張　芬

(同濟大學 生命科學與技術學院 上海 200092)

?

MicroRNA-124a對SCI繼發(fā)性損傷的影響及相關機制研究

張芬

(同濟大學 生命科學與技術學院 上海 200092)

摘要：探究microRNA-124a(miR-124a)對脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)繼發(fā)性損傷的影響及相關機制.取90只健康成年Wistar大鼠建立SCI模型，隨機分為3組，第1組術后僅注射生理鹽水，為未治療組；第2組術后注射骨髓基質細胞源神經干細胞(BMSCs-D-NSCs)治療，為正常移植組；第3組術后注射攜帶miR-124a的骨髓基質細胞源神經干細胞(miR-124a-BMSCs-D-NSCs)，為轉染移植組.另選取60只健康成年Wistar大鼠作為對照組，僅給予假手術處理.采用HE染色觀察大鼠的組織形態(tài)學變化，采用實時熒光定量PCR技術檢測大鼠的miR-124a表達情況，并對損傷灶進行顯微測量計算，比較脊髓功能恢復的BBB評分情況及脊髓組織損傷大小的情況.結果顯示，SCI后，脊髓組織中miR-124a基因表達顯著降低，脊髓神經功能也明顯降低，miR-124a-BMSCs-D-NSCs能夠有效地改善SCI，減少脊髓損傷組織范圍及體積，還能改善中樞神經的功能.

關鍵詞：microRNA-124a； 脊髓損傷； 神經功能； 作用機制

0引言

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經系統(tǒng)的一種嚴重創(chuàng)傷，也是一種危害較大的急性病損.脊髓損傷后，其損傷部位節(jié)段以下的感覺和運動功能將出現明顯的障礙，甚至發(fā)生永久性喪失，發(fā)達國家的發(fā)病率為13.3～45.9萬人/年.2012年的統(tǒng)計結果顯示我國SCI患者約為100萬人，且正于每年1萬人的速率增長，故臨床上應對SCI引起足夠的重視[1].SCI后脊髓難以進行組織修復，且功能重建也較為困難，這不僅與神經元微弱的再生能力密切相關，還與脊髓損傷后快速出現的阻礙軸突再生的膠質疤痕有關.因此，對SCI治療的關鍵在于恢復和重建神經功能，這也成為目前一直困擾醫(yī)學界的核心問題[2].最近20年來，臨床上新發(fā)現了一種基因表達調節(jié)因子，即microRNAs(miRNAs).這一調節(jié)因子可廣泛表達于多種組織中，作為一種內源性的小分子非編碼RNA,對3′端非編碼區(qū)的保守性極高，可在轉錄、翻譯水平上對基因表達起到很好的調控作用[3].MicroRNA是內源的單鏈非編碼RNA(18～25個核苷酸)，在轉錄后水平上負調控基因表達[4—5].自從1993年第一個miRNA(line4)的發(fā)現，在生物體中，數千的miRNAs已經被發(fā)現.miRNAs具有組織特異功能，能夠總體調控基因的表達，且可調控的人類蛋白編碼基因較多，至少有20%～30%的編碼基因可被調控[1]，miRNAs在哺乳動物中樞神經系統(tǒng)內表達的種類更多、含量更高，呈高表達.近年來，多數學者[6—9]對中樞神經系統(tǒng)疾病如創(chuàng)傷性腦損傷、SCI、腦卒中等的大量基因芯片實驗研究發(fā)現，miRNAs能夠有效地調控細胞的生長、分化、增殖[10]和凋亡過程，從而調節(jié)脊髓損傷、脊髓可塑性及脊髓損傷后的病理改變.miRNAs 包含的種類較多，如miRNA-9、 miRNA-21、miRNA-124、miRNA-155等，其中神經系統(tǒng)特異性表達最為富含的是microRNA-124a(miR-124a)，即miRNA-124的一種亞型.在細胞的增殖和分化過程中，miR-124a的表達水平可發(fā)生較大的變化[11—14].目前，學者對中樞神經中miRNA-124表達情況的研究多集中在果蠅、小鼠的中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)和人類相關組織中，較為局限，盡管在大鼠動物中的研究尚較少[15]，但大鼠更適宜建立SCI模型.miR-124a作為神經系統(tǒng)特異的microRNA，能夠對神經元的細胞周圍、細胞分化及脊髓發(fā)育等一系列重要生理活動起到很好的調控作用，但尚未明了miR-124調控神經系統(tǒng)病理損傷的機制.有研究發(fā)現，miR-124a是miRNAs中的一種能夠作為脊髓損傷的有效干預性治療靶點，但多數學者的報道尚存在一定的爭議[16]，本文進一步探究了miR-124a對SCI繼發(fā)性損傷的影響及相關機制.

1材料與方法

1.1研究對象

選取140只正常成年雄性Wistar大鼠，大鼠體重在190～250 g之間，平均體重為(227.2±8.2)g，其中80只大鼠經改良Allen’s法建立SCI模型，另60只大鼠給予假手術處理，分別為觀察組和對照組.

選取10只4周齡雄性Wistar大鼠，用于提取骨髓間充質干細胞(bone marrow stroma cells， BMSCs).

1.2實驗儀器及試劑

儀器：臺式高速低溫離心機(Eppendorf公司)、Milli-Q 純水儀(Milipore公司)、凝膠成像系統(tǒng)(YNGENE公司)、Bio-Rad C1000 實時 PCR 儀(Bio-Rad公司)、M651型手術顯微鏡(Leica公司).

試劑:TRIZOL Reagent (Invitrogen公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙錠(EB)(Sigma公司)、NcodeTMVILOTMmiRNA cDNA Synthesis Kit(Invitrogen公司)、SYBR? Premix Ex TaqTMII Kit(Takara 公司)、以及氯仿、異丙醇、無水乙醇(均為上海生工生物工程有限公司).

實時熒光定量qRT-PCR的引物：英濰捷基有限公司.

1.3實驗方法

1.3.1大鼠SCI模型的構建根據改良Allen’s制作大鼠脊髓夾傷動物模型，模型構建過程如下：先采取10%水合氯醛(3 mL/kg)對大鼠進行腹腔內注射麻醉，麻醉完成且效果滿意后，將大鼠取俯臥位置于手術臺上，四肢遠端用皮繩固定于臺上，并采用軟墊將胸部墊高.定位手術切口位置，以T10棘突作為切口中心，以中心為起點沿脊柱向兩側切開背側的皮膚及肌肉，并分離開，使脊柱T8節(jié)段清晰地暴露出來.在顯微鏡下，手術去除T8脊椎的椎板，再將特制的鑷子沿椎板腹側深入兩側的脊髓，并夾住脊髓，持續(xù)20 s后松開并取出鑷子，將肌肉、皮膚逐層進行縫合，術后人工輔助SCI大鼠排尿.

1.3.2干細胞的制備及移植從大鼠骨髓提取BMSCs[17],收集培養(yǎng)并純化第3代BMSCs[18].經流式細胞儀檢測，75%的BMSCs處于G1期，以1×108細胞/L的密度進行接種，通過MTT實驗鑒定符合干細胞的增殖規(guī)律，通過細胞免疫化學的方法對細胞表面抗原表型的CD34和CD44進行鑒定[19]，結果顯示CD34為陰性，而CD44為陽性，進而證實了分離的細胞為BMSCs，可開展下一步的實驗.隨后加入生物誘導培養(yǎng)液[20—22]，模擬人體內環(huán)境，誘導9 d[23]，促使上述分離純化的BMSCs向神經細胞方向分化，同樣采用細胞免疫化學的方法檢測顯示對膠質纖維酸性蛋白陰性，神經絲蛋白和神經元特異性烯醇化酶陽性，細胞具有神經細胞活性，即得到BMSCs-D-NSCs.

通過查詢基因庫，合成引物前鏈和反義鏈引物，擴增Rno-miR-124a，使用相同的限制性內切酶來酶切PCR產物和慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP.得到酶切產物后，使用T4連接酶在16 ℃連接酶切片段.使用感受態(tài)細胞體外進行轉化，挑取克隆，進行質粒小提，并測序鑒定.轉染前培養(yǎng)293T細胞[24]，使其密度達到85%左右.使用磷酸鈣轉染法將構建好的質粒轉入293T細胞中，進一步進行病毒制備得到含有miR-124a的病毒液.對病毒液體進行離心濃縮，密度達到1.5×107pfu/mL左右，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下，用病毒液轉染36小時后，在相同條件下，更換新鮮培養(yǎng)液，轉染36 h,檢測轉染率(顯微鏡中綠色熒光蛋白細胞的比例)達到85%.獲取病毒上清液感染BMSCs，并利用qRT-PCR測定miR-124a轉染BMSCs后及誘導成NSCs后的表達情況.結果顯示miR-124a的表達量、轉染后BMSCs的表達量是轉染前的29-fold.并進一步觀察BMSCs-D-NSCs分化為神經元與膠質細胞的情況，其中 BMSCs-D-NSCs組的神經元的分化比例為(31.4±3.53)%，膠質細胞比例為(49.9±3.03)%；miR-124a-BMSCs-D-NSCs組的神經元分化比例為(51.5±3.81)%，膠質細胞的分化比例為(40.1±1.88)%.

將SCI模型大鼠分為3組，分別為未治療組、BMSCs-D-NSCs組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs組.在SCI大鼠模型制備后的第7天，將BMSCs-D-NSCs和miR-124a-BMSCs-D-NSCs液進行離心，使用1 mL的注射器抽取懸浮液，從而制備成為細胞懸液(1×106細胞/mL)，兩種懸液分別經鼠尾靜脈注射給BMSCs-D-NSCs移植組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs移植組，未治療組注射生理鹽水1 mL.

1.3.3取材用于RT-PCR的檢測的取材方法如下：在原手術切口上切開皮膚，使脊髓階段暴露出來，截取SCI大鼠模型損傷區(qū)段的新鮮脊髓組織，對照組大鼠取相同脊髓區(qū)段的新鮮脊髓組織，將從兩組大鼠中取出的脊髓組織置于冰上，并剝離脊髓表面的硬脊膜及剔除脊髓中的血管，完成后立即放入液氮罐內保存，并轉移至冰箱(-80 ℃).用于制備石蠟切片進行原位雜交實驗的取材參考文獻[25]的研究，采用4%多聚甲醛灌注取材的方法.

1.3.4標本組織病理學檢測對脊髓組織進行蘇木素-伊紅(HE)染色，染色過程依次經過：脫蠟-蘇木素染色5 min-鹽酸乙醇分化30 s-自來水浸泡1 min-伊紅液染色2 min-固定封片，最后在顯微鏡下對脊髓組織及細胞情況進行觀察.

1.3.5RT-PCR檢測miR-124a及計算方法嚴格按照試劑盒說明書上的操作提取microRNA.隨后以此為模板進行RT-PCR對miR-124a的測定.實驗中使用Takara 公司的SYBR? Premix Ex TaqTMII Kit，以U6 snRNA為內參對照基因，引物序列由英濰捷基有限公司合成.引物序列如下：U6 snRNA引物信息英濰捷基公司對此保有解釋權，miR-124a的引物信息為：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC.

miR-124a的相對表達量的計算方法是使用相對定量法：2-△△Ct用于表示miR-124a在脊髓的損傷組織的表達量和正常脊髓組織中表達量的倍數.△△Ct=損傷脊髓組織(CtmiR-124a-CtU6 snRNA)-正常脊髓組織(CtmiR-124a-CtU6 snRNA).

1.3.6原位雜交技術檢測miR-124a采用原位雜交技術檢測miR-124a的表達情況.先處理石蠟切片，再進行預雜交、雜交，雜交操作如下：先用2×SSC 沖洗切片15 min，再加入4×SSC/50%去離子甲酰胺，在37 ℃下進行15 min的孵育，將50 μL的預雜交液加入每張切片中并放入濕盒內，于42 ℃下進行2 h 孵育；將每張片中的預雜交液去除，加入50 μL的雜交液并放濕盒中，于42 ℃下雜交12～18 h.雜交完畢后，用2×SSC洗滌約1～2 min，然后加入2×SSC/50%去離子甲酰胺，并于42 ℃下孵育10 min；再加入1×SSC/50%去離子甲酰胺，于37 ℃下孵育30 min；緊接著加入 4×SSC/10 mmol DTT，1 h后再加入 0.1×SSC 40 ℃，放置30 min，連續(xù)加入兩次.

其中miR-124a的探針序列為：G+GCA+TAC+A+C+CG+CGT+GCC+TTAA-DIG( “+”表示經過LNA的修飾；DIG表示地高辛，用于標記探針.)

1.4BBB評分法

根據BBB (Basso-Beattie-Bresnahan score, BBB)評分法[26]標準判斷SCI損傷大鼠和正常大鼠術后不同時相的脊髓神經功能情況.檢測并計算術后各個時相SCI損傷大鼠和正常大鼠脊髓中miR-124a的相對表達量，再對SCI大鼠中未治療組、正常移植組和轉染移植組3組大鼠術后不同時相的神經功能BBB評分結果.

1.5統(tǒng)計學分析

本文中所有數據都是采用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0來進行分析的，用均數±標準差的形式來表示計量資料.t檢驗用來比較兩組間計量資料的差異，ANOVA中的LSD法用來比較3組間BBB評分的差異，P<0.05認為數據具有統(tǒng)計學意義.

2結果

2.1正常大鼠及SCI模型大鼠術后不同時相的脊髓功能BBB評分情況

本文中參照改良的Allen’s建立SCI模型大鼠，為了檢測建立的大鼠SCI模型，對對照組和觀察組進行BBB評分.結果顯示，觀察組大鼠術后各個時相的BBB評分均明顯低于對照組大鼠，兩組大鼠各個時相的BBB評分比較差異顯著(P<0.05)；觀察組大鼠隨著時相的延長，BBB評分不斷升高，至術后7 d，BBB評分升高較其他時相更明顯，說明神經系統(tǒng)有一定的自我修復功能(圖1).

2.2正常大鼠及SCI模型大鼠術后不同時相脊髓組織的HE染色結果

基于上述BBB評分情況，進一步采用HE染色的方法來觀察大鼠的組織形態(tài)(圖2).

圖1　正常大鼠和SCI損傷大鼠術后不同時相的脊髓功能BBB評分Fig.1　The BBB score of normal rats and SCI rats at different phases

圖2A為正常大鼠脊髓組織神經元結構，圖2B為SCI損傷后6 h脊髓組織神經元結構，圖2C為SCI損傷后12 h脊髓組織神經元結構，圖2D為SCI損傷后24 h脊髓組織神經元結構，圖2E為SCI損傷后3 d脊髓組織神經元結構,圖2F為SCI損傷后7 d脊髓組織神經元結構.(黑色箭頭指示紅細胞，白色箭頭指示炎癥細胞).

從圖2可以看出，正常大鼠脊髓組織的神經元細胞形態(tài)結構正常；SCI模型大鼠術后不同時相脊髓組織的神經元細胞形態(tài)隨著時間的增加，出現不同程度的變化.HE染色結果顯示，術后6 h，脊髓組織水腫廣泛出現；術后12 h～24 h，脊髓組織出現明顯壞死；術后3 d，脊髓組織灰白質神經元大片溶解、壞死，并伴有大量炎癥細胞的浸潤；術后7 d，脊髓組織廣泛嚴重壞死.

圖2　正常大鼠及SCI模型大鼠術后不同時相脊髓組織的HE染色結果(20×)

2.3正常大鼠及SCI模型大鼠術后不同時相脊髓組織中miR-124a的相對表達量

圖3　正常大鼠及SCI損傷大鼠術后不同時相脊髓組織中miR-124a的相對表達量Fig.3　The expression of miR-124a in each time phase after the operation

為了觀察SCI模型大鼠術后miR-124a的表達情況，通過實時定量熒光PCR定時檢測上述SCI模型大鼠各個時相脊髓組織中miR-124a的含量.結果顯示觀察組大鼠各個時相脊髓組織中miR-124a的相對表達量均明顯低于對照組各個時相的表達量，統(tǒng)計學分析顯示有明顯差異(P<0.05)；觀察組大鼠術后7 d脊髓組織中miR-124a的表達量最高，明顯高于其他時相，不同時相的miR-124a的表達量比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)，表明在SCI的不同病理階段，miR-124a的表達量不同.同時miR-124a表達變化與BBB評分的升高趨勢(圖1)基本一致，推測miR-124a高表達與神經系統(tǒng)的重建有關.

2.4正常大鼠及SCI模型大鼠術后不同時相脊髓組織中miR-124a的分布

采用原位雜交技術檢測miR-124a的分布，其中以胞漿的染色作為細胞定位的指標.陽性反應結果為胞漿被染成藍紫色，陰性反應為胞漿未被染成藍紫色(圖4).

圖4中，A為正常大鼠，B為SCI損傷后6 h，C為SCI損傷后12 h，D為SCI損傷后24 h，E為SCI損傷后3 d，F為SCI損傷后7 d.

圖4　原位雜交檢測miR-124a的表達結果(25×)

結果顯示，正常大鼠的陽性細胞數較多，為強陽性，脊髓損傷7 d后同樣呈強陽性.而脊髓損傷6 h、12 h、24 h、3 d后，陽性細胞數較少，表現為弱陽性.這一結果也與熒光定量PCR的結果類似.

2.53組SCI模型大鼠術后各時間點的神經功能BBB評分情況

3組SCI模型大鼠術后1 w的神經功能BBB評分比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；術后2 w，正常移植組和轉染移植組大鼠的BBB評分均明顯高于未治療組(P<0.05)，正常移植組和轉染移植組大鼠的BBB評分比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；術后4 w、6 w，3組大鼠的BBB評分存在顯著差異(F=5.136、5.743，P<0.05)，其中正常移植組、轉染移植組的BBB評分高于未治療組，轉染移植組高于正常移植組(見圖5).結果表明BMSCs-D-NSCs移植組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs移植組均能促進SCI的運動功能的恢復.

2.63組 SCI模型大鼠術后4 w脊髓組織損傷灶范圍大小情況

參考文獻[27]的計算方法，將組織切片經顯微測量計算后，結果顯示，相對于未治療組，正常移植組SCI大鼠脊髓組織損傷灶減少的體積為(3.36±0.23)%，轉染移植組SCI大鼠脊髓組織損傷灶減少的體積為(6.39±0.33)%，兩組大鼠脊髓組織空洞減少比例的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖6).

圖5　3組SCI模型大鼠術后各個

圖6　與治療組相比，正常移植組與

3討論

miRNA是調節(jié)脊髓發(fā)育和可塑性的重要因子，其在脊髓組織中特異性表達，且呈高度表達，能夠嚴格調控脊髓的發(fā)育.多數關于脊髓發(fā)育過程中miRNA表達變化的研究顯示，miRNA的差異性表達與脊髓的發(fā)育密切相關[27].多數國外學者通過RT-PCR、原位雜交等技術檢測發(fā)現成年小鼠的中樞神經系統(tǒng)組織中存在較多種類的miRNA表達，且呈高度表達的miRNA與CNS的特定功能密切相關[28—32].在CNS中研究最多的miRNA是miR-124.miR-124在脊髓組織和其他非神經組織中表達的含量存在顯著差異，在脊髓組織中的含量較非神經組織高出100倍，具有CNS組織特異性.miR-124對脊髓發(fā)育的影響主要是通過Sox9這一靶分子實現的，其另一個靶分子小C端磷酸酶1具有抑制神經元性基因表達的作用，miR-124通過這一靶分子可對神經元細胞的分化成熟起到很好的促進作用[33].miR-124具有3種亞型，其中以miR-124a最為常見，并參與CNS的發(fā)育、損傷及腫瘤等進展.

文獻[16]發(fā)現，miR-124a在SCI損傷小鼠模型中的表達與時間存在明顯的依賴性，其表達的下調可能是由于神經細胞死亡導致.利用基因芯片技術與RFPCR技術對缺氧缺血腦損傷小鼠損傷前后腦組織中miR-124a的表達量進行檢測的結果顯示，與正常的腦組織相比，缺氧缺血性腦損傷小鼠腦組織中miR-124a的表達明顯上調，提示缺血缺氧條件可促進miR-124a的表達，進而促進內源性神經干細胞的增殖和分化，使腦損傷得到修復.文獻[34]等還發(fā)現，阻斷CNS中miR-124a的表達后，神經再生出現明顯的延遲.上述研究均表明miR-124a在CNS損傷機制中發(fā)揮著重要作用，可作為有效靶點干預CNS損傷.本文對正常大鼠及SCI損傷大鼠脊髓組織中的miR-124a表達情況進行了檢測.結果顯示，與正常大鼠相比，SCI損傷大鼠術后各個時相的miR-124a表達量均明顯下調，且SCI損傷大鼠各個時相的miR-124a表達量存在一定差異，以術后7 d最高(P<0.05)，上述結果表明在正常脊髓組織內大量表達的miR-124a在SCI后可出現明顯下調，這與CNS中大量細胞損傷有關.

目前，臨床上認為有效治療SCI的方法是神經干細胞移植，神經干細胞移植后分化產生的多種細胞如神經元細胞、星形膠質細胞及少突膠質細胞等，可填補脊髓損傷區(qū)域內缺失的神經細胞，對神經功能修復十分有幫助.SCI損傷后小鼠的運動和感覺功能均明顯減退，甚至永久性喪失.在SCI大鼠脊髓損傷處植入的干細胞可很快被誘導分化為神經元，對神經功能的恢復十分有幫助，有效改善了SCI損傷大鼠的感覺和運動功能.本文還對正常大鼠及SCI損傷大鼠術后不同時間的神經功能BBB評分進行了對比.數據顯示，兩組大鼠術后不同時間的BBB評分存在較大差異，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明SCI后，大鼠的神經功能開始顯著降低.miR-124a能夠有效調控神經細胞的分化，在后期神經元分化成熟過程中呈高表達.對神經干細胞體外培養(yǎng)的實驗發(fā)現，干細胞經miR-124a轉染后，神經元細胞的分化過程受到明顯促進，更利于神經功能的恢復.本研究對比了未治療組、正常移植組(BMSCs-D-NSCs)和轉染移植組(miR-124a-BMSCs-D-NSCs)大鼠術后不同時間的BBB評分.結果顯示，3組大鼠術后4 w、6 w的BBB評分兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，尤以轉染miR-124a后神經干細胞移植組大鼠的BBB評分最高，這說明SCI后，選擇移植轉染miR-124a的神經干細胞較移植普通神經干細胞對神經元的修復作用更好，可促進脊髓神經功能更好地恢復.

本文中BMSCs-D-NSCs移植組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs移植組，都表現出了SCI后對神經功能的修復作用，且miR-124a-BMSCs-D-NSCs的效果更為顯著.因此，miR-124a在大鼠SCI的治療過程中，可以明顯地促進神經功能的恢復，為SCI后的細胞替代治療提供了一個新思路，這可能是與miR-124a促進干細胞向神經元的分化的機制密切相關.

參考文獻：

[1]LEE B B,CRIPPS R A,FITZHARRIS M,et al.The global map for traumatic spinal cord injury epidemiolopy:update 2011,global incidence rate[J].Spinal cord， 2014,52(2):110—115.

[2]STRICKLAND E R, HOOK M A, BALARAMAR S, et al.MicroRNA dysregulation following spinal cord contusion: implications for neural plasticity and repair[J]. Neuroscience,2011,186(186):146—160.

[3]KRICHEVSKY A M. MicroRNA profiling: from dark matter to white matter, or identifying new players in neurobiology[J]. Scientific world journal, 2007, 7(S2):155—166.

[4]KOSIK K S. The neuronal microRNA system[J].Nature reviews neuroscience,2006,7(12):911—920.

[5]SHAFI G, ALIYA N, MUNSHI A. MicroRNA signatures in neurological disorders[J]. The Canadian journal of neurological sciences Le journal Canadien des sciences neurologiques, 2010, 37(2): 177—185.

[6]BAREYRE F M, SCHWAB M E. Inflammation, degeneration and regeneration in the injured spinal cord: insights from DNA microarrays[J]. Trends in neurosciences，2003,26(10): 555—563.

[7]di GIOVANNI S, KNOBLACH S M, BRANDOL C, et al.Gene profiling in spinal cord injury shows role of cell cycle in neuronal death[J].Annals of neurology, 2003, 53(4): 454—468.

[8]NESIC O, SVRAKIC N M, XU G Y, et al. DNA microarray analysis of the contused spinal cord: effect of NMDA receptor inhibition[J]. Journal of neuroscience research, 2002, 68(4): 406—423.

[9]NIETO-DIAZ M, ESTEBAN F J, REIGADA D, et al. MicroRNA dysregulation in spinal cord injury: causes, consequences and therapeutics[J]. Frontiers in cellular neuroscience, 2014, 8(9): 53.

[10]張雨祿，胡三元，等.乳腺癌轉移抑制因子(BRMS1)在人乳腺癌細胞系中的表達受體研究[J]．鄭州大學學報 (理學版)，2014，46(1)：94—97．

[11]BAK M, SILAHTAROGLU A, MOLLER M, et al. MicroRNA expression in the adult mouse central nervous system[J]. RNA, 2008,14(3): 432—444.

[12]HOHJOH H, FUKUSHIMA T. Expression profile analysis of microRNA (miRNA) in mouse central nervous system using a new miRNA detection system that examines hybridization signals at every step of washing[J]. Gene, 2007, 391(s1/s2):39—44.

[13]FARH K K, GRIMSON A, JAN C, et al. The widespread impact of mammalian microRNAs on mRNA repression and evolution[J]. Science, 2005, 310(5755): 1817—1821.

[14]LANDGRAF P, RUSU M, SHERIDAN R, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J]. Cell, 2007, 129(7): 1401—1414.

[15]YUNTA M, NIETO-DIAZ M, ESTEBAN F J, et al. MicroRNA dysregulation in the spinal cord following traumatic injury[J]. PLoS one,2012,7(4):120—123.

[16]NAKANISHI K, NAKASA T, TANAKA N, et al. Responses of microRNAs 124a and 223 following spinal cord injury in mice[J]. Spinal cord,2010, 48(3):192—196.

[17]HUANG Y,JIA X,BAI K,et al.Effect of fluid shear stress on cardiomyogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. J Arch Med Res,2010,41(7):497—505.

[18]張春燕，張自強，劉玉梅，等. 大鼠雪旺細胞體外分離培養(yǎng)純化及鑒定[J]．河南科技大學學報 (自然科學版)，2015，36(4)：82—84．

[19]MARL P，HINDOCHA S,MARL R, et al．Adult mesenchymal stem cells and cell surface characterization:a systematic review of the literature[J].J Open Orthop J,2011,5(suppl2):253—260．

[20]BARNAB G F, SCHWINDT T T,CALCAGNOTTO M E,et al.Chemically-induced rat mesenchymal stem cells adopt molecular properties of neuronal．like cells but do not have basic neuronal functional properties[J]．PLoS one,2009,4(4):e5222．

[21]RADTKE C,SCHMITZ B, SPIES M, et al.Peripheral glial cell differentiation from neurospheres derived from adipose mesenchymal stem cells[J].Int J Devl Neuroscience,2009, 27(8):817—823.

[22]程騰，李佳佳，賀小英，等. 培養(yǎng)方法及胎牛血清濃度對人胎兒成纖維細胞體外生長的影響[J]．信陽師范學院學報(自然科學版)，2013，26(4)：523—526．

[23]WISLET-GENDEBIEN S, LAUDET E, NEIRINCKX V,et al.Adult bone marrow: which stem cells for cellular therapy protocols in neurodegenerative disorders?[J]. J biomed biotechnol, 2012, 2012(1):111—113.

[24]MIN K J, JIN S J, JEE C, et al.MicroRNA 486 is a potentially novel target for the treatment of spinal cord injury[J].Brain,2012,135(4):1237—1252.

[25]李佳佳，程騰，賀小英，等. 二甲基亞砜和胎牛血清對293T細胞冷凍效果的影響[J]．信陽師范學院學報(自然科學版)，2013，26(2)：217—220．

[26]BASSO D M，BEATTIE M S,BRESNAHAN J C．Graded histological and motor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight．drop device versus transaction[J]．Exp Neur，1996,139(6)：244—256．

[27]CHOPP M，ZHANG X H，LI Y，et al.Spinal cord injury in rat：treatment with bone marrow stromal cell transplantation[J]．Neuroreport，2000,11(13):3001—3005．

[28]BERNSTEIN E, KIM S Y, CARMELL M A, et al. Dicer is essential for mouse development[J]. Nature genetics， 2003,35(3): 215—217.

[29]CUELLAR T L, DAVIS T H, NELSON P T, et al. Dicer loss in striatal neurons produces behavioral and neuroanatomical phenotypes in the absence of neurodegeneration[J]. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 2008, 105(14): 5614—5619.

[30]ZEHIR A, HUA L L, MASKA E L, et al. Dicer is required for survival of differentiating neural crest cells[J]. Developmental biology, 2010, 340(12):459—467.

[31]KAWASE-KOGA Y, OTAEGI G, SUN T. Different timings of Dicer deletion affect neurogenesis and gliogenesis in the developing mouse central nervous system[J]. Developmental dynamics: an official publication of the American association of anatomists, 2009,238(11): 2800—2812.

[32]FIORE R, SIEGEL G, SCHRATT G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease[J]. Biochimica et biophysica acta, 2008,1779(8): 471—478.

[33]BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell,2004,116(2):281—297.

[34]CHENG X,HE D,DONG X D, et al.miR-124a is epigenetically regulated and acts as a tumor suppressor by controlling multiple targets in uveal melanoma[J].Investigative ophthalmology visual science,2013,54(3):2248—2256.

(責任編輯：王浩毅)

Effects of MicroRNA-124a on SCI Secondary Injury and the Underlying Mechanism

ZHANG Fen

(CollegeofLifeScienceandTechnology,ShanghaiTongjiUniversity,Shanghai200092,China)

Abstract:How miR-124a affects the secondary injury of spinal cord injury (SCI) and its related mechanism were studied. SCI model was established by gathering 80 healthy adult Wistar rats, which were divided into three groups. The first group, injected with saline only after operation, was the untreated group. The second group, injected with BMSCs-D-NSCs for treatment after operation, was the normal transplantation group. The third group, injected with miR-124a-BMSCs-D-NSCs for treatment after operation, was the transfected transplantation group. Another 60 healthy adult rats were used as the control group, which only accepted sham-operation. Histomorphology change was observed via HE staining, the miR-124a expression was tested via quantitative real-time PCR, and the lesion site was micro-measured and calculated. The result showed that after SCI, the expression of miR-124a in spinal cord tissue remarkably decreased, so did the spinal cord nerve function. miR-124a-BMSCs-D-NSCs can, decrease the injured area and size of spinal cord and improve the function of CNS.

Key words:microRNA-124a; spinal cord injury; neurological; mechanism

收稿日期:2015-11-09

作者簡介:張芬(1989—)，女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事神經生物學研究，E-mail:93fenzhang@#edu.cn.

中圖分類號：Q6-33

文獻標志碼：A

文章編號：1671-6841(2016)01-0073-08

DOI:10.3969/j.issn.1671-6841.201511007

引用本文：張芬.microRNA-124a對SCI繼發(fā)性損傷的影響及相關機制研究[J].鄭州大學學報：理學版，2016，48(1)：73—80.