易　敏　王　嶸　沈婷婷

(青海省第五人民醫(yī)院病理科，西寧810007)

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microRNA-130b在結(jié)腸癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義研究

易敏王嶸①沈婷婷

(青海省第五人民醫(yī)院病理科，西寧810007)

[摘要]目的：研究微小RNA 130b(microRNA-130b，miR-130b)在結(jié)腸癌(Colonic carcinoma，CRC)中的表達(dá)情況及生物學(xué)意義。方法：收集2013年1月至2015年3月于我院普通外科行手術(shù)切除的CRC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織共60例，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-130b在CRC組織及癌旁組織中的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析miR-130b表達(dá)水平與患者臨床病理資料間的相關(guān)性；采用人工合成的miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，分別采用CCK-8分析、BrdU檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖變化，流式細(xì)胞儀及Caspase3/7活性分析檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果：miR-130b在CRC組織中表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(P<0.05)；miR-130b高表達(dá)與腫瘤體積增大(≥5 cm，P<0.05)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期，P<0.05)顯著相關(guān)；在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-130b可顯著抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05)。結(jié)論：miR-130b在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)并與腫瘤惡性臨床病理特征有關(guān)，miR-130b可能通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡來(lái)抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)及發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]MicroRNA-130b；結(jié)腸癌；增殖；凋亡

結(jié)腸癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，其生物學(xué)惡性程度高，疾病進(jìn)展快，早期診斷困難，極大地危害廣大人民群眾的身體健康。近年來(lái)，針對(duì)EGFR分子的西妥昔單抗[2]及針對(duì)VEGF分子的貝伐單抗[3]等分子靶向藥物在結(jié)腸癌的治療中呈現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。因而，尋找新的敏感而有效的腫瘤分子標(biāo)志物成為提高我國(guó)結(jié)腸癌診治水平的關(guān)鍵方法之一。

MicroRNAs(miRNA)是一類短鏈的非編碼RNA，它能夠與靶基因的mRNA特異性結(jié)合進(jìn)而降解mRNA單鏈或抑制其翻譯[4]。研究表明，結(jié)腸癌組織中存在多種miRNA的異常表達(dá)，如原癌性的miR-21在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高并與較晚的腫瘤臨床分期相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21通過(guò)下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白PDCD4(miR-21-ITGB4-PDCD4)來(lái)促進(jìn)腫瘤抗凋亡作用[5]；而具有抑癌活性的miR-218可以通過(guò)降解BMI-1及CDK6等與腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)的分子來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[6]。miR-130b已經(jīng)被證實(shí)是一種重要的腫瘤調(diào)節(jié)基因，在多種人類惡性腫瘤中存在表達(dá)異常升高[7]，并與腫瘤增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[8]。但是，miR-130b在人結(jié)腸癌中的臨床病理意義及其具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-130b在結(jié)腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用，研究miR-130b在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的診斷與治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標(biāo)本本課題經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核后開(kāi)展。收集2013年1月至2015年3月間于我院普通外科行手術(shù)切除的結(jié)腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本60例，其中男42例，女18例，年齡40～75歲，平均年齡(53.1±2.2)歲。所有入組患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本于離體30 min內(nèi)取材，分別置于液氮或4%多聚甲醛溶液中保存。

1.1.2主要試劑Trizol試劑及脂質(zhì)體2000(Lipofecta mineTM2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(KR201)和miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(FP401)均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞及正常人結(jié)腸FHC細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；miR-130b特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、RNU6B引物、人工合成的miR-130b抑制物(miR-130b inhibitor)及陰性對(duì)照microRNA inhibitor均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司；BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)CST公司(#6813)；Apo-ONE? Homogeneous Caspase-3/7檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR按說(shuō)明書(shū)提取結(jié)腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的RNA。先按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Poly A加尾及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以2uL cDNA配制Real-time PCR體系，按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性 94℃ 2 min,變性94℃ 20s,退火延伸 60℃ 34s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以RNU6B基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-130b相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)SW480及FHC細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1×DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。每2～4日傳代一次，穩(wěn)定傳代2～3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞接種于6孔板中，用含10% FBS的1×DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)50%左右，實(shí)驗(yàn)分組及處理如下：實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 pmol miR-130b inhibitor及5 μl轉(zhuǎn)染試劑；對(duì)照組每孔加入100 pmol陰性對(duì)照(Negative Control,NC) inhibitor及5 μl轉(zhuǎn)染試劑。每孔加入不含血清的1×DMEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 ml，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4CCK-8細(xì)胞活性分析分別收集轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后的SW480細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105ml-1，以200 μl/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔及1個(gè)空白對(duì)照孔，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的光密度(OD)值。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5BrdU摻入試驗(yàn)按試劑說(shuō)明書(shū)分別配制1×洗脫緩沖液、1×檢測(cè)抗體溶液、1×HRP結(jié)合二抗溶液和10×BrdU溶液。將轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor的SW480細(xì)胞以5 000/孔種植于96孔板，培養(yǎng)箱孵育24 h，加入1/10體積培養(yǎng)基的10×BrdU溶液，培養(yǎng)箱孵育24 h后，以300 g離心10 min，棄培養(yǎng)基，加入100 μl/孔的固定變形溶液，室溫孵育30 min，移除固定液，加入100 μl/孔1×檢測(cè)抗體溶液，室溫孵育1 h，棄抗體檢測(cè)溶液，1×洗脫緩沖液沖洗平板3次。加入100 μl/孔=1×HRP結(jié)合二抗溶液，室溫孵育30 min，棄二抗工作液，1×洗脫緩沖液沖洗平板3次。加入100 μl TMB底物，室溫孵育30 min后加入100終止溶液。30 min內(nèi)450 nm吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)取轉(zhuǎn)染72 h后的SW480細(xì)胞，冷PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，胰酶消化細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min后棄去上清，1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106ml后每管加入細(xì)胞懸液500 μl，再加入10 μl PI及5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡?；靹蚝螅覝叵卤芄夥磻?yīng)10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7Caspase3/7活性分析將轉(zhuǎn)染72 h后的SW480細(xì)胞接種于96孔板，并設(shè)置3個(gè)空白孔。室溫解凍100×Caspase底物和Apo-ONE? Caspase-3/7緩沖液，渦旋混勻。取100 μl底物加入9 900 μl緩沖液中配置Apo-ONE? Caspase-3/7試劑。每孔加入100 μl Apo-ONE? Caspase-3/7試劑，搖床輕微混勻30 s。室溫孵育2 h，使用ELISA平板計(jì)數(shù)器測(cè)量490 nm細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2結(jié)果

2.1結(jié)腸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-130b的相對(duì)表達(dá)量經(jīng)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)，60例結(jié)腸癌組織中miR-130b的平均相對(duì)表達(dá)量為(6.643±0.201)，而對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-130b的平均相對(duì)表達(dá)量為(2.337±0.057)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)證明，miR-130b在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖1　miR-130b在結(jié)腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)Fig.1　Relative expression of miR-130b in CRC and tumor adjacent tissuesNote: *.P<0.05.

表1miR-130b表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n=60)

Tab.1Clinical Correlation of miR-130b expression in CRC (n=60)

FeaturesClassificationmiR-130bexpressionlevelPAge<50year6.341±0.2110.337≥50year6.731±0.142GenderMale6.813±0.1210.408Female6.321±0.237Tumorvolume<5cm4.135±0.1070.0021)≥5cm8.137±0.132Numberofnodules16.641±0.2410.407≥26.801±0.172HistopathologicalG1～G26.217±0.1070.073GradeG36.791±0.129LymphaticNO5.398±0.0910.058MetastasisYES6.741±0.110Ⅰ～Ⅱ4.703±0.1020.0031)TNMstageⅢ～Ⅳ7.714±0.121

Note：1)P<0.05

2.2miR-130b表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征間的相關(guān)性分析將結(jié)腸癌中miR-130b的平均相對(duì)表達(dá)量與患者年齡、性別、腫瘤體積、腫瘤數(shù)量、組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理資料間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中miR-130b高表達(dá)與腫瘤體積增大(≥5 cm)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)呈正相關(guān)(P<0.05)，提示腫瘤組織中高表達(dá)的miR-130b可能影響腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程。

2.3下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)通過(guò)qRT-PCR分別檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC中ZNF217的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SW480中miR-130b的表達(dá)量均較FHC細(xì)胞顯著升高(P<0.05，圖2A)。我們?cè)赟W480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染入miR-130b抑制物(miR-130b inhibitor)，qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)miR-130b inhibitor可顯著下調(diào)SW480細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)水平(P<0.05，圖2B)。

2.4下調(diào)miR-130b抑制SW480細(xì)胞增殖為研究抑制miR-130b表達(dá)對(duì)SW480增殖能力的影響，首先采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor后24、48及72 h SW480細(xì)胞活力的變化，結(jié)果如圖3A所示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor后可顯著降低SW480細(xì)胞活力(P<0.05)。然后，我們將BrdU摻入轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色，酶標(biāo)儀分析發(fā)現(xiàn)miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞DNA合成能力顯著降低[(117.290±7.541)vs(43.716±5.071)，P<0.05，圖3B]，提示細(xì)胞增殖受到抑制。

2.5下調(diào)miR-130b促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡腫瘤生長(zhǎng)是細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡共同作用的過(guò)程，因而，我們進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)下調(diào)miR-130b表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果證實(shí)，在miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染72 h后，miR-130b組細(xì)胞凋亡比例較NC組顯著升高[(12.214±2.073)vs(28.974±2.805)，P<0.05,圖4A、B]。Caspase3/7活性分析結(jié)果顯示，下調(diào)miR-130b表達(dá)后SW480細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)的酶活性顯著增強(qiáng)[(115.718±11.314)vs(217.235±20.083)，P<0.05，圖4C]。

圖2　miR-130b inhibitor下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)水平Fig.2　miR-130b inhibitor down-regulated miR-130b expressionNote: A.Relative expression of miR-130b in FHC and SW480 cells；B.miR-130b inhibitor down-regulated miR-130b expression in SW480 cells.

圖3　下調(diào)miR-130b抑制SW480細(xì)胞增殖能力Fig.3　Down-regulation of miR-130b inhibited SW480 cell proliferationNote: A.Down-regulation of miR-130b inhibited cell viability in SW480 cells (*.P<0.05)；B.Down-regulation of miR-130b inhibited DNA synthesis in SW480 cells (*.P<0.05).

圖4　下調(diào)miR-130b對(duì)SW480細(xì)胞凋亡能力的影響Fig.4　Down-regulation of miR-130b enhanced SW480 cell apoptosisNote: A.Down-regulation of miR-130b increased cell apoptosis in SW480 cells (*.P<0.05)；B:Down-regulation of miR-130b enhanced Caspase 3/7 activity in SW480 cells (*.P<0.05).

3討論

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，國(guó)最新癌癥5年生存率調(diào)查報(bào)告指出，結(jié)腸癌的5年生存率僅為47.2%[9]。目前，根治性手術(shù)及術(shù)后規(guī)范放、化療是治療結(jié)腸癌的主要方法[10]，但結(jié)腸癌早期診斷困難、易發(fā)生淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常使患者就診時(shí)已失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，對(duì)放化療敏感性的個(gè)體差異也是導(dǎo)致部分患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因。因而，尋找敏感而有效的結(jié)腸癌分子標(biāo)志物及生物治療靶點(diǎn)，成為提高結(jié)腸癌診療水平的重要方法之一。

結(jié)腸癌組織中存在大量microRNA異常表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11]。例如，miR-218在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)量均顯著降低，體外過(guò)表達(dá)miR-218可通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活而顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力[12]；而結(jié)腸癌組織中處于高表達(dá)狀態(tài)的miR-191能夠通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子—正CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/Enhancer binding protein beta，C/EBP β) 的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和對(duì)5-Fu的化療抵抗作用[13]。本課題通過(guò)研究證實(shí)，miR-130b在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，并且其高表達(dá)狀態(tài)與腫瘤體積增大及高TNM分期等惡性臨床病理特征密切相關(guān)。提示miR-130b在結(jié)腸癌生長(zhǎng)中具有重要的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-130b對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控作用，應(yīng)用人工合成的miR-130b抑制物在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中下調(diào)miR-130b的表達(dá)水平，通過(guò)CCK-8分析及BrdU結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)了下調(diào)miR-130b的表達(dá)能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞儀分析表明抑制miR-130b表達(dá)后，發(fā)生凋亡的腫瘤細(xì)胞比例顯著提高；同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)酶caspase3/7的活性也顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果一致表明，miR-130b對(duì)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。

作為一種重要的原癌性microRNA，miR-130b可通過(guò)下調(diào)腫瘤中多個(gè)抑癌基因的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮促腫瘤作用，如在肝細(xì)胞癌中下調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲[14]，在卵巢癌中下調(diào)多耐藥基因1(Multidrug resistance 1，MDR1)的轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)其對(duì)紫杉醇和順鉑耐藥[15]等。值得注意的是，在前列腺癌中，miR-130b卻呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，并且，在體外過(guò)表達(dá)miR-130b能夠通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix met allopeptidase 2，MMP2)來(lái)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移?？梢?jiàn)，miR-130b作為一種潛在的靶向治療分子，其組織特異性和多靶點(diǎn)性對(duì)腫瘤個(gè)體化治療提出了更高的要求。

總之，miR-130b在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤生長(zhǎng)等惡性臨床病理特征明顯相關(guān)，下調(diào)

結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。因而，miR-130b作為一種潛在的靶向治療分子在結(jié)腸癌的生物治療中具有重要臨床意義。

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[收稿2015-08-20修回2015-08-28]

(編輯許四平)

Expression and biological significance of microRNA-130b in human colonic carcinoma

YIMin,WANGRong,SHENTing-Ting.

TheFifthPeople′sHospitalofQinghaiProvince,Xining810007，China

[Abstract]Objective:To investigate the expression and biological significance of microRNA-130b in human colonic carcinoma(CRC).Methods: qRT-PCR was applied to detect the relative expression of miR-130b in 60 paired colonic carcinoma in comparison to the tumor adjacent tissues.Student-t test was used to analyze the relationship between the miR-130b expression and clinical features.We transfected the miR-130b inhibitor into SW480 cells,CCK-8 and BrdU incorporation assay were used to analyze cell proliferation,and flow cytometry and caspase3/7 activity assay were used to analyze cell apoptosis.Results: The relative expressions of miR-130b was significantly down-regulated in CRC tissues compared to those of the matched normal tumor-adjacent tissues(P<0.05).Low expression of miR-130b was significantly associated with large tumor size(≥5 cm,P<0.05) and advanced TNM stage(Ⅲ+Ⅳ,P<0.05).Overexpression of miR-130b in SW480 cells could significantly suppress cell proliferation and induce cell apoptosis(P<0.05).Conclusion: Low expression of miR-130b is related to the malignant clinicopathological features in CRC tissues,and miR-130b suppress colonic carcinoma growth and progression through inhibiting proliferation and enhancing apoptosis.

[Key words]MircoRNA-130b;Colonic carcinoma;Proliferation;Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.011

作者簡(jiǎn)介：易敏(1975年-)，女，病理科主任，主要從事消化道腫瘤、乳腺腫瘤及婦科腫瘤的研究，E-mail:yimin359@163.com。

中圖分類號(hào)R735.3+5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0652-05

①青海省第五人民醫(yī)院腫瘤三科,西寧810007。