丘桂華　張雪瑩　曹煥玲　趙亞偉　張紀(jì)巖

(廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧530021)

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Smad4基因條件性敲除對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響

丘桂華張雪瑩①曹煥玲②趙亞偉③張紀(jì)巖

(廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧530021)

[摘要]目的：探討特異性地在T細(xì)胞中敲除Smad4基因后，對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響。 方法：制備小鼠胸腺單細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記分子CD4、CD8、TCRβ、NK1.1、γδT CR和核因子Foxp3的表達(dá)情況。 結(jié)果：Smad4在T細(xì)胞中的缺失不影響CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+ SP、CD8+ SP、TCRβhi、NK1.1+ TCRβ-、NK1.1+ TCRβ+、CD8-γδT +、CD8+γδT+、CD4+Foxp3+ nTreg等細(xì)胞亞群在胸腺細(xì)胞中的比例與絕對(duì)數(shù)。 結(jié)論：Smad4基因在T細(xì)胞中的條件性敲除不影響T細(xì)胞的發(fā)育。

[關(guān)鍵詞]T細(xì)胞;Smad4;發(fā)育;小鼠

Smad家族蛋白是TGF-β/Smad信號(hào)通路將胞外信號(hào)傳遞至胞內(nèi)的一個(gè)重要家族蛋白，Smad家族蛋白包括Smad1至Smad8[1]。Smad4蛋白是其中之一，Smad4和Smad2、Smad3組成的三聚體介導(dǎo)了TGF-β I類受體的信號(hào)傳遞[2]。因而可以看出，Smad4在TGF-β信號(hào)通路中發(fā)揮了重要的作用。在T細(xì)胞中，TGF-β信號(hào)通路對(duì)其免疫功能發(fā)揮和維持起了重要的作用，部分機(jī)制在于影響nTreg的發(fā)育[3]，然而目前關(guān)于Smad4蛋白缺失對(duì)T細(xì)胞發(fā)育影響的研究卻很少。我們的研究主要的目的就是利用Smad4基因條件性缺失小鼠模型，探索Smad4對(duì)于T細(xì)胞發(fā)育的可能影響。鑒于Smad4完全敲除的小鼠由于外胚層形成的缺陷在胚胎早期就會(huì)死亡，我們引進(jìn)了利用Cre-loxP系統(tǒng)的Smad4條件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)，與Lck近端啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠配種繁殖，獲得Smad4基因T細(xì)胞條件性敲除的小鼠(Smad4Cre/Co/Co)，同窩同性別的Smad4Co/Co小鼠作為對(duì)照。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所使用的Smad4基因T細(xì)胞條件性敲除小鼠(Smad4Cre/Co/Co)和對(duì)照小鼠——Smad4條件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院八所楊曉教授提供。小鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF清潔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.1.2主要試劑動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)混合體系Taq 2×Mix購自TIANGEN公司；引物合成由北京諾賽基因公司完成；DNA電泳上樣緩沖液、DNA Marker (D2000 DNA Ladder) 購自北京索萊寶科技有限公司；透化液、固定液、各種熒光素標(biāo)記的抗CD4、CD8等抗體以及同型抗體購自eBioscience公司；破紅液、FACS洗液等為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配制；Actin抗體購于北京中杉金橋公司；Smad4抗體購于Cell Signaling Technology公司；凝膠電泳及轉(zhuǎn)印設(shè)備購于Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取基因組的提取說明參照試劑盒說明書。

1.2.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PCR引物由北京諾賽基因公司合成，引物序列見表1。

PCR反應(yīng)條件：94℃，1 min；68℃，80 s；72℃，30 s；94℃，2 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃,1 min；30 cycles；72℃，8 min；4℃，保存。

1.2.3Western分析取小鼠胸腺后研磨制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取106/樣，RIPA裂解液冰上裂解15 min后，4℃ 13 000 r/min，15 min，取上清并調(diào)整蛋白濃度，最后加入4×loading buffer。煮沸10 min使其徹底變性。然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)3 h至PVDF膜上，5%脫脂奶粉(TBST溶解)室溫封閉1 h，相應(yīng)條帶加入對(duì)應(yīng)的Smad4或者β-actin抗體，4℃過夜，山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h。最后在膜上涂ECL顯影及曝光。

1.2.4表面標(biāo)記分子染色及分析①取小鼠胸腺后研磨制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取106/樣，1 200 r/min 4 min；②取一定的FACS洗液(2% FBS，0.1% NaN3in PBS)重懸細(xì)胞，使染色的總體系為100 μl；③按照說明書要求每個(gè)樣品加入一定量的熒光標(biāo)記的表面標(biāo)記分子抗體或同型對(duì)照抗體，完成后混合均勻；④4℃避光放置30 min；⑤1 200 r/min 4 min離心去上清，加入FACS洗液1 ml/樣洗一遍，最后用200 μl的1%的多聚甲醛重懸后4℃放置或者立刻用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson FACSCalibu) 檢測(cè)分析。

1.2.5Foxp3染色及分析在收集細(xì)胞后用eBioscience公司fixation/permeabilization 試劑盒進(jìn)行破膜固定，然后加入PE標(biāo)記的Foxp3抗體，4℃避光放置30 min染色，洗滌后4℃放置或者立刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2結(jié)果

2.1敲除小鼠的基因型鑒定在Smad4Cre/Co/Co小鼠體內(nèi)如果Cre重組酶表達(dá)，將介導(dǎo)相同方向位于同一條染色體上的2個(gè)LoxP之間的基因重組，除去2個(gè)LoxP之間的外顯子8序列，在染色體上只保留1個(gè)LoxP位點(diǎn)，用引物Smad4-7，Smad4-10進(jìn)行擴(kuò)增可擴(kuò)增出包含一個(gè)LoxP位點(diǎn)和部分外顯子9基因的234 bp的DNA片段。我們提取了鼠尾組織的基因組DNA，用特異性引物進(jìn)行PCR的結(jié)果顯示：在Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中均可擴(kuò)出被Flox錨定的片段；而只有Smad4Cre/Co/Co小鼠可以擴(kuò)增出Lck-Cre片段，同時(shí)也能夠擴(kuò)增出被Cre酶敲除的234 bp DNA片段(圖1)。因此在DNA水平上，可以認(rèn)為我們引進(jìn)的小鼠模型正確。

圖1　Smad4Co/Co小鼠與Smad4Cre/Co/Co小鼠基因型鑒定Fig.1　Phenotype analysis of Smad4Co/Co mice and Smad4Cre/Co/Co mice

表1引物序列

Tab.1Primer sequence

GenotypePrimersequenceLengthLck-Cre5'-TGGGAGGCAGGAAGTGGGTAACTAGACTAA-3'420bp5'-GAAGATAATCGCGAACATCTTCAGG-3'AnchorbyfloxSmad4-95'-GGGCAGCGTAGCATATAAGA-3'WildtypeSmad4gene385bp;anchorbyloxPSmad4gene438bpSmad4-105'-GACCCAAACGTCACCTTCAC-3'DeletebyCreenzymeSmad4-75'-CCTTAGTTGAAGCTTATAACTTCG-3'Exon8ofSmad4gene,234bpSmad4-105'-GACCCAAACGTCACCTTCAC-3'

2.2敲除小鼠的Western鑒定Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺細(xì)胞Western分析顯示，在Smad4Co/Co小鼠的胸腺細(xì)胞中能夠檢測(cè)到Smad4蛋白表達(dá)，而在Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺細(xì)胞中，Smad4蛋白不表達(dá)(圖2)。所以在蛋白水平上，可以認(rèn)為我們引進(jìn)的小鼠模型正確。

2.3Smad4缺失對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響Lck近端啟動(dòng)子在T細(xì)胞發(fā)育的早期即雙陰性階段即開始發(fā)揮作用[4]，于是我們首先分析的Smad4缺失是否影響γδT細(xì)胞發(fā)育經(jīng)歷雙陰性階段、雙陽性階段和單陽性階段、TCRβ表達(dá)增強(qiáng)、nTreg生成的過程。為了防止繼發(fā)的炎癥反應(yīng)對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的可能影響，我們利用7天大新生小鼠進(jìn)行了分析，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，胸腺內(nèi)T細(xì)胞發(fā)育均已完成并且已經(jīng)生成nTreg[5]。我們對(duì)胸腺細(xì)胞進(jìn)行了CD4/CD8和CD4/Foxp3染色分析，發(fā)現(xiàn)Smad4缺失不影響CD4-CD8-DN(Co/Co:8.4%±1.5% vs Cre/Co/Co：9.5%±1.7%)、CD4+CD8+DP (Co/Co：76.9%±5.7% vs Cre/Co/Co：73.6%±5.7%)、CD4+SP(Co/Co:9.2%±3.6% vs Cre/Co/Co：10.3%±4.7%)、CD8+SP(Co/Co：5.5%±1.4% vs Cre/Co/Co：6.6%±0.9%)和CD4+Foxp3+ nTreg(Co/Co：0.36%±0.06% vs Cre/Co/Co：0.4%±0.07%)亞群的比例。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，以上細(xì)胞亞群比例在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異(圖3A、B)。我們還計(jì)算了上述細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中上述細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4A、B)。

圖2　Western分析小鼠胸腺細(xì)胞中Smad4蛋白表達(dá)水平Fig.2　Western analysis of Smad4 expression in thymocytes

圖3　 Smad4Co/Co與Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺各亞群細(xì)胞的比例(n=6)Fig.3　Subset percentages of Smad4Co/Co and Smad-4Cre/Co/Co thymocytes(n=6)Note: A.Representative data of CD4 and CD8 staining;B.Representa-tive data of CD4 and FoxP3 staining;C.Representative data of γδT CR and CD8 staining;D.Representative data of NK1.1 and TCRβ staining.

2.4Smad4缺失對(duì)其他在胸腺內(nèi)發(fā)育的淋巴細(xì)胞亞群的影響除了γδT細(xì)胞，部分γδT 細(xì)胞、NKT細(xì)胞和少量NK細(xì)胞的發(fā)育也在胸腺中完成，并且其發(fā)育的時(shí)間點(diǎn)在雙陰性階段之后[6-8]。因此，我們還對(duì)胸腺細(xì)胞進(jìn)行了NK1.1/ TCRβ、CD8/γδT CR染色分析，發(fā)現(xiàn)Smad4缺失不影響CD8-γδT+(Co/Co:0.6%±0.05% vs Cre/Co/Co:0.6%±0.02%)、CD8+γδT+(Co/Co:0.57%±0.25% vs Cre/Co/Co:0.55%±0.08%)、NK1.1+TCRβ-(Co/Co:1.6%±0.02% vs Cre/Co/Co:1.4%±0.3%)、NK1.1+TCRβ+(Co/Co:0.57%±0.028% vs Cre/Co/Co:0.41%±0.16%)亞群的比例。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，以上細(xì)胞亞群比例在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異(圖3C、D)。 我們還計(jì)算了上述細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)， 發(fā)現(xiàn)Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中上述細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4C、D)。

圖4　Smad4Co/Co與 Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺各亞群細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)(n=6)Fig.4　Total number of thymocytes subsets in Smad4Co/Co and Smad4Cre/Co/Co mice respectively(n=6)Note: A.Total number of CD4+ SP,DP,DN,CD8+ SP thymocytes and its P value；B.Total number of CD4+FoxP3+ (nTreg) thymocytes and its P value.C.Total number of γδT+CD8- and γδT+CD8+ thymocytes and its P value.D.Total number of NK1.1+ TCRβ- and NK1.1+TCRβ+ thymocytes and its P value.

3討論

Smad4是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要分子，Smad4和Smad2、Smad3共同介導(dǎo)TGF-β I類受體的信號(hào)傳遞。研究表明TGF-β在細(xì)胞分化、增殖、免疫抑制等諸多方面發(fā)揮了重要作用[3,9,10]。TGF-β能夠通過促進(jìn)Foxp3的表達(dá)從而促進(jìn)Treg的發(fā)育[3]。Smad4與TGF-β信號(hào)通路的關(guān)系密切，我們推測(cè)Smad4蛋白可能在這些免疫細(xì)胞的發(fā)育成熟過程也起著同樣的作用。通過對(duì)一系列的表面分子的流式分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Smad4在T細(xì)胞中的條件性缺失對(duì)CD4、CD8和Treg細(xì)胞的發(fā)育并無顯著影響，并且也不影響其他在胸腺中發(fā)育的淋巴細(xì)胞亞群。我們的結(jié)果說明，TGF-β對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育的影響不依賴于Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

有研究者發(fā)現(xiàn)[11]，TGF-β介導(dǎo)T細(xì)胞的功能并不完全依賴于Smad家族蛋白，也存在著獨(dú)立于Smad蛋白的途徑，這些途徑包括MAPKs，Rho-like GTPases或PI3K[12]。我們以前的發(fā)現(xiàn)提示MAPKs家族成員可能對(duì)Foxp3表達(dá)有重要影響[13]，可能MAPKs途徑通過JNK或ERK對(duì)Foxp3表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響Treg細(xì)胞的發(fā)育。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)[14,15]，降低活性的Akt促進(jìn)了Treg細(xì)胞的發(fā)育，過表達(dá)的Akt抑制了Treg的發(fā)育，因而，Treg細(xì)胞的發(fā)育不是通過PI3K信號(hào)途徑。那么會(huì)是通過Rho-like GTPases的途徑嗎？目前并沒有關(guān)于這方面的報(bào)道，所以暫時(shí)無法判斷這一通路在TGF-β誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)中的作用。

4致謝

感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所楊曉研究員和蘭雨研究員提供的小鼠，同時(shí)感謝本實(shí)驗(yàn)室其他同事給予的幫助與指導(dǎo)。

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[收稿2015-09-25修回2015-11-17]

(編輯許四平)

Effects of conditional deletion ofSmad4 gene on T cell development

QIUGui-Hua,ZHANGXue-Ying,CAOHuan-Ling,ZHAOYa-Wei,ZHANGJi-Yan.

GuanxiMedicalVniversityGraduateSchool，Nanning530021，China

[Abstract]Objective:To study the role of Smad4 in T cell development.Methods: Single cell suspension of thymus was prepared and the expression of CD4，CD8，TCRβ，NK1.1，γδT CR and nuclear factor Foxp3 was examined by flow cytometry.Results: The percentages and absolute numbers of CD4-CD8-，CD4+CD8+，CD4+ SP，CD8+ SP，TCRβhi，NK1.1+TCRβ-，NK1.1+TCRβ+，CD8-γδT+，CD8+γδT+ CD4+Foxp3+ nTreg subsets remained unchanged in the absence of Smad4.Conclusion: Conditional deletion of the Smad4 gene does not affect T cell development.

[Key words]T cells;Smad4;Development;Mice

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.008

作者簡介：丘桂華(1989年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方向的研究，E-mail:ghqiu09@163.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：張紀(jì)巖(1972年-)，女，博士，研究員，主要從事免疫炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方向的研究，E-mail:jiyanzhang@hotmail.com。

中圖分類號(hào)R392.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0640-04

①軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京100850。

②河南大學(xué)研究生學(xué)院，鄭州475001。

③河南省漯河市中心醫(yī)院風(fēng)濕科，漯河462000。