唐　培　陳秋華　路　杰　蘭巧芬　廖煥金　陳燕文　李尚妹　吳　平　劉華鋒　謝　彤　潘慶軍

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心&風濕免疫科，湛江524001)

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類風濕關節(jié)炎患者嗜堿性粒細胞與疾病活動度和Th1應答失衡的關系①

唐培②陳秋華路杰蘭巧芬廖煥金陳燕文李尚妹吳平劉華鋒謝彤潘慶軍

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心&風濕免疫科，湛江524001)

[摘要]目的：探討RA患者外周嗜堿性粒細胞的活化情況和活化機制，以及與疾病活動度和Th1/Th2應答失衡的關系。方法：本研究運用流式細胞術檢測類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中Th1/Th2細胞的比值和嗜堿性粒細胞數(shù)量及活化水平，用ELISA法檢測血清中IFN-γ和IL-4水平，用Western blot法檢測血清中循環(huán)的IgE型免疫復合物(IgE-CIC)的水平。結果：Th1/Th2細胞比值與DAS28評分呈低度線性正相關關系；RA患者血清IFN-γ水平較對照組顯著升高，且和疾病活動度相關，但IL-4的水平則無差異；RA患者嗜堿性粒細胞數(shù)量較對照組顯著降低，且高度活化(高表達CD203c和CD62L)；RA患者外周血存在高水平的IgE-CIC,而對照組則無。結論：RA患者外周血嗜堿性粒細胞高度活化、數(shù)量顯著減少，可能會遷徙至次級淋巴組織和炎癥部位，對抗外周Th1應答失衡，有望為RA的防治提供新的線索。

[關鍵詞]類風濕關節(jié)炎; 嗜堿性粒細胞; Th1 細胞; IFN-γ; IL-4

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種常見的T、B細胞免疫應答失衡并以炎癥細胞浸潤關節(jié)滑膜為特征的慢性自身免疫性疾病，常伴有血清類風濕因子陽性等特點。其發(fā)病機制雖尚未完全解析，但是Th1/Th2應答失衡在RA疾病的發(fā)展中起到重要作用[1]。既往關于RA患者Th1/Th2應答失衡的研究，主要認為活動期RA患者外周血中以Th1介導的細胞應答為主[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)，在RA發(fā)病早期外周血中以Th2應答為主，而長期慢性RA則是以Th1應答為主[2]。在RA出現(xiàn)臨床關節(jié)病變的最早期，滑膜和滑膜液中出現(xiàn)短暫的Th2型細胞因子譜(IL-4和IL-13)但顯著缺乏Th1型細胞因子譜(IFN-γ)，這可決定早期滑膜炎發(fā)展成RA，而不是非RA持久性滑膜炎[3]。Aarvak[4]首次發(fā)現(xiàn)1例成年活動期RA患者滑膜中以Th2應答為主而外周血PBMC以Th1應答為主，兩年后發(fā)展為滑膜中以Th0和Th1應答為主，且與RA炎癥相關。以上研究說明Th1/Th2型細胞因子的產(chǎn)生在RA疾病的早期和晚期不同，提示在疾病的不同階段可能存在Thl/Th2應答模式的改變，而且在不同部位如外周循環(huán)系統(tǒng)和關節(jié)局部所起的作用可能不同，仍需進一步深入探討。

近年來，隨著嗜堿性粒細胞(Basophil)條件缺失技術的發(fā)展和高純度細胞分選技術的應用，發(fā)現(xiàn)它是Th2細胞早期分化過程中主要細胞因子IL-4的產(chǎn)生細胞，可調(diào)節(jié)Th2型免疫應答，進而參與Th2免疫介導的相關疾病。此外，還發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細胞可表達MHCⅡ類分子和共刺激分子，并可遷移至引流淋巴結，攝取抗原并提呈給初始T淋巴細胞，參與抗原遞呈[5]。但嗜堿性粒細胞在RA發(fā)病中的作用和機制尚未見報道。

本研究擬對RA患者體內(nèi)Th1和Th2水平及嗜堿性粒細胞的數(shù)量和活化狀態(tài)進行檢測，并進一步探討嗜堿性粒細胞的活化機制，有望為嗜堿性粒細胞靶向防治RA提供線索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象2013年10月至2014年9月在廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院風濕免疫科確診的RA患者62例，平均年齡為(49.5±1.5)歲，病程(7.6±4.9)年，所有入選病例均符合1987年美國風濕病學會RA分類標準[6]?；顒悠赗A患者62例(根據(jù)疾病活動度指標DAS28評分(評分≤5.1為低中活動度組，評分>5.1為高活動度組)，其中低中活動度RA患者33例，高活動度RA患者29例，另有22例本院同期健康志愿者(男4例，女18例)作為對照組，對照組平均年齡(46.7±2.5)歲。

1.1.2檢測試劑熒光抗體PE-anti-human CD203c，APC/Cy7-anti-human CD62L，Percp-anti-human CD3，F(xiàn)ITC-anti-human CD8，Alexa Fluor 647-anti-human IFN-γ， PE/Cy7--anti-human IL-4，均購自Biolegend公司?？谷薎gE抗體(HRP)，購自Abcam公司。人IL-4 ELISA試劑盒和人IFN-γ ELISA 試劑盒購自博士德生物技術公司。紅細胞裂解液和固定液購自eBioscience公司。人外周血淋巴細胞分離液，購自天津灝洋生物科技公司。刺激劑 PMA-lonomycin和阻斷劑BFA-monomycin購自杭州聯(lián)科生物技術公司。所有試劑均嚴格按照廠家說明書保存和操作。

1.2實驗方法

1.2.1流式檢測外周血中Th1/Th2細胞的比值和嗜堿性粒細胞數(shù)量和活化指標采集RA病人和正常對照組EDTA抗凝的外周靜脈血，密度梯度離心法獲得PBMC。各組加入刺激劑PMA-lonomycin于37℃孵育4 h后，再加入阻斷劑BFA-monensin混勻，37℃孵育2 h。PBS洗滌后用染色液重懸，加入抗CD3和CD8抗體混勻，37℃孵育30 min。PBS洗滌后加入固定液混勻，37℃孵育15 min，再加入通透液混勻，1 500 r/min×6 min離心洗滌一次。棄上清，加入通透液和抗IL-4和IFN-γ抗體混勻，37℃孵育30 min。PBS洗滌重懸后用流式細胞儀進行檢測。以CD3+CD8-標記為CD3+CD4+T細胞。以IFN-γ和IL-4同型對照為標準設門確定Th1和Th2細胞亞群位置。采集RA病人和正常對照組EDTA抗凝的外周靜脈血，取200 μl加入CD203c及CD62L抗體混勻，37℃孵育30 min。再加入紅細胞裂解液混勻，避光放置15 min。1 500 r/min×6 min離心后PBS 洗滌一次并重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測。以CD203c和CD62L抗體的同型對照為標準設門識別嗜堿性粒細胞。結果以嗜堿性粒細胞表達CD203c和CD62L平均熒光強度(Median fluorescence intensity,MFI)的相對值表達。

1.2.2ELISA法檢測血清中IFN-γ和IL-4水平采集RA病人和正常對照組外周靜脈血4 ml，靜置后1 500 r/min×15 min離心后收集血清，-80℃凍存?zhèn)錂z。按照說明書操作，最后用酶標儀在450nm測定吸光度(OD)值。應用Excel程序建立標準曲線計算血清IFN-γ及IL-4濃度。

1.2.3免疫印跡法檢測外周血中IgE型免疫復合物(IgE-CIC)水平采集RA病人和正常對照組外周靜脈血4 ml，靜置后1 500 r/min×15 min離心后收集血清，常規(guī)雙聚乙二醇(PEG 6000)法提取循環(huán)免疫復合物[7]。然后經(jīng)SDS-PAGE 電泳和轉膜后進行免疫印跡染色，即5%封閉蛋白封閉2 h后加入抗人IgE-HRP(1∶800)4℃過夜。PBS洗滌后曝光。

2結果

2.1RA患者外周Th1/Th2細胞的比值及其與DAS28評分的相關性結果顯示，Th1/Th2細胞比值與DAS28呈線性正相關關系 (圖1A)。RA患者高活動度組Th1/Th2細胞比值顯著高于低中活動度組和對照組(圖1B)。

2.2RA患者血清IFN-γ和IL-4水平RA患者高活動度組血清IFN-γ水平顯著高于低中活動度組和對照組(圖2A)，而三組血清IL-4的水平則無顯著性差異(圖2B)。

2.4對照組與RA患者外周嗜堿性粒細胞數(shù)量和活化度的比較以CD203c陽性識別外周嗜堿性粒細胞(圖3A、B)[8]，在流式細胞術檢測圖上，嗜堿性粒細胞主要分布于淋巴細胞的右上部分。通過檢測其CD203c和CD62L的表達水平，可分析其活化程度(圖3C、D)。

圖1　RA患者外周血Th1/Th2細胞的比值及其與DAS28評分的相關性Fig.1　Ratio of Th1/ Th2 cells in RA patients and its correlation with DAS28 scoreNote: The control group (n=22),low and medium activity RA group (n=33) and high activity RA group (n=29).*.P<0.05.

圖2　RA患者血清IFN-γ和IL-4水平的比較Fig.2　Serum levels of IFN-γ and IL-4Note: The control group (n=22),low and medium activity RA group (n=33) and high activity RA group (n=29).*.P<0.05，***.P<0.001.

RA患者高活動度組和低中活動度組CD203c陽性嗜堿性粒細胞數(shù)量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義；高活動度組與低中活動度組CD203c陽性嗜堿性粒細胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義(圖4A)。RA患者高活動度組和低中活動度組嗜堿性粒細胞CD203c MFI均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義；高活動度組與低中活動度組嗜堿性粒細胞MFI比較，差異無統(tǒng)計學意義 (圖4B)。RA患者高活動度組嗜堿性粒細胞CD62L的MFI高于低中活動度組和對照組，而低中活動度組又高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義 (圖4C)。

圖3　流式細胞術中外周血嗜堿性粒細胞的識別和活化指標的量化Fig.3　Detection of basophils and its activation markers in flow cytometryNote: A.Scattergram of peripheral blood;B.The abszisse abscissa is PE-CD203c,P1 gate representatives basophils population;C.The abszisse abscissa representatives fluorescence intensity of PE-CD203c;D.The abszisse abscissa representatives fluorescence intensity of APC-Cy7-CD62L.

圖4　對照組與RA患者外周嗜堿性粒細胞數(shù)量和活化度的比較Fig.4　Comparison of control group and RA patients with peripheral basophils quantities and activation degreesNote: The control group (n=22),low and medium activity RA group (n=33) and high activity RA group (n=29).**.P<0.01,***.P<0.001.

圖5　對照組和RA患者外周血循環(huán)IgE型免疫復合物水平Fig.5　Levels of IgE-CIC in serum of control and RA patientsNote: A.WB of IgE-CIC in the serum of control group and RA patients；B.Analysis of the WB results of IgE-CIC in the serum of control group (n=22),RA patients with low and medium activity group (n=33) and the high activity group (n=29)；***.P<0.001.

2.5RA患者血循環(huán)IgE型免疫復合物水平免疫印跡發(fā)現(xiàn)RA患者外周血循環(huán)內(nèi)存在高水平IgE型免疫復合物(IgE-CIC)，高活動度組高于低中活動度組和對照組(圖5A、B)。

3討論

首先，本研究應用流式細胞術檢測Th1/Th2細胞的比例和ELISA法檢測血清IFN-γ和IL-4水平，結果均發(fā)現(xiàn)，RA患者外周以Th1應答為主?；诒窘M入選病人病程(7.6±4.9年)較長，且主要為中老年患者(49.5±1.5歲)，故推測其發(fā)病狀態(tài)主要處于發(fā)病的中晚期，符合文獻報道的長期慢性RA則是以Th1應答為主[2]。

嗜堿性粒細胞的活化后可釋放大量的活性介質(zhì)(組胺、白三烯、細胞因子等)[9]，進而介導組織損傷[10]，同時表面標志物CD203c、CD63和CD11b等表達上調(diào)[10,11]。本研究以CD203c和CD62L為活化標記探討RA患者嗜堿性粒細胞活化情況[8]。結果發(fā)現(xiàn)活動期RA患者外周嗜堿性粒細胞數(shù)量顯著降低，活化程度顯著升高。將RA患者根據(jù)DAS28評分劃分為低活動度、中活動度和高活動度組，由于低活動度組例數(shù)較少，因此我們將低活動度與中活動度組合并與高活動度組進行比較后發(fā)現(xiàn)RA患者活動度越高，外周血中嗜堿性粒細胞的活化程度越高，即嗜堿性粒細胞的活化水平與疾病活動度相關。提示，嗜堿性粒細胞數(shù)量和活化程度有望作為評估RA疾病活動度的新指標。已報道，嗜堿性粒細胞位于外周血循環(huán)中，較少遷移至其他組織器官但其表達黏附分子CD62L(一種淋巴歸巢受體)[12,13]，可介導淋巴細胞通過高靜脈內(nèi)皮細胞向次級淋巴組織器官遷移[14]。同時有文獻報道，在以Th2應答為主的Lyn-/-狼瘡樣小鼠外周血嗜堿性粒細胞CD62L表達上調(diào)，同時在其脾臟和淋巴結均可見嗜堿性粒細胞的浸潤[12]，提示CD62L可能介導外周血嗜堿性粒細胞向次級淋巴組織器官遷移。本研究結果提示，在RA患者中，CD62L可能介導活化的嗜堿性粒細胞向次級淋巴組織器官或者關節(jié)滑膜等炎癥部位遷移導致外周血嗜堿性粒細胞數(shù)量減少，仍需要檢測RA患者次級淋巴組織和炎癥部位，如關節(jié)滑膜中嗜堿性粒細胞的浸潤情況。

嗜堿性粒細胞可通過IgE依賴或非IgE依賴途徑活化[5]，但在RA發(fā)病中活化機制尚未見報道。本研究用PEG沉淀試驗[7]發(fā)現(xiàn)RA患者血清中含高水平的IgE型免疫復合物。也有同行報道，IgE型免疫復合物在RA患者體內(nèi)存在，特別是合并有重度關節(jié)炎和血管炎的患者體內(nèi)更為普遍[15-17]。IgE型抗核抗體在RA病人血清中以免疫復合物的形式存在[18]，并且這些免疫復合物可以激活嗜堿性粒細胞[13]。在RA患者外周血和關節(jié)液中可檢測到包含IgE抗體的IgE-CIC[19-21]，且IgE-CIC陽性的RA患者疾病活動度高于陰性的RA患者[21]。此外，IgE-CIC還可活化多種炎癥效應細胞，如肥大細胞、中性粒細胞和單核細胞等[19,23]，促進RA疾病的進展。另有報道，瓜氨酸化蛋白和IgE型抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)形成的免疫復合物可通過與FcεRI受體交聯(lián)活化RA患者的嗜堿性粒細胞[24]。

綜上所述，RA患者外周血嗜堿性粒細胞高度活化、數(shù)量顯著減少，可能會遷徙至次級淋巴組織和炎癥部位，對抗外周Th1應答失衡，有望為RA的防治提供新的線索。

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[收稿2015-08-25修回2015-09-15]

(編輯倪鵬)

Relationships between basophil and disease activity and imbalance of Th1 responses in rheumatoid arthritis patients

TANGPei,CHENQiu-Hua,LUJie，LANQiao-Fen,LIAOHuan-Jin,CHENYan-Wen,LIShang-Mei,WUPing,LIUHua-Feng,XIETong,PANQing-Jun.

ClinicalResearchCenter&DepartmentofRheumatologyandImmunology，AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001，China

[Abstract]Objective:To investigate the activation state of peripheral basophil from RA patients and its mechanism,and the relationship between disease activity and imbalance of Th1/Th2 response.Methods: Flow cytometry was employed to test the ratio of Th1/Th2 cell and the number of basophil and its activation state in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from rheumatoid arthritis (RA).ELISA was used to measure serum levels of IFN-γ and IL-4.Western blot was employed to detect serum circulating immune complexes containing IgE (IgE-CIC).Results: The ratio of Th1 to Th2 cell have a low linear correlation with the DAS28 score.Serum levels of IFN-γ in patients with RA was significantly higher than the control group,and correlated with the disease activity,but not IL-4.Levels of basophil of RA patients was significantly reduced compared with the control group,and highly activated (high expression of CD203c and CD62L).The presence of high levels of IgE-CIC in RA patients,but not in control group.Conclusion: Peripheral basophil of RA patients that were highly activated and significantly reduced,may migrate to secondary lymphoid tissues and sites of inflammation to against the imbalance of Th1 response,which may provide new clues for the prevention and treatment of RA .

[Key words]Rheumatoid arthritis;Basophil;Th1 cells;IFN-γ;IL-4

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.022

作者簡介：唐培(1989年-)，女，碩士，主要從事自身免疫性疾病發(fā)病機制的研究。通訊作者及指導教師：謝彤(1967年-),男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事風濕免疫性疾病防治研究，E-mail:xt1234@163.com。潘慶軍(1978年-),男，博士，副教授，主要從事風濕免疫性疾病發(fā)病機制研究，E-mail:stilwapan@gmail.com。

中圖分類號R593.22

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0702-05

①本文受國家自然科學基金(81471530)和廣東省自然科學基金(S2013010011568)資助。

②同時供職于武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，武漢430060。