公丕賢+幸穎+薛雅蓉+劉常宏

摘要：為了揭示鹽沼濕地生態(tài)系統(tǒng)中可培養(yǎng)硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）的多樣性及其時(shí)空變化規(guī)律，探討大米草與互花米草定植對(duì)SRB多樣性及種群數(shù)量的影響，采用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)方法及16S rRNA基因序列分析技術(shù)，定性、定量分析江蘇射陽(yáng)海岸鹽沼濕地可培養(yǎng)SRB的多樣性及種群數(shù)量。結(jié)果共獲得210株硫酸鹽還原菌，歸屬于變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）的17個(gè)屬，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢(shì)類群；發(fā)現(xiàn)了一些未見報(bào)道的新SRB種屬，如Agromyces、Brachybacterium、Oceanimonas、Microbulbifer、Photobacterium、Sporosarcina和Tetrathiobacter等；鹽沼濕地可培養(yǎng)SRB多樣性及種群數(shù)量受季節(jié)變化而改變；定植米草直接或通過(guò)改變土壤性質(zhì)而間接影響鹽沼濕地可培養(yǎng)SRB多樣性及種群數(shù)量。SRB是鹽沼生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其種群多樣性、數(shù)量及分布受生物、非生物因素的影響。

關(guān)鍵詞：鹽沼濕地；硫酸鹽還原菌；種群；米草；互花米草

中圖分類號(hào)：Q938.1；S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0457-06

硫酸鹽還原菌（sulphate-reducing bacteria，SRB）是一類厭氧原核微生物，具有利用惰性硫酸鹽作為呼吸代謝的最終電子受體、氧化有機(jī)物或無(wú)機(jī)物而獲得能量、異化產(chǎn)生具有化學(xué)性質(zhì)活潑的H2S的能力。SRB是生物圈中起源較早的生物類群，在硫元素的生物地球化學(xué)循環(huán)、有機(jī)物質(zhì)降解、溫室氣體釋放（與甲烷產(chǎn)生菌共同作用）、金屬離子還原、含氯化合物生物處理等方面發(fā)揮作用[1-7]。

鹽沼濕地（salt marsh）是世界上生產(chǎn)力最高的生態(tài)系統(tǒng)，其初級(jí)生產(chǎn)力為460～3 700 g/（cm2·年）。米草，特別是互花米草（Spartina alterniflora）是鹽沼濕地生態(tài)系統(tǒng)中的先鋒植物，除少量的米草及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入海水外，絕大部分則留在了濕地的沉積物中，并通過(guò)發(fā)酵、厭氧呼吸而分解。與有氧呼吸、反硝化作用和金屬還原途徑相比，目前認(rèn)為由SRB介導(dǎo)的硫酸鹽還原是鹽沼濕地土壤的主要呼吸途徑，占鹽沼濕地土壤總呼吸的67%～80%[8]。

SRB是鹽沼濕地生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)功能類群，它在鹽沼濕地物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中扮演重要角色[9]。目前有關(guān)鹽沼濕地SRB多樣性的研究多基于對(duì)16S rRNA基因序列或異化的亞硫酸鹽還原酶（dissimilatory sulfite reductase，Dsr）基因序列分析結(jié)果，對(duì)于可培養(yǎng)的SRB多樣性研究報(bào)道較少，而可培養(yǎng)SRB的獲得是認(rèn)知生態(tài)系統(tǒng)中SRB多樣性及功能的關(guān)鍵。為此，本研究以江蘇射陽(yáng)海岸鹽沼濕地為對(duì)象，采用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法研究不同季節(jié)、不同米草定植以及不同土壤深度SRB的多樣性及種群數(shù)量分布規(guī)律，為深入了解鹽沼濕地生態(tài)系統(tǒng)中硫循環(huán)生物驅(qū)動(dòng)機(jī)理提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 選擇培養(yǎng)基組成

選擇性培養(yǎng)基[10-13]組成：0.33 g乙酸鈉，230 μL無(wú)水乙醇，0.12 g苯甲酸鈉，0.45 g乳酸鈉，0.19 g丙酸鈉，15 g NaCl，6.8 g MgSO4·7H2O，5.7 g MgCl2·6H2O，0.09 g KBr，0.7 g KCl，0.25 g NH4Cl，0.2 g KH2PO4，1.5 g CaCl2·2H2O，2.52 g NaHCO3，0.1 g酵母膏，1.66 g Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O，20 g瓊脂，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.0，1×105 Pa滅菌30 min。

1.2 樣品采集

如圖1，樣點(diǎn)A為大米草（Spartina anglica）地，B為互花米草地，C為無(wú)植被光灘（naked beach）。A、B、C樣地沿著潮汐溝，垂直于海岸線呈地帶性分布。取樣時(shí)間分別為米草生長(zhǎng)初期（5月）、揚(yáng)花期（9月）、成熟期（11月）。每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)選取3個(gè)1 m ×1 m的樣方，樣方間距10 m以上。樣方內(nèi)分別取0～5 cm、5～10 cm 2個(gè)深度的土壤樣品各100 g左右，置于聚丙烯塑料樣品袋中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)中將每個(gè)樣地的3個(gè)樣方土壤樣品充分混勻，即每個(gè)樣地最終得到2個(gè)深度共2份土樣，于4 ℃保存。

1.3 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

按照GB 7833-1987《森林土壤含水量的測(cè)定》，分別測(cè)定土壤含水量、pH值[15]。采用鉻酸鋇光度法測(cè)定土壤SO42-濃度[16-17]。土壤樣品中碳、氮元素含量用德國(guó)Heraeus公司的CHN-O-Rapid型元素分析儀測(cè)定；硫元素含量用ZCL自動(dòng)定硫儀測(cè)定。

1.4 可培養(yǎng)SRB種群數(shù)量的測(cè)定

土壤樣品經(jīng)系列稀釋后，涂布于選擇培養(yǎng)基上，然后置于密閉的干燥器中，采用燃燒蠟燭耗氧法去除干燥器中的氧氣，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，菌落及其周圍變黑的即為硫酸鹽還原菌。統(tǒng)計(jì)各平板SRB菌落數(shù)，換算為單位質(zhì)量土壤中的菌落數(shù)，單位CFU/g，。同時(shí)，根據(jù)菌落形態(tài)及生長(zhǎng)差異純化SRB菌株。

1.5 16S rRNA基因序列分析

根據(jù)徐曉宇等方法[18]，提取各SRB菌株的基因組DNA，并進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物為8f[19]、907r[8]。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和膠回收后測(cè)序。采用序列圖譜軟件Chromas對(duì)所得序列進(jìn)行核對(duì)，將序列相同的菌株合并為1個(gè)種，并選擇1個(gè)菌株的序列作為代表序列，使用BLASTN在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫(kù)中對(duì)每株菌的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析，同時(shí)選擇相似性較高的序列作為參比，用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

鹽沼濕地土壤含水量因季節(jié)、是否種植植物以及植物品種而異（表1）。大米草、互花米草種植土壤最大含水量分別發(fā)生在9月（44.4%～49.8%）、11月（36.1%～41.9%）；而光灘土壤含水量隨季節(jié)變化不大（27.3%～33.1%）。相同季節(jié)不同土壤含水量有較大差異。5月、9月大米草土壤含水量（36.2%～49.8%）明顯高于互花米草土壤（25.3%～31.8%）、光灘土壤（30.2%～33.1%），而互花米草土壤在此期間含水量與光灘土壤相比偏低。11月，互花米草土壤含水量（36.1%～41.9%）明顯高于大米草土壤（30.6%～32.7%）、光灘土壤（27.3%～32.3%）。

雖然種植米草及季節(jié)變化對(duì)鹽沼濕地土壤pH值影響不大（表1），但是與光灘相比（5～10 cm>0～5 cm），互花米草定植土壤pH值的變化具有類似趨勢(shì)（5～10 cm>0～5 cm），而大米草定植土壤的pH值則隨深度加深而略有降低（5～10 cm<0～5 cm）。

鹽沼濕地土壤SO42-濃度隨季節(jié)變化而逐漸降低，而種植米草則能夠明顯提高鹽沼濕地土壤中的SO42-濃度（表1）。在相同月份，種植互花米草土壤SO42-濃度基本明顯高于種植大米草、光灘土壤。不同深度土壤中的SO42-濃度因定植植物品種而異：定植大米草土壤中的SO42-濃度隨深度加深而增加，而互花米草土壤則正好相反。

對(duì)9月份各土壤樣品的碳、氮、硫元素含量檢測(cè)結(jié)果顯示，與光灘土壤相比，定植米草可明顯提高表層土壤（0～5 cm）中這些營(yíng)養(yǎng)元素的含量，而對(duì)深層土壤（5～10 cm）中的含量無(wú)明顯影響（表2）。

2.2 SRB種群結(jié)構(gòu)

由于硫酸鹽還原菌還原SO42-的產(chǎn)物H2S可與培養(yǎng)基中Fe2+形成黑色沉淀FeS，因此平板上出現(xiàn)黑色菌落或菌落周圍變黑的即為SRB菌株。從大米草、互花米草和光灘土壤樣品中共分離獲得210株SRB。經(jīng)基因序列同源性（>98%）比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析可知，這些菌株分布于17個(gè)屬，其中20株（R14、R15、R24、R27、R29）屬于厚壁菌門的2個(gè)屬Bacillus、Sporosarcina（相似性均達(dá)100%），27株（R6、R16、R18、R19、R21、R25、R30）屬于放線菌門的5個(gè)屬Agromyces、Brachybacterium、Dietzia、Micrococcus和Rhodococcus（相似性均達(dá)100%）。其他163株屬于變形菌門細(xì)菌，其中39株（R11、R13、R23、R28、R31）屬于α-變形菌綱的3個(gè)屬Paracoccus、Rhizobium、Rhodobacter（相似性均達(dá)100%），5株（R20）為β-變形菌綱的Tetrathiobacter屬（相似性達(dá)100%），119株屬于γ-變形菌綱6個(gè)屬Aeromonas（相似性100%）、Halomonas（相似性達(dá)100%）、Microbulbifer（相似性達(dá)99%）、Oceanimonas（相似性99%）、Photobacterium（相似性100%）和Pseudomonas（相似性達(dá)99%～100%）（圖2）。Pseudomonas屬細(xì)菌在3種土壤及不同季節(jié)中所占比例（28.90%～ 43.40%）明顯高于其他屬，為優(yōu)勢(shì)種群（表3）。從大米草與互花米草定植土壤以及光灘土壤中分別分離到屬于11、16、12屬SRB，其中Agromyces、Bacillus、Halomonas、Oceanimonas、Microbulbifer、Pseudomonas、Photobacterium、Rhizobium和Rhodobacter為3種土壤共有。從各土壤樣品SRB的香農(nóng)-威納指數(shù)分析結(jié)果（表3）來(lái)看，SRB多樣性大小為：大米草土壤>互花米草土壤>光灘，但是各取樣點(diǎn)土壤中香農(nóng)-威納指數(shù)在不同季節(jié)變化不大。

2.3 SRB種群數(shù)量及結(jié)構(gòu)的時(shí)空分布規(guī)律

鹽沼濕地土壤SRB種群數(shù)量因定植植物品種、季節(jié)變化以及深度而改變，定植米草土壤的SRB種群數(shù)量明顯高于光灘土壤（圖3）。在大米草、互花米草定植的淺層土壤（0～5 cm）中，SRB種群數(shù)量分別在9、11月到達(dá)最高值，而在深層土壤（5～10 cm）中均于11月到達(dá)最高值，其中5—9月，大米草定植土壤中SRB種群數(shù)量明顯高于互花米草定植土壤。

雖然Pseudomonas為3個(gè)樣地的優(yōu)勢(shì)SRB類群，但不同采樣地點(diǎn)土壤樣品的亞優(yōu)勢(shì)SRB仍有一定差異，如大米草定植土壤、互花米草定植土壤、光灘土壤的亞優(yōu)勢(shì)種所屬屬別分別為Bacillus、Agromyces，Halomonas、Rhizobium，Rhizobium、Paracoccus（圖4）。

同一季節(jié)、同一SRB類群在不同土壤樣品中的分布比例也存在差異（圖4）。例如在5月，優(yōu)勢(shì)類群Pseudomonas占互花米草定植土壤中總SRB的32.30%，較在大米草定植土壤、光灘土壤（約42%）約低10%；而Halomonas在互花米草定植土壤中的比例（26.70%）遠(yuǎn)高于大米草定值土壤（5.30%）、光灘土壤（5.30%）。9月的結(jié)果與5月類似，Pseudomonas在大米草定植土壤中的比例（43.40%）高于互花米草定植土壤（28.90%）、光灘土壤（34.00%）；Halomonas在互花米草定植土壤中的比例（22.60%）遠(yuǎn)高于大米草定植土壤（5.90%）、光灘土壤（1.90%）。而到了11月，優(yōu)勢(shì)種群Pseudomonas在光灘土壤中的比例明顯提高（38.60%），高于互花米草（31.70%）、大米草（31.8%）定植土壤中的比例。

SRB類群在不同土壤樣品中的分布也存在一定的?；?，只存在于某一種或某幾種土壤中（圖4）。例如，Tetrathiobacter只分布于大米草定植土壤，而Aeromonas、Dietzia、Sporosarcina則只分布于互花米草定植土壤中。此外，Rhodococcus只分布于米草定植土壤中，Brachybacterium、Micrococcus、Paracoccus分布于互花米草定植土壤、光灘土壤中，但在大米草定植土壤中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

相同類型的SRB種群在同一土壤樣地中分布比例隨季節(jié)變化而改變（圖4）。例如Pseudomonas屬在5—9月是大米草定植土壤中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群，但其種群數(shù)量到11月明顯降低，而Agromyces、Microbulbifer屬則不斷提高；在互花米草定植土壤中，Agromyces屬細(xì)菌數(shù)量隨季節(jié)變化而增加，而Rhodobacter則不斷下降，作為優(yōu)勢(shì)種群的Pseudomonas在5、11月所占比例很高，在9月略有下降；在光灘土壤中，Agromyces、Pseudomonas在9月的比例低于5、11月，而Paracoccus、Rhizobium在9月的比例高于5、11月。上述結(jié)果顯示，鹽沼濕地SRB種群結(jié)構(gòu)與數(shù)量隨季節(jié)而呈動(dòng)態(tài)變化，米草的定植顯著改變了鹽沼濕地生態(tài)系統(tǒng)中SRB的種群結(jié)構(gòu)及數(shù)量。

3 討論與結(jié)論

本研究利用選擇性培養(yǎng)基以及16S rRNA基因序列分析，從米草定植以及光灘土壤中共分離獲得210株可培養(yǎng)SRB，主要分屬于變形菌門、厚壁菌門、放線菌門的17個(gè)屬，其中Aeromonas、Bacillus、Dietzia、Halomonas、Micrococcus、Paracoccus、Pseudomonas、Rhizobium、Rhodobacter、Rhodococcus等屬已有報(bào)道[20-27]，且都在兼性厭氧條件下有硫酸鹽還原活性，但Agromyces、Brachybacterium、Oceanimonas、Microbulbifer、Photobacterium、Sporosarcina、Tetrathiobacter等屬未見報(bào)道，但經(jīng)本試驗(yàn)研究表明，其可在培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生H2S，具有硫酸鹽還原活性，可能為新的SRB類群。

Pseudomonas為優(yōu)勢(shì)種群，這與房琳在十紅灘鈾礦床中分離的SRB優(yōu)勢(shì)種群[28]一致，該研究采用燃燒蠟燭法，不能完全去除容器中的氧，分離到一些兼性厭氧和微好氧SRB菌株，沒(méi)有分離到如脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）[4]、降硫細(xì)菌科（Desulfobacteriaceae）[29]等嚴(yán)格厭氧SRB。由美國(guó)材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)（ATSM）標(biāo)準(zhǔn)D2863-2000（石蠟）可知，蠟燭燃燒的臨界氧濃度為1.42～8.52 mg/L；張小里等研究表明，降硫弧菌屬SRB能夠耐受 4.5 mg/L的環(huán)境溶解氧濃度，而氧濃度到9.0 mg/L時(shí)不能存活[30]，因此蠟燭燃燒法可以滿足SRB生長(zhǎng)的氧化還原電位要求。Desulfovibrio的比較基因組結(jié)果顯示，該菌含有編碼還原酶Cyd的基因，因此可以產(chǎn)生抗分子氧的保護(hù)酶，可以在微好氧條件下生長(zhǎng)[31]。本研究分離到的Bacillus、Pseudomonas、Rhizobium、Paracoccus、Rhodobacter等屬SRB中也檢測(cè)到了相應(yīng)分子氧的還原酶[32-36]。房琳在有大量含氧水的氧化帶鈾礦中也分離到厭氧SRB菌株[28]。這些結(jié)果表明，耐氧或微好氧SRB可能是鹽沼濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，在驅(qū)動(dòng)硫的化學(xué)循環(huán)中扮演著重要角色。

影響鹽沼濕地土壤中SRB種群數(shù)量及分布的因素很多，如溫度、土壤基質(zhì)、植被等。Edgcomb等發(fā)現(xiàn)，SRB的種群數(shù)量、硫酸鹽還原速率在8月以后達(dá)到峰值[37]；Nie等發(fā)現(xiàn)，揚(yáng)子江河口三角洲鹽沼濕地硫酸鹽還原菌種群多樣性及數(shù)量在互花米草的生長(zhǎng)后期（秋冬季）達(dá)到最高[38]。本研究進(jìn)一步證明了鹽沼濕地可培養(yǎng)SRB種群數(shù)量隨季節(jié)變化較大，但季節(jié)對(duì)各個(gè)取樣點(diǎn)中SRB的種群多樣性影響不大。

通過(guò)比較不同深度土壤SRB數(shù)量，發(fā)現(xiàn)淺層土壤（0～5 cm）的SRB種群數(shù)量高于深層土壤（5～10 cm）。此外，土壤基質(zhì)的性質(zhì)也會(huì)對(duì)土壤中SRB種群產(chǎn)生一定的影響，例如土壤含水量、pH值、離子濃度、有機(jī)質(zhì)含量等。大米草、互花米草定植土壤中的碳、氮、硫含量及SO42-濃度均明顯高于光灘，這些營(yíng)養(yǎng)元素及底物濃度的增加可能是導(dǎo)致米草定植土壤SRB種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量顯著高于光灘土壤的主要原因。Wang等也報(bào)道了類似的現(xiàn)象，認(rèn)為互花米草通過(guò)提高土壤中有機(jī)碳含量而促進(jìn)SRB種群數(shù)量的增加[39]。土壤性質(zhì)對(duì)硫酸鹽還原菌的種群構(gòu)成也有一定影響，大米草土壤含水量高于互花米草、光灘土壤，對(duì)應(yīng)的Pseudomonas、Agromyces、Bacillus屬的比例也較高；互花米草土壤中SO42-濃度明顯高于大米草、光灘土壤，對(duì)應(yīng)的Halomonas、Oceanimonas、Rhizobium屬的比例也較高，這與不同種類微生物生長(zhǎng)所需理化條件不同有關(guān)。據(jù)報(bào)道，海水及海岸鹽沼濕地中典型SRB的最適pH值為7.0～7.8[40]，而取樣點(diǎn)土壤pH值為8.4左右，這就可能造成當(dāng)?shù)赝寥浪釅A度不適宜典型厭氧SRB生長(zhǎng)，因此在本研究中未分離到?？傊?，射陽(yáng)鹽沼濕地土壤理化性質(zhì)的特殊可能造成了該地SRB種群結(jié)構(gòu)的特異性。

土壤微生物種群結(jié)構(gòu)及數(shù)量還受到定植植物品種影響[41]。米草的定植一方面提高了SRB的種群數(shù)量，另一方面又使土壤SRB的種群多樣性提高。不同種類米草定植對(duì)土壤中SRB種群結(jié)構(gòu)影響不同，如互花米草定植后Aeromonas、Dietzia、Sporosarcina屬才在土壤中出現(xiàn)，而Tetrathiobacter只存在于大米草土壤。又如，大米草定植使Bacillus屬比例明顯升高，而使Rhizobium屬比例明顯降低，互花米草定植使Halomonas屬比例明顯升高而使Micrococcus屬比例明顯降低?？梢姴煌参锒ㄖ矊?duì)不同的SRB種群有影響。不同植物的定植會(huì)影響土壤理化性質(zhì)，從而形成特定的生境系統(tǒng)，進(jìn)而影響微生物種群結(jié)構(gòu)[42]，因此不同類型米草的定植就形成了當(dāng)?shù)刂参?土壤系統(tǒng)的特異性，從而綜合影響SRB種群。

總之，鹽沼濕地土壤中SRB種群數(shù)量及分布受多種因素的影響，植物種類、季節(jié)變化以及深度等都會(huì)影響其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。今后有必要針對(duì)優(yōu)勢(shì)SRB類群，通過(guò)定量PCR技術(shù)和酶活檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步評(píng)估鹽沼濕地SRB在元素硫循環(huán)中的作用，探討SRB的生態(tài)學(xué)效應(yīng)。

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