima HR,Rafatpanah H,etal.Serum chemokine legend 5(RANTES)level might be utilized as a predictive marker of tumor behavior and disease prognosis in patients with gastric adenocarcinoma[J].J Gastrointest Cancer,2014,45:476-480.

[17]Muller A,Homey B,Soto H,etal.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nat,2001,410(6824):50-56.

[18]Murphy P.Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis[J].N Engl J Med,2001,345(11):833-835.

[19]Soria G,Ben-Baruch A.The inflammatory chemokines CCL2 and CCL5 in breast cancer[J].Cancer Lett,2008,267(2):271-285.

[20]Kershaw MH,Westwood JA,Darcy PK.Geneengineered T cells for cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2013,13,(8):525-541.

[21]Lv D,Zhang Y,Kim HJ,etal.CCL5 as a potential immunotherapeutic target in triple-negative breast cancer[J].Cell Mol Immunol,2013,10(4):303-310.

[收稿2015-04-01修回2015-07-20]

(編輯倪鵬)

Expression and clinical significance of CCL5 in tumor tissues and serum of patients with gastric cancer

DINGHai-Xia,ZHAOLian-Mei,CUIWen-Xuan，DINGJuan，SHANBao-En.

DepartmentoftheInstituteofCancerResearch,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China

[Abstract]Objective:In order to detect the expression of CCL5 in tissue and serum of patients with gastric carcinoma and to explore the clinical significance of expression of CCL5 in serum.Methods: 48 cases patients with completed clinical and pathological data of gastric cancer paraffin block specimens were selected.Cancer and paracan-cerous tissues were used as control,using SP immunohistochemical method to detect CCL5 in gastric cancer tissues and adjacent tissues.Serum specimens were extracted from 50 cases of newly diagnosed patients with gastric cancer (from none underwent operation and chemotherapy) and 16 healthy volunteers,ELISA was used to detect the expression of CCL5 in gastric cancer patients and healthy volunteers in the serum,the differences between the expression of gastric cancer patients and healthy volunteers,and the relationship between pathologicalfactors and biological behavior of gastric cancer and expression of CCL5 were studied.Results: The high expression of CCL5 in tissue and serum of gastric cancer patients,compared with control group,increased significantly,with statistical difference (P<0.001).The expression of CCL5 and gastric cancer invasion depth,lymph node metastasis, TNM staging and tumor differentiation were correlated (P<0.001),no correlation with gender and age of patients.Conclusion: CCL5 may be the importantmolecular marker in patients with gastric cancer staging and signs of the disease.

[Key words]Ganstric cancer;CCL5；Tumor tissues；Serum

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.023

作者簡介：丁海霞(1981年-)，女，碩士，主要從事內(nèi)分泌與免疫機制方面研究。

中圖分類號R735.2

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0707-04

①本文為河北省自然科學基金資助項目(No.H2015206376)。

通訊作者及指導教師：趙連梅(1981年-)，女，博士，助理研究員，主要從事基礎(chǔ)免疫方面研究。

單保恩(1962年-)，男，醫(yī)學博士，教授，博士生導師，主要從事基礎(chǔ)免疫方面研究。