周璐璐，伏兵哲，許冬梅，高雪芹

(1.寧夏大學農(nóng)學院草業(yè)科學研究所，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏大學西北土地退化與生態(tài)恢復省部共建國家重點實驗室培訓基地，寧夏 銀川 750021； 3.寧夏大學科學技術(shù)處，寧夏 銀川 750021)

兩種化學誘變劑對沙蘆草染色體的加倍效果

周璐璐1,2，伏兵哲1,2，許冬梅1,2，高雪芹3

(1.寧夏大學農(nóng)學院草業(yè)科學研究所，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏大學西北土地退化與生態(tài)恢復省部共建國家重點實驗室培訓基地，寧夏 銀川 750021； 3.寧夏大學科學技術(shù)處，寧夏 銀川 750021)

摘要：為提高沙蘆草(Agropyron mongolicum)的牧草品質(zhì)，篩選最優(yōu)的染色體加倍方案，采用不同濃度的秋水仙素(0.02%，0.05%，0.08%，0.11%，0.14%+1.5%二甲基亞楓)和氟樂靈(1，5，10，15，20 μmol·L-1)處理沙蘆草種子，并進行表觀形態(tài)及染色體數(shù)目的鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)處理的沙蘆草種子成活后的變異植株均為二倍體與四倍體的混倍體；0.11%秋水仙素+1.5%二甲基亞砜處理20 h的染色體數(shù)目變異率最大，高達50%，其成活率為40%；1 μmol·L-1氟樂靈處理6 h變異效果顯著，變異率達38.46%。本研究為后期進一步篩選沙蘆草加倍植株奠定了理論與試驗基礎。

關(guān)鍵詞：沙蘆草；誘變劑；染色體加倍；倍性鑒定

沙蘆草(Agropyronmongolicum)又稱蒙古冰草，為禾本科(Gramineae)小麥族冰草屬多年生草本植物，主要分布于我國中西部的荒漠草原，具有抗旱、抗寒、耐風沙、耐貧瘠等特性，青綠持續(xù)期長，適口性好，營養(yǎng)成分含量較高[1]，具有重要飼用價值、生態(tài)價值和遺傳價值。我國學者在沙蘆草的分類學歷史、植物學特征、生物學特征、經(jīng)濟價值以及遺傳育種學和栽培學等方面進行了研究[2-8]，并通過人工野生馴化和混合選擇，成功培育出內(nèi)蒙沙蘆草(A.mongolicumcv. Neimeng)和蒙農(nóng)1號蒙古冰草(A.mongolicumcv. Mengnong No.1)兩個沙蘆草新品種[9]；于肖夏等[10]利用秋水仙素對二倍體航道冰草(A.cristatumcv. Fairway)與沙蘆草雜交的F1代種子進行染色體加倍誘導，并選育得到四倍體雜交冰草優(yōu)良新品系SZB-02。

沙蘆草是異交率很高的二倍體(2n=2x=14)植物，其葉量少、產(chǎn)草量相對較低，嚴重影響其經(jīng)濟效益。經(jīng)過染色體加倍的植物一般具有植株巨大性、抗逆性強、營養(yǎng)成分豐富等特性[11]，因此考慮利用倍性育種方法，培育產(chǎn)草量較高的沙蘆草新品種。許多研究表明，在化學誘變?nèi)旧w加倍過程中的誘變劑類型、誘變劑濃度、處理時間以及處理時期是影響植物染色體加倍效果的主要因素[12-13]，因此，探索最佳的沙蘆草染色體加倍條件對多倍體沙蘆草的培育具有重要意義。本研究對沙蘆草染色體加倍誘變劑種類、誘變劑濃度以及處理時間進行研究，旨在篩選出最佳的沙蘆草染色體加倍條件，為沙蘆草四倍體培育提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

2014年于銀川市寧夏大學南場實訓基地采集的沙蘆草種子。

1.2多倍體誘導

1.2.1種子消毒用75%酒精浸泡種子1 min，再用0.1% HgCl2浸泡10 min，最后用無菌水漂洗3次。

1.2.2染色體加倍處理1)秋水仙素處理：將種子用清水浸泡12 h，待胚根剛剛萌發(fā)時取出，用0.02%、0.05%、0.08%、0.11%、0.14%的秋水仙素分別加1.5%二甲基亞砜(DMSO)，在25 ℃下依次浸泡處理6、10、16、20、24 h，并以蒸餾水浸泡作對照。每個處理3次重復，每個重復30粒種子。2)氟樂靈處理：用上述同樣方法處理種子，用氟樂靈作加倍誘變劑，處理濃度分別為1、5、10、15、20 μmol·L-1，處理時間依次為6、12、18、24、30 h，用蒸餾水處理作對照。每個處理3次重復，每個重復30粒種子。

1.2.3恢復培養(yǎng)將處理后的種子用清水徹底清洗，并分別放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中恢復培養(yǎng)，生長10 d后移植到土壤中繼續(xù)生長。觀察生長狀況，成苗后進行染色體倍性鑒定。

1.3多倍體鑒定過程

1.3.1表觀形態(tài)的鑒定發(fā)芽10 d測量苗高與根長，并統(tǒng)計發(fā)芽率，觀察幼苗形態(tài)，統(tǒng)計形態(tài)變異率；移栽30 d統(tǒng)計成活率和染色體數(shù)目變異率。

1.3.2染色體制片法1)預處理：取根部，用0.002 mol·L-18-羥基喹啉浸泡4 h；2)固定：取出根尖放入卡諾固定液中固定12 h；3)解離：1 mol·L-1的鹽酸解離20 min；4)染色制片：卡寶品紅染液染色15～20 min；5)顯微鏡下觀察染色體數(shù)目。

1.3.3各指標計算方法

發(fā)芽率=第10天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

形態(tài)變異率=形態(tài)變異的幼苗數(shù)/幼苗總數(shù)×100%；

成活率=30 d成活苗數(shù)/移栽苗總數(shù)×100%；

染色體變異率=染色體數(shù)目變異苗數(shù)/成活苗數(shù)×100%。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用SAS 9.0和Excel做數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1兩種誘變劑對沙蘆草苗期形態(tài)的影響

經(jīng)兩種誘變劑的處理，沙蘆草幼苗形態(tài)出現(xiàn)不同程度的變異(表1、圖1)。萌發(fā)初期，誘變劑使部分細胞染色體加倍，造成細胞體積增大，對植物組織的正常生理環(huán)境造成破壞，使芽體表面凹凸不平，細胞組織疏松變形，幼苗出現(xiàn)粗化苗、卷化苗和球狀苗等變異苗。正常幼苗形態(tài)：葉片纖細，幼根發(fā)達細長，透明乳白色；粗化苗形態(tài)：葉片呈鼓錘狀，顏色深綠，幼根顏色發(fā)黃，有膨大現(xiàn)象；卷化苗形態(tài)：葉片發(fā)生卷曲化，表面組織疏松，幼根顏色發(fā)黃；球化苗形態(tài)：葉片呈球狀，表面凹凸不平，幼根粗短褐化。秋水仙素處理的變異幼苗以粗化苗為主，氟樂靈處理的變異幼苗以球狀苗為主。隨秋水仙素和氟樂靈的濃度增大和處理時間的延長，沙蘆草形態(tài)變異率明顯增加，其中，0.08%秋水仙素處理24 h、15 μmol·L-1氟樂靈處理24 h和20 μmol·L-1處理30 h的變異率較高，分別為92.31%、56.25%和56.25%。由此可見，秋水仙素和氟樂靈對沙蘆草種子的幼苗生長形態(tài)有不同程度的影響。

2.2兩種誘變劑對沙蘆草發(fā)芽率的影響

隨秋水仙素濃度的升高，沙蘆草發(fā)芽率總體呈下降趨勢，以0.05%秋水仙素處理下平均發(fā)芽率最高，為44.67%；相同秋水仙素濃度處理下，隨處理時間的延長，發(fā)芽率呈下降趨勢，但24 h處理下的種子因浸泡作用使得發(fā)芽率在0.05%、0.11%和0.14%水平又有所升高(圖2)，各濃度水平短時間處理(6 h)與長時間處理(20 h)發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)。氟樂靈處理的沙蘆草種子發(fā)芽率隨濃度的升高無規(guī)律性變化(圖3)，各濃度處理的平均發(fā)芽率均低于40%，其中，15 μmol·L-1氟樂靈處理后的沙蘆草種子平均發(fā)芽率最高，為33.11%，且該濃度下不同時間處理之間差異顯著(P<0.05)，1、5、20 μmol·L-1濃度水平不同時間處理差異不顯著(P>0.05)。

表1　秋水仙素和氟樂靈處理后不同變異苗形態(tài)比較統(tǒng)計結(jié)果

續(xù)表1

誘變劑Mutagen處理濃度Treatmentconcentration處理時間Treatmenttime/h苗數(shù)Seedlingnumber正常數(shù)Normalseedling粗化苗Thickseedling卷化苗Crulyseedling球狀苗Globularseedling形態(tài)變異率Mutationalrateofmorphology/%氟樂靈Trifluralin/μmol·L-1206210014.5512220014.3518130017.14241400630.0030710856.25

圖1　不同變異幼苗形態(tài)

注：a,正常幼苗形態(tài)；b,粗化幼苗形態(tài)；c,卷曲幼苗形態(tài)；d,球狀幼苗形態(tài)；e,正常幼莖形態(tài)；f,粗化苗幼莖形態(tài)；g,卷曲苗幼莖形態(tài)；h,球狀苗幼莖形態(tài)；i,正常幼根形態(tài)； j,粗化苗幼根形態(tài)；k,卷曲苗幼根形態(tài)；l,球狀苗幼根形態(tài)。

Note: a, Normal seedling morphology; b, Thick seedling morphology; c, Cruly seedling morphology; d, Globular seedling morphology; e, Normal young stem morphology; f, Thick young stem morphology; g, Cruly young stem morphology; h, Globular young stem morphology; i, Normal radicle morphology; j, Thick radicle morphology; k, Cruly radicle morphology; l, Globular radicle morphology.

圖2　秋水仙素濃度和處理時間對沙蘆草發(fā)芽率的影響

注：不同小寫字母表示相同濃度不同處理時間之間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different lower case letters for the same concentration indicate significant difference among different treatment time at 0.05 level.The same below.

圖3　氟樂靈濃度和處理時間對沙蘆草發(fā)芽率的影響

2.3兩種誘變劑對沙蘆草苗高和根長的影響

兩種誘變劑對沙蘆草種子第10天的苗高與根長的生長有抑制作用(圖4，圖5)，且秋水仙素的抑制作用大于氟樂靈，說明秋水仙素毒性更強。隨秋水仙素濃度的增大，第10天平均苗高和根長總體變化較小，處理24 h的種子，除0.02%和0.11%水平外，其他濃度處理苗高均顯著減?。桓鳚舛忍幚淼姆N子苗高與根長均顯著小于對照。經(jīng)氟樂靈處理的沙蘆草種子第10天苗高與根長隨濃度的升高均呈下降趨勢，除1 μmol·L-1的氟樂靈處理6 h的種子苗高和根長大于對照外，其他各處理水平下的苗高和根長均低于對照，且濃度越高，抑制作用越大，苗高與根長值越小；1和5 μmol·L-1濃度下，不同處理時間苗高與根長的變化較小，10、15、20 μmol·L-1濃度下不同處理時間苗高和根長變化較大，說明濃度越大，對種子萌發(fā)后的生長影響越大。

2.4兩種誘變劑對沙蘆草種子發(fā)芽率、苗高及根長影響的方差分析

為判斷誘變劑濃度和處理時間單個因素的影響水平和兩因素之間的交互作用，用SAS軟件進行方差分析(表3)，結(jié)果顯示誘變劑的濃度和處理時間對沙蘆草的發(fā)芽率、苗高與根長有不同程度的影響。秋水仙素的濃度對沙蘆草的平均發(fā)芽率、苗高和根長無顯著影響(P>0.05)，不同時間處理對平均發(fā)芽率、苗高和根長均有極顯著影響(P<0.01)，說明秋水仙素的處理時間是影響發(fā)芽率的主要因素，同時秋水仙素處理濃度和時間對發(fā)芽率、苗高和根長的影響存在顯著交互作用。不同濃度的氟樂靈和不同處理時間下，沙蘆草發(fā)芽率上均不存在顯著差異(P>0.05)，但在苗高和根長上存在極顯著差異(P<0.01)；氟樂靈濃度和時間對發(fā)芽率的影響存在交互作用，但對苗高和根長的影響不存在交互作用。

圖4　秋水仙素濃度和處理時間對沙蘆草第10天苗高與根長的影響

圖5　氟樂靈濃度和處理時間對沙蘆草第10天苗高與根長的影響

2.5染色鑒定結(jié)果及變異統(tǒng)計

2.5.1染色體數(shù)目鑒定結(jié)果正常二倍體染色體數(shù)為2n=14條，加倍后的染色體數(shù)為4n=28條，但試驗結(jié)果中沒有成功加倍的四倍體，均為二倍體細胞和四倍體細胞組成的混倍體(圖6)。加倍處理后的染色體只在數(shù)量上發(fā)生了變異，形態(tài)上與正常細胞染色體沒有差異。

2.5.2秋水仙素對沙蘆草成活率與染色體變異率的影響秋水仙素+1.5%二甲基亞砜處理的沙蘆草幼苗成活率相對較高，平均成活率達到63.77%，0.11%秋水仙素浸種10 h的處理水平成活率最高，可達到91.43%；各處理的染色體變異率均較低，平均變異率僅為13.30%，0.11%秋水仙素浸種20 h的處理水平變異率最大，為50.00%，整體呈現(xiàn)出高濃度的秋水仙素比低濃度的誘導效果更好(表3)。綜合考慮成活率和變異率，0.11%濃度處理20 h的染色體數(shù)目變異率最大，高達50%，其成活率為40%，因本試驗目的是在不過度影響成活率的基礎上得到更高的變異率，因此可將此處理水平暫定為最佳變異處理水平。

2.5.3氟樂靈對沙蘆草成活率與染色體變異率的影響氟樂靈處理的種子成活率與變異率變化幅度較大(表3)。隨濃度的升高，成活率總體呈下降趨勢，其中5 μmol·L-1氟樂靈處理24 h的成活率最高，可達到86.96%，20 μmol·L-1濃度下長時間的處理水平(24和30 h)因其毒害作用過大，幼苗全部死亡；氟樂靈各處理的染色體變異率普遍較低，平均變異率僅為13.05%，最高變異率為38.46%(1 μmol·L-1處理30 h)。綜合分析成活率與染色體變異率可知：1 μmol·L-1處理30 h的成活率與變異率都較高，成活率高達81.25%，變異率可達38.46%，初步判斷為氟樂靈最佳誘變處理水平。

表2　不同誘變劑對沙蘆草發(fā)芽率、苗高與根長影響的方差分析

注： *表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note：* indicates significant difference at 0.05 level, **indicates significant difference at 0.01 level. The same below.

圖6　二倍體細胞染色體數(shù)和四倍體細胞的染色體數(shù)

3討論與結(jié)論

本研究用誘變劑處理萌動種子以得到多倍體植株，因其簡單易行，曾被學者們廣泛使用，并得到不同的加倍效果。秋水仙素和氟樂靈的加倍原理相似，秋水仙素是與微管蛋白異二聚體結(jié)合，抑制微管裝配的一種生物堿[14]；氟樂靈是一種可以抑制微管形成，誘變率較高、毒性較小的新型除草劑[15]，Stadler等[16]和Wan和Widholm[17]也曾研究證實除草劑對植物細胞具有加倍作用。誘變劑只在細胞分裂時期通過抑制紡錘體的形成導致細胞不分裂，從而使染色體數(shù)目加倍，對不分裂的成熟細胞沒有作用[18]，因此，在誘發(fā)多倍體的過程中，只是部分細胞加倍，分生組織中的一層、兩層或者所有細胞會受到影響，繼續(xù)發(fā)育成為一個混倍體或多倍體細胞系[19]，有學者們用秋水仙素處理菘藍(Isatisindigotica)獲得混倍體的加倍植株而非多倍體植株[20]。植物混倍體是不穩(wěn)定的，它是繁殖過程中出現(xiàn)的新植株類型[21]，所以混倍體植株是由二倍體誘導四倍體植株加倍成功的標志，本研究所得植株也均為混倍體植株，可以為培育沙蘆草新品種提供材料基礎。

表3　秋水仙素和氟樂靈處理沙蘆草種子變異率統(tǒng)計

續(xù)表3

誘變劑Mutagen處理濃度Treatmentconcentration處理時間Treatmenttime/h數(shù)量Number移植苗Plants成活苗Survival染色體數(shù)變異苗Chromosomemutation成活苗Survivalrate/%形態(tài)變異率Mutationalrateofmorphology/%氟樂靈Trifluralin/μmol·L-12062414158.337.14122514156.007.1418179052.940.0024240-0.00-30200-0.00-

兩種試劑相比，微量氟樂靈就可達到加倍效果，因此更受到研究者的青睞。同時不同植物對不同試劑濃度與處理時間的敏感度不同，因此，要根據(jù)不同植物設計不同的處理水平。魏育國和蔣菊芳[22]用400倍的氟樂靈處理萌動的甜瓜(Cucumismelo)種子8 h可使誘變率高達32.2%；葛志東等[23]用浸種法和生長點滴液法處理西葫蘆(Cucurbitapepo)種子，誘變率可達到20%；趙曉潘[24]用20 μmol·L-1氟樂靈溶液處理半枝蓮(Scutellariabarbata)枝條，變異率達到64.7%；張競秋等[25]研究發(fā)現(xiàn)氟樂靈會使小麥(Triticumaestivum)根尖細胞發(fā)生畸變。本研究沙蘆草變異植株的統(tǒng)計結(jié)果顯示：0.11%的秋水仙素+1.5%二甲基亞砜處理20 h的染色體數(shù)目變異率最大，高達50%，其成活率為40%；1 μmol·L-1的氟樂靈處理30 h的成活率與變異率都較高，成活率高達81.25%，染色體數(shù)目變異率可達38.46%，因此可以初步確定為最佳處理水平。

此外，通過對發(fā)芽率、苗高與根長以及成活率的綜合統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)兩種誘變劑主要抑制沙蘆草的生長，但所抑制的階段有所不同，秋水仙素主要抑制種子的萌發(fā)及初期的伸長生長，表現(xiàn)為發(fā)芽率低，苗高與根長值相對較??；而氟樂靈顯著降低后期的成活率，其原因有待進一步進行生理生化試驗來證實。

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(責任編輯王芳)

Effects of chemical mutagens on chromosome doubling ofAgropyronmongolicum

Zhou Lu-lu1,2, Fu Bing-zhe1,2, Xu Dong-mei1,2, Gao Xue-qin3

(1.Grassland Science Institute, Agricultural College, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;2.Breeding Base for State Key Labotatory of Land Degradation and Ecological Restoration in Northwest China, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;

3.Science and Technology Department, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

Abstract:In order to improve the forage quality of Agropyron mongolicum and screen the best chromosome doubling treatment, the seeds of A. mongolicum were treated with different concentrations of Colchicine (0.02%，0.05%，0.08%，0.11%，0.14%+1.5% DMSO) and Trifluralin (1，5，10，15，20 μmol·L-1) and the morphology and chromosome number were identified after treatment. The results showed that the surviving plants after treated were mixoploid of diploid and tetraploid. The treatment with 0.11% colchicine 1.5% DMSO for 20 h had the highest mutation rate of 50% and the survival rate of 40%. The treatment with 1 μmol·L-1trifluralin for 6 h had significant mutation effect with probability of 38.46%. These results provide theoretical and experimental basis for further screening the chromosome doubling plants of A. mongolicum.

Key words:Agropyron mongolicum; mutagen; chromosome doubling; ploidy identification

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0519

*收稿日期：2015-09-16

基金項目：寧夏高等學校科學研究項目(NGY2013026)；寧夏自然科學基金(NZ2013030)； 寧夏牧草育種專項子課題(2014NYYZ040101)

通信作者：高雪芹(1984-)，女，甘肅白銀人，講師，博士，主要從事牧草種質(zhì)資源和遺傳育種研究。Email:qinqin_803@sina.com

中圖分類號：S540.3;Q945.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0629(2016)5-0897-10*1

Corresponding author:Gao Xue-qinEmail:qinqin_803@sina.com

周璐璐,伏兵哲,許冬梅,高雪芹.兩種化學誘變劑對沙蘆草染色體的加倍效果.草業(yè)科學,2016,33(5)：897-906.

Zhou L L,Fu B Z,Xu D M,Gao X Q.Effects of chemical mutagens on chromosome doubling ofAgropyronmongolicum.Pratacultural Science，2016,33(5)：897-906.

接受日期：2015-12-08

第一作者：周璐璐(1990-)，女，河北滄州人，在讀碩士生，主要從事牧草種質(zhì)資源和遺傳育種研究。Email:zll_19901211@126.com