余紅梅　楊　娟　周向東　肖　謙　呂　洋　夏　麗

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶400016)

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縫隙連接蛋白Cx43介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的氣道上皮結(jié)構(gòu)受損①

余紅梅楊娟②周向東③肖謙呂洋夏麗

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶400016)

[摘要]目的：探討縫隙連接蛋白(Connexin43，Cx43)在高糖(High glucose，HG)誘導(dǎo)氣道上皮結(jié)構(gòu)受損的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：構(gòu)建突變的Cx43磷酸化載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU，轉(zhuǎn)染正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，給予高糖刺激，Western blot 法、Real-time PCR 法測定Cx43的蛋白及mRNA 水平，Western blot法測定緊密連接蛋白(Zonula occludens-1， ZO-1)及黏附連接蛋白(E-cadherin)的表達(dá)，激光共聚焦檢測ZO-1的表達(dá)及定位。結(jié)果：與對照組相比，HG刺激后Cx43 mRNA 表達(dá)及蛋白含量均降低，ZO-1及E-cadherin的表達(dá)亦明顯降低，均低于對照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染Cx43磷酸化突變載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1 -Cx43368-MU 的細(xì)胞經(jīng)HG刺激后，Cx43表達(dá)明顯增強(qiáng)，顯著高于單純HG組(P<0.05)，同時(shí)伴隨ZO-1及E-cadherin的表達(dá)的增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論：縫隙連接蛋白Cx43參與了HG誘導(dǎo)的氣道上皮結(jié)構(gòu)受損，是氣道上皮機(jī)械防御屏障的重要調(diào)控分子。

[關(guān)鍵詞]縫隙連接蛋白43；高糖；氣道上皮；受損

肺部感染是糖尿病患者的常見并發(fā)癥，且為常見致死病因。糖尿病患者易致結(jié)核菌感染以及各類病毒、細(xì)菌等所致的肺部炎癥，而慢性阻塞性肺部疾病患者并發(fā)糖尿病時(shí)其急性加重的發(fā)生率與機(jī)體長期高血糖狀態(tài)有著密切相關(guān)性[1,2]。氣道上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)的完整性是氣道防御屏障的關(guān)鍵，因上皮細(xì)胞是維持黏膜表面微環(huán)境穩(wěn)定的核心，一旦上皮完整性破壞，氣道黏膜表面有序的微環(huán)境也不復(fù)存在，氣道機(jī)械防御屏障結(jié)構(gòu)性和功能性破壞，從而導(dǎo)致氣道炎癥或感染的發(fā)生。Cx43是Cx家族最主要的成員，在氣道上皮細(xì)胞、肺泡Ⅰ型及Ⅱ型細(xì)胞、肺內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等均有大量表達(dá)[3]。高血糖可能引起Cx43的高磷酸化及表達(dá)量的變化，致晶狀體上皮細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞間有序組織及結(jié)構(gòu)的完整性受損或消失及各靶器官功能障礙[4]。故此推測，Cx43是否與氣道上皮結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)? 是否參與高糖致其受損的過程? 本研究以高糖(High glucose，HG)作為刺激因素，探討Cx43在高糖致氣道上皮結(jié)構(gòu)受損中的作用，以期明確高糖致氣道炎性反應(yīng)的潛在機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料人氣道上皮16HBE 細(xì)胞株(上海復(fù)祥生物科技有限公司)；pEGFP-N1 空載體(Clontech 公司)；DEME/Ham′s F12 培養(yǎng)基、HEPES、Trizol 和小牛血清(Sigma 公司)；兔抗ZO-1、兔抗Cx43、兔抗E-cadherin(美國Abcam公司)；轉(zhuǎn)染試劑FuGENE 6(瑞士Roche公司)；HRP-羊抗兔抗體(Santa Cruz 公司)；其余產(chǎn)品為國產(chǎn)試劑。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定構(gòu)建人Cx43重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Cx43，以該重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變型PCR擴(kuò)增引物，構(gòu)建磷酸化位點(diǎn)突變基因表達(dá)載體，獲得突變的Cx43載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU(分別作用于Cx43的S279、S365及S368等絲氨酸位點(diǎn)，突變載體模擬被遏制磷酸化的Cx43)。提取純化各組質(zhì)粒，分別以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及BamHⅠ加入反應(yīng)體系進(jìn)行酶切。用T4 DNA連接酶將回收片段連接過夜，后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化過程設(shè)置陰性及陽性對照組，將轉(zhuǎn)化平板置于37℃過夜孵育，挑選陽性克隆，加入液體培養(yǎng)基及卡那霉素?fù)u菌。12 h后提取質(zhì)粒酶切鑒定分析。

1.2.2轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，待細(xì)胞匯合至90%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟按FuGENE 6說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染設(shè)空白對照組、空質(zhì)粒組及重組質(zhì)粒組。轉(zhuǎn)染后24～48 h在熒光顯微鏡下觀察熒光，以此鑒定轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3細(xì)胞分組于6孔板中培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)換液，待細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)傳代，將細(xì)胞分為6組，每組3個(gè)復(fù)孔：①對照組：在無胎牛血清無雙抗的DEME/Ham′s F12 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；②HG刺激組：無血清培養(yǎng)液中加入終濃度為30 mmol/L的HG；③HG+pEGFP-N1-Cx43279-MU組：進(jìn)行pEGFP-N1-Cx43279-MU轉(zhuǎn)染，同時(shí)給予終濃度30 mmol/L的HG刺激；④HG+pEGFP-N1-Cx43365-MU組：進(jìn)行pEGFP-N1-Cx43365-MU轉(zhuǎn)染，同時(shí)給予終濃度30 mmol/L的HG刺激；⑤HG+ pEGFP-N1-Cx43368-MU組：進(jìn)行pEGFP-N1-Cx43368-MU轉(zhuǎn)染，同時(shí)給予終濃度30 mmol/L的HG刺激；⑥pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組：進(jìn)行pEGFP-N1轉(zhuǎn)染，但不給予刺激。繼續(xù)培養(yǎng)后分別收集上清和細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.4四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組細(xì)胞的活力96 孔板中每孔按濃度1 ×104個(gè)/ml加入200 μl細(xì)胞懸液，每組各6 個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2濕度培養(yǎng)箱孵育，分別取10、20、30 和60 min 時(shí)間點(diǎn)行MTT 測定。自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀以570 nm 波長測定各孔吸光度(A)值。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time)法檢測Cx43 mRNA水平Trizol 法分別提取各組細(xì)胞內(nèi)總RNA，經(jīng)鑒定，樣品A260/A280比值均介于1.8 ～2.0，初步定量后保存于-20℃?zhèn)溆谩刹椒ㄐ蠷T-PCR。cDNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。Cx43上游引物:5′-TTCAAGGGCGTTAAGGAT-3′，下游引物:5′-CCAGGAGGAGACAT-AGGC-3′。GAPDH 上游引物:5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。反應(yīng)參數(shù):94℃ 預(yù)變性3 min，后緊隨35 個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)：94℃ 45 s，58℃ 30 s，70℃ 60 s，后72℃延伸5 min采用2-△△CT方法分析目的基因mRNA 相對表達(dá)量。CT 是熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，△△Ct=(CT目的基因-CT 管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT管家基因)對照組。

1.2.6Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)各氣道上皮結(jié)構(gòu)蛋白的相對含量棄培養(yǎng)液后加入細(xì)胞裂解液，冰浴20 min，4℃ 12 000 r/ min離心15 min，測定蛋白濃度。取各組細(xì)胞蛋白10 g經(jīng)含15%的SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛乳封閉1 h，加入兔抗ZO-1、兔抗Cx43、兔抗E-cadherin(1∶1 000)孵育2 h，再用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10 000)孵育2 h。洗膜后經(jīng)ECL顯色，暗室曝光2 min。結(jié)果以與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物條帶的密度面積積分比值作為Cx43、ZO-1及E-cadherin蛋白的相對含量。

1.2.7激光共聚焦掃描顯微鏡觀察ZO-1蛋白的胞內(nèi)表達(dá)吸棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，0.3%的Triton-100透化處理20 min，加入羊血清室溫下封閉30 min，去血清，加兔抗ZO-1單克隆抗體1∶200，置濕盒內(nèi)4℃過夜，再加二抗(FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG 1∶50)，置濕盒內(nèi)室溫下2 h，50%的甘油封片，顯微鏡下觀察，成像并行圖像分析。

2結(jié)果

2.1各Cx43磷酸化位點(diǎn)突變基因表達(dá)載體的酶切鑒定及轉(zhuǎn)染各重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU經(jīng)EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定構(gòu)建成功(圖1)，符合預(yù)期目標(biāo)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞36 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察，質(zhì)粒發(fā)出較強(qiáng)綠色熒光，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功(圖2)。

2.2各組中細(xì)胞增殖的變化各處理因素對細(xì)胞的增殖活力無明顯影響(表1)。

圖1　Cx43磷酸化突變體酶切電泳圖Fig.1　Restriction enzyme identification of recombin-ant constructsNote: 1.pEGFP-N1；2.pEGFP-N1-Cx43279-MU；3.pEGFP-N1-Cx43365-MU；4.pEGFP-N1-Cx43368-MU.

圖2　Cx43磷酸化突變體轉(zhuǎn)染圖(×200)Fig.2　Transfection of recombinant constructs(× 200)Note: A.pEGFP-N1；B.pEGFP-N1-Cx43279-MU；C.pEGFP-N1-Cx43365-MU；D.pEGFP-N1-Cx43368-MU.

2.3不同磷酸化突變載體對高糖刺激的氣道上皮Cx43表達(dá)水平的影響HG刺激可明顯降低氣道上皮Cx43的mRNA及蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU后再予以HG刺激，Cx43的mRNA及蛋白的表達(dá)水平較前明顯增加(P<0.05，圖3、5)。而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1對Cx43基因及蛋白水平無明顯影響(P>0.05)。

圖3　HG及轉(zhuǎn)染Cx43突變載體對Cx43 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3　Effects of HG and recombinant constructs on Cx43 mRNA expressionNote: *.P<0.05，compared with control group；#.P<0.05,compared with HG group；1.pEGFP-N1-Cx43279-MU；2.pEGFP-N1-Cx43365-MU；3.pEGFP-N1-Cx43368-MU；4.pEGFP-N1.

圖4　免疫熒光檢測各組ZO-1蛋白的表達(dá)(× 800)Fig.4　Expression of ZO-1 protein detected by immunofluorescence(× 800)Note: A.Control；B.HG；C.HG+pEGFP-N1-Cx43279-MU；D.HG+pEGFP-N1-Cx43365-MU；E.pEGFP-N1-Cx43368-MU.

Groups10min20min30min60minControl0.152±0.0080.175±0.0130.352±0.0140.379±0.011HG0.142±0.0100.165±0.0090.323±0.0090.356±0.015HG+pEGFP-N1-Cx43279-MU0.148±0.0070.172±0.0110.401±0.0110.421±0.0HG+pEGFP-N1-Cx43365-MU0.139±0.0090.159±0.0120.415±0.0120.409±0.017HG+pEGFP-N1-Cx43368-MU0.150±0.0110.181±0.0130.423±0.0130.411±0.012pEGFP-N10.143±0.0120.174±0.0100.394±0.0100.401±0.009

圖5　HG及轉(zhuǎn)染Cx43突變載體對氣道上皮各結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5　Effects of HG and recombinant constructs on protein expressions of Cx43,ZO-1 and E-cadherinNote: *.P<0.05，compared with control group；#.P<0.05,compared with HG group；1.pEGFP-N1-Cx43279-MU；2.pEGFP-N1-Cx43365-MU；3.pEGFP-N1-Cx43368-MU；4.pEGFP-N1.

2.4不同磷酸化突變載體對高糖刺激ZO-1、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響HG刺激后 ZO-1及E-cadherin的表達(dá)較對照組明顯降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染Cx43磷酸化突變體后pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU可抑制高糖對上述蛋白表達(dá)的作用(P<0.05，圖4、5)。

3討論

氣道上皮細(xì)胞之間的連接方式有三種：緊密連接、粘附連接和縫隙連接。緊密連接位于上皮細(xì)胞頂端，主要由Zonula occludens-1(ZO-1)等蛋白構(gòu)成。粘附連接位于緊密連接基面，與肌動(dòng)蛋白及粗肌絲共同支撐并調(diào)控細(xì)胞形態(tài)，包括E-cadherin及(α,β)-catenin 。縫隙連接(Gapjunction， GJ)是直接連接相鄰細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞間通道，介導(dǎo)縫隙連接細(xì)胞間通訊(Gapjunction intercellular communication，GJIC)，由連接蛋白(Connexins，Cxs)構(gòu)成，連接蛋白根據(jù)其分子量命名，如Cx43[5]。在氣道上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整的基礎(chǔ)上，氣道運(yùn)行其有效的粘液纖毛清除功能，即能有效維護(hù)氣道機(jī)械防御機(jī)能以抵御各種外界刺激特別是病原菌的侵入。正常氣道分泌物中葡萄糖濃度約為血漿中濃度的1/10，而在高血糖狀態(tài)下氣道分泌物中的葡萄糖濃度急劇上升，氣道分泌物的正常穩(wěn)態(tài)被打破。因此，高血糖狀態(tài)可致氣道局部葡萄糖濃度的改變，引起氣道一系列病理生理變化致正常氣道防御屏障受損，由此易引起外界刺激物特別是病原菌的侵入。本研究結(jié)果顯示，高糖刺激可降低氣道上皮細(xì)胞各連接蛋白Cx43、ZO-1及E-cadherin的表達(dá)水平，使正常氣道上皮結(jié)構(gòu)受損，故而使氣道易于受到病原菌入侵。那么高血糖如何破壞氣道上皮結(jié)構(gòu)？參與其中的靶點(diǎn)分子是什么？

Cx43是Cx家族最主要的成員，在氣道上皮細(xì)胞、肺泡Ⅰ型及Ⅱ型細(xì)胞、肺內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等均有大量表達(dá)。近些年在對高血糖致全身各系統(tǒng)靶器官損害的大量研究中發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白Cx43起著重要的介導(dǎo)作用[4,6]。從Cx43基因敲除小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，其晶狀體上皮細(xì)胞間的特征性連接及有序排列消失，致細(xì)胞間有序組織及結(jié)構(gòu)的完整性受損或消失。在對糖尿病視網(wǎng)膜病變及血管病變的研究中發(fā)現(xiàn)，高血糖可致Cx43的高磷酸化及降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的紊亂致血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂致血管損害，破壞心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)致功能障礙。Cx43的主要功能調(diào)節(jié)位點(diǎn)為位于其C端的S279、S365及S368等絲氨酸磷酸化位點(diǎn)[7]。本研究顯示，高糖刺激可降低Cx43的表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染突變的Cx43磷酸化載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU到正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE后，再給予高糖刺激，細(xì)胞中Cx43的表達(dá)明顯增加。表明在高糖致氣道上皮結(jié)構(gòu)受損過程中，Cx43的磷酸化可影響Cx43在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

在對氣道上皮縫隙連接蛋白的大量研究中發(fā)現(xiàn)，連接蛋白可與緊密連接、黏附連接及細(xì)胞骨架蛋白等結(jié)構(gòu)發(fā)生作用以維護(hù)氣道上皮結(jié)構(gòu)的完整性。研究發(fā)現(xiàn)，連接蛋白Cx43可參與維護(hù)氣道上皮結(jié)構(gòu)的完整性[8]。Cx43的C端可與ZO-1的PDZ2位點(diǎn)結(jié)合定位于氣道上皮細(xì)胞胞膜，Cx43的突變體及高磷酸化則使其與ZO-1結(jié)合減少，致縫隙連接通道正常結(jié)構(gòu)的改變及氣道上皮細(xì)胞膜ZO-1的減少[9]。免疫電鏡分析顯示連接蛋白Cxs、E-cadherin及catenin共沉淀于縫隙連接形成過程中細(xì)胞間的相互作用點(diǎn)上[10]。本研究結(jié)果顯示，高糖刺激可降低ZO-1及E-cadherin的表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染突變的Cx43磷酸化載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-

Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU到正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE后使ZO-1及E-cadherin表達(dá)明顯增加。說明在高糖刺激氣道上皮細(xì)胞以后，Cx43的磷酸化可引起緊密連接及粘附連接蛋白表達(dá)量的降低，致氣道上皮結(jié)構(gòu)受損。

本研究初步確認(rèn)了縫隙連接蛋白Cx43在高血糖致氣道上皮結(jié)構(gòu)受損中的關(guān)鍵靶點(diǎn)作用，為臨床治療糖尿病患者肺部感染提供了新的思路。

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[收稿2016-02-19修回2016-04-07]

(編輯許四平)

High glucose impaired airway epithelium regulated by connexin43

YUHong-Mei,YANGJuan,ZHOUXiang-Dong,XIAOQian,LüYang,XIALi.

DepartmentofGeriatrics,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

[Abstract]Objective:To explore the mechanism of connexin43(Cx43)in regulating impaired airway epithelium induced by high glucose.Methods: pEGFP-N1-Cx43279-MU，pEGFP-N1-Cx43365-MU and pEGFP-N1-Cx43368-MU were constructed and transfected into 16HBE cells.Cells were stimulated by high glucose(HG).The levels of Cx43 protein and mRNA were detected by Western blot and real-time PCR respectively.The protein levels of ZO-1 and E-cadherin were detected by Western blot and immunofluorescence.Results: Compared with the control group,there was an obvious decrease of Cx43,ZO-1 and E-cadherin in cells exposed to HG.Compared with the single HG group,the levels of Cx43,ZO-1 and E-cadherin were increased in the cells transfected with pEGFP-N1-Cx43279-MU,pEGFP-N1-Cx43365-MU and pEGFP-N1-Cx43368-MU.Conclusion: Cx43 regultes airway epithelum impared by HG,and it is a critical factor regulating airway epithelial integrity.

[Key words]Connexin43;High glucose;Airway epithelium;Impaired

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.003

作者簡介：余紅梅(1982年-)，女，博士，主治醫(yī)師，講師，主要從事氣道炎癥性疾病的防控研究，E-mail：yhm920@126.com。

中圖分類號R563

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0620-05

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200005)、重慶市科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2015jcsf10001-01-04)、國家臨床重點(diǎn)?？评夏瓴W(xué)建設(shè)項(xiàng)目(國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2013〕544號)。

②重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010。

③海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?70102。