徐明龍+郭保平+胡進+牛亞茹+肖成+徐銀學

摘要：研究玉米赤霉烯酮（ZEA）體外對原代大鼠睪丸支持細胞（sertoli cell）增殖相關基因波形蛋白（vimentin）和細胞周期蛋白D1（CCND1）表達及對氧化應激中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力的影響。體外分離培養(yǎng)原代大鼠睪丸支持細胞，不同濃度的ZEA作用細胞20 h，采用MTT法檢測細胞活力，熒光定量PCR檢測Vimentin、CCND1基因mRNA的表達，Westblot檢測其蛋白的表達，并且檢測細胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-PX活力。結果表明：與對照組相比，Vimentin、CCND1 mRNA表達量都隨著ZEA濃度的升高而降低，但是Vimentin蛋白表達量卻沒有明顯變化，CCND1蛋白表達量和mRNA表達量一致。SOD活性、GSH-PX活性均隨著ZEA濃度的升高呈現(xiàn)增高趨勢。結果表明，ZEA對體外培養(yǎng)大鼠支持細胞具有生殖毒性作用，影響Vimentin、CCND1的表達調控，導致細胞產生氧化應激效應從而使SOD與GSH-PX活性產生變化。

關鍵詞：玉米赤霉烯酮；原代睪丸支持細胞；波形蛋白；周期蛋白D1；氧化應激酶

中圖分類號：Q786

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0299-05

玉米赤霉烯酮（ZEA）別稱F-2毒素，是由鐮刀菌產生旳一種霉菌毒素，并且是一種類雌激素毒素。ZEA最初于1962年從污染了禾谷鐮刀菌的發(fā)霉玉米中分離得到，1966年正式定名[1-2]。鐮刀菌主要侵害玉米、小麥、燕麥、大麥等作物，產生的ZEA具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性，對腫瘤發(fā)生也有一定影響，對人、動物健康具有潛在危害，日益受到人們重視。ZEA在全世界范圍內均有發(fā)現(xiàn)，甚至在人們的食物中也能檢測到ZEA的存在[3]。睪丸支持細胞作為生精細胞的支架，能夠分泌雄激素結合蛋白以及產生類固醇類，為生精細胞提供充足的雄性激素和必需的營養(yǎng)物質，同時還能保證血睪屏障和體內微循環(huán)、精子的發(fā)育和成熟，從而調節(jié)生殖系統(tǒng)的功能[4]。所以，支持細胞受到損傷會直接影響精原細胞、精母細胞、精子細胞失去發(fā)育和成熟的營養(yǎng)保證，導致各級生精細胞數(shù)量減少、結構改變、細胞核模糊、細胞器減少等[5]，從而使雄性生殖系統(tǒng)出現(xiàn)問題，精子活力、數(shù)目出現(xiàn)異常，導致雄性不育不孕。由此可見，睪丸支持細胞是研究雄性生殖系統(tǒng)毒性的范細胞。本試驗通過研究ZEA對體外培養(yǎng)的睪丸支持細胞增殖相關基因Vimentin、CCND1表達以及氧化應激酶（SOD，GSH-PX）的影響，探討ZEA對雄性動物生殖功能的毒性作用和機理。

1 材料與方法

1.1 材料

24日齡左右的清潔級雄性SD大鼠（南京市江寧區(qū)青龍山動物飼養(yǎng)場），ZEA（Sigma公司），DMEM/F12培養(yǎng)液，PBS緩沖液（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），膠原酶I（MP Biomedicals），胎牛血清（Gibco公司），Tris-HCl（Sigma公司），細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），Real-time PCR Master Mix （TaKaRa公司），二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司），TRIzol （TaKaRa公司），SYBR Green Master Mix（Vzayme公司），MTT檢測試劑盒（杭州碧云天），油紅O染料；超氧化物歧化酶（SOD）；GSH-PX檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液（杭州碧云天公司），寡核苷酸引物由南京金維智有限公司合成。

1.2 原代大鼠睪丸支持細胞分離和培養(yǎng)[6-7]

采用頸椎脫臼法處死大鼠，將其全身浸泡于消毒乙醇后于無菌條件下取出睪丸，放入預冷的PBS中，剝離被膜、血管，隨后PBS液沖洗2次。用眼科剪將曲細精管剪成約 1 mm3 碎塊，轉移至15 mL 離心管中；加入0.25% 胰酶和 0.1% 膠原酶Ⅰ各2 mL，37 ℃ 水浴振蕩消化約30 min（觀察到組織碎塊消化至黏液狀為準），加入2 mL含有血清的培養(yǎng)基吹打均勻，經(jīng)100 μm篩網(wǎng)過濾后離心，去除上層清液。PBS洗1次后加入培養(yǎng)基 （DMEM/F12、15%胎牛血清、青霉素 100 U/mL、鏈霉素 100 U/mL），吹打細胞成細胞懸液；臺盼藍染色，計算細胞數(shù)，調整細胞密度為 3×105～5×105個/mL，接種于六孔培養(yǎng)板中，置于 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（95% 空氣和 5% CO2，溫度37 ℃），48 h后加入適量 20 mmol/L Tris-HCL （pH值 7.0）處理少許附著生精細胞，繼續(xù)培養(yǎng)備用，隔天換液 1 次[8]。

1.3 油紅O染色鑒定支持細胞[9]

Tris-HCl處理生精細胞24 h，吸取培養(yǎng)基后用 PBS沖洗1次；加入4%多聚甲酸固定30 min；滴加油紅O染液，室溫染色15～30 min；用濃度為75%的乙醇清洗多余染料；蘇木素復染10～15 min，滴管吸取水洗至其變?yōu)樗{色，在光學顯微鏡下觀察、拍照、記錄。

1.4 ZEA對睪丸細胞的作用

將ZEA溶解于DMSO中，將純化后的細胞培養(yǎng)24 h，換含有ZEA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，終濃度為0、 50、 100、 125、 150 μmol/L，DMSO在每組中濃度不超過0.1%。

1.5 MTT檢測細胞活性

將“1.2”節(jié)中提取的支持細胞培養(yǎng)24 h，加入適量 20 mmol/L Tris-HCL （pH值 7.0）處理少許附著生精細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的ZEA（0、 50、 80、 100、 125、 150 μmol/L以及0.1%DMSO）100 μL培養(yǎng)20 h后，加入 20 μmol/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后終止培養(yǎng)，小心吸取孔內的培養(yǎng)液，每孔加入150 μmol/L DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測儀D490 nm處測量各孔的吸光度。設置調零空白孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），每個濃度組至少6個相同重復孔。0 μmol/L為標準組，其余濃度為試驗組。計算公式如下：細胞活力=D試驗-D空白D標準-D空白×100%。

1.6 熒光定量PCR檢測相關基因mRNA水平的表達

將“1.4”節(jié)中用ZEA不同濃度培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)20 h，按照傳統(tǒng)TRIzol法提取細胞總RNA，D260 nm/D280 nm值為1.9～2.0，按照試劑盒說明書進行反轉錄，產物-20 ℃保存。引物見表1。定量儀器為StepOne，反應體系（20 μL）為：2 μL cDNA 模板，0.4 μL 上游引物，0.4 μL 下游引物，0.4 μL Rox，10 μL Taq MasterMix酶，6.8 μL DEPC水。反應條件為：95 ℃ 預變性5 min；循環(huán)反應95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。融解曲線條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.7 Westblot檢測相關基因蛋白水平的表達

將“1.4”節(jié)中用ZEA不同濃度培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)20 h，用RIAP裂解緩沖液提取細胞總蛋白，蛋白定量后取總蛋白 15～30 μg 進行SDS-PAGE電泳，將電泳后分離的蛋白電轉至硝酸纖維素膜上，5%BSA封閉2 h，分別加Vimentin、CCND1（Santa Cruz Biotechnology，1 ∶500 TBST-BSA稀釋）和 β-actin（Cell Signaling Technologies，1 ∶1 000 TBST-BSA稀釋）兔抗鼠抗體，4 ℃ 過夜，TBST 洗 3次，每次 15 min。加入HRP 標記的羊抗兔IgG，室溫下反應2 h，TBST 洗3次，每次 15 min。ECL 發(fā)光壓片顯色，掃描并分析圖像。

1.8 氧化應激指標測定

將“1.4”節(jié)中培養(yǎng)的細胞上清液收集于2 mL EP管中，SOD檢測反應通過黃嘌呤以及黃嘌呤氧化物反應系統(tǒng)產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見分光光度計在550 nm處測其吸光度。SOD計算公式為：SOD=D對照組-D測定組D對照組×68 U/mL。

將“1.4”節(jié)中培養(yǎng)的細胞上清液收集于2 mL EP管中，GSH-PX 可以促進過氧化氫（H2O2）與還原性谷胱甘肽反應生成H2O以及氧化性谷胱甘肽（GSSG），可用其酶促反應速度來表示谷胱甘肽過氧化物的活性，測定此酶促反應中還原性谷胱甘肽的消耗，可求出酶活力。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基甲酸陰離子呈現(xiàn)穩(wěn)定的黃色，在 412 nm 處測定其吸光度。GSH-PX計算公式為：GSH-PX=D非酶管-D酶管D標準管-D空白管×20×5酶活力單位。

1.9 統(tǒng)計學分析

各試驗重復3次，采用SPSS 20統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行多組間差異分析。

2 結果與分析

2.1 油紅O鑒定支持細胞結果

如圖1所示，鏡下可見支持細胞胞體呈寬大的不規(guī)則狀，有粗大的突起，細胞成簇，細胞質內可見小吞噬物或小空泡，核大，呈藍色，卵圓形或不規(guī)則形，核質均勻。細胞質中有大小不等的紅色脂滴，此為支持細胞的特異性標志之一[9]。

2.2 ZEA對大鼠睪丸支持細胞細胞形態(tài)的影響

如圖2所示，純化后的細胞用ZEA培養(yǎng)20 h，ZEA濃度分別為0、50、 80、100、125、150 μmol/L，電鏡觀察細胞形態(tài)變化，可見ZEA濃度為100 μmol/L時，部分細胞開始皺縮；當ZEA濃度為150 μmol/L時，細胞形態(tài)變化明顯，細胞基本皺縮，漂浮死細胞數(shù)量顯著增多。

2.3 ZEA對大鼠睪丸支持細胞活力的影響

如圖3所示，不同濃度ZEA培養(yǎng)細胞20 h，采用MTT方法檢測處理細胞的活力?？梢钥闯觯S著ZEA濃度升高，細胞活力呈現(xiàn)降低的趨勢，在150 μmol/L濃度下，細胞活力只有40%左右。0 μmol/L作為空白對照組，0.1% DMSO作為陰性對照組。

2.4 增值基因表達檢測結果

支持細胞Vimentin、CCND1基因表達結果見圖4與圖5，原代大鼠睪丸支持細胞經(jīng)不同濃度ZEA處理后Vimentin、CCND1表達差異具有統(tǒng)計學意義。但是Vimentin蛋白和mRNA的表達量趨勢并不一致。Vimentin蛋白表達量隨著ZEA濃度的提高并沒有明顯變化。

2.5 氧化應激指標測定結果

如圖6、圖7所示，大鼠睪丸支持細胞培養(yǎng)24 h后細胞培養(yǎng)液中SOD和GSH-PX檢測皆有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。尤其是在高濃度ZEA處理下，不管是SOD還是GSH-PX都具有增加趨勢。

3 結論與討論

ZEA在結構上與內源雌激素17p-雌二醇（E2）相似[10]，在活化ER-受體上的特征相似，能發(fā)揮雌激素樣作用，ZEA與ER受體（雌激素受體）發(fā)生競爭性結合，通過激活雌激素反應元件，使雌激素受體發(fā)生二聚化，進而發(fā)生一系列的類似雌激素效應，擾亂生殖激素的正常分泌，對動物的繁殖機能造成嚴重危害，可導致家畜、家禽雌激素水平明顯提高。研究表明，ZEA主要作用于生殖系統(tǒng)，對雌性動物、雄性動物都能產生危害。ZEA中毒后，雌性動物生殖系統(tǒng)主要表現(xiàn)為乳頭腫大、陰唇紅腫、子宮增大、假孕、不孕、胚胎骨豁發(fā)育畸形、死胎、流產以及出現(xiàn)持續(xù)無卵性發(fā)情期。雄性動物生殖系統(tǒng)主要表現(xiàn)為睪丸萎縮、乳頭腫大、包皮水腫、精液濃度降低、質量下降等癥狀以及不同程度損傷的精原細胞、精母細胞[11]。

生精上皮中，能與生精細胞相接觸的細胞只有睪丸支持細胞，同時它也是生精細胞的“保姆細胞”。在結構上它對生精細胞起到支架作用，促進其發(fā)育、成熟，為生精過程供給不可缺少的營養(yǎng)物質，同時還能協(xié)調生精細胞保證其正常進行精子發(fā)育、成熟等過程[12]。在精曲小管基底部和管腔之間的各級生精細胞按照發(fā)育、成熟的程度排列，支持細胞是提供給管腔外側生精細胞營養(yǎng)的唯一來源。為了防止生精細胞和精母細胞的抗原與體內的抗體相接觸，睪丸支持細胞之間形成了血睪屏障，從而阻止免疫反應產生[12]。

細胞骨架系統(tǒng)是真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，支持細胞具有完整和高度組織化的細胞骨架系統(tǒng)，對生精細胞增殖和精子生成具有重要意義。中間纖維是支持細胞骨架的重要組成部分，主要由波形蛋白（vimentin）組成[13-14]，在細胞中主要作為結構蛋白起作用[15]。在細胞凋亡過程中，Vimentin 很快被水解，其裂解是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）或是被該酶激活的一組蛋白酶所介導。睪丸支持細胞間形成緊密連接，參與形成血睪屏障，Vimentin 在支持細胞緊密連接中具有重要作用，可能參與血睪屏障功能，對維持生精上皮的完整性有重要意義，促進支持細胞和生精細胞間的物質和信息交換，精子發(fā)生并支持細胞功能的發(fā)揮。Vimentin 的降解可使支持細胞的營養(yǎng)和支持功能受到破壞，導致生精細胞與生精上皮分離，生殖細胞凋亡增加。本試驗結果表明，隨著ZEA濃度的增加，Vimentin的mRNA表達量明顯減少，蛋白水平上各個濃度卻沒有明顯變化。由此推測ZEA隨著濃度的提高刺激細胞內環(huán)境的變化從而刺激Vimentin的表達，在翻譯水平上，可能細胞通過別的通路和手段補償性合成Vimentin，在高濃度ZEA的影響下，細胞活力顯著降低，死細胞增多，活細胞雖然形態(tài)發(fā)生變化，可是結構依然存在，在每個毒素濃度組中蛋白濃度差不多的情況下，Vimentin最終的蛋白表達量沒有明顯變化，細胞還維持著相對的功能和結構，具體的機理還有待研究。

細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經(jīng)歷的全過程，分為間期（G1、S、G2期）與分裂期（M期）2個階段。1983年，Evans等首次在海洋無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)一組蛋白質呈周期性出現(xiàn)，并調節(jié)細胞的生長，因此將其確定為細胞周期蛋白（cyclin），細胞周期蛋白D1（CCND1）是該基因編碼的蛋白質，屬于高度保守的周期蛋白家族，該家族成員的顯著特征是貫穿細胞周期，其蛋白質豐度周期性，急劇改變[16]。周期蛋白作為CDK（周期蛋白依賴性激酶）的調節(jié)因子，CCND1調節(jié)細胞的增殖、生長、分化[17]，生命個體細胞周期的關鍵是G1期的啟動，CCND1是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白，是比其他cyclins更加敏感的指標[18]。G1期是細胞在增殖過程中能接受從外界傳入的增殖或抑制增殖信號的唯一時期，因此研究CCND1對細胞周期調控至關重要。目前，CCND1已被公認為是一種原癌基因，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化[19]。本研究結果表明，隨著ZEA濃度的升高，CCND基因的mRNA和蛋白表達量皆顯著降低，可見ZEA嚴重影響睪丸支持細胞的增殖，ZEA對細胞的毒性明顯，細胞活性明顯降低，導致大量細胞凋亡與壞死，抑制CCND1表達，導致細胞周期變長，變相導致細胞死亡加速。

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡，是由自由基在體內產生的一種負面作用，并被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。SOD是源于生命體的活性物質，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質。SOD幾乎存在于所有生物細胞中，通過把 O-2· 轉化為 H2O2，H2O2再被過氧化氫酶和氧化物酶轉化為無害的水（H2O），從而達到清除細胞內氧自由基，保護細胞的目的。研究表明，對人體不斷補充SOD具有抗衰老的特殊效果，可以清除超氧陰離子自由基從而保護細胞免受損傷[20-21]。本試驗結果表明，隨著ZEA濃度的升高，細胞培養(yǎng)液中SOD活力顯著增高，說明ZEA可以刺激睪丸支持細胞產生氧化應激作用?？赡苁荶EA高濃度（150 μmol/L）下細胞破碎裂解嚴重，細胞內的SOD釋放到培養(yǎng)液中，從而使其SOD活力增加，具體的機理有待進一步研究。GSH-PX是在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)的第一個含硒酶，在機體內以硒代半胱氨酸（S）的形式發(fā)揮作用，以谷胱甘肽為還原劑分解體內的脂質過氧化物，可以防止細胞膜和其他生物組織免受過氧化損[22] 。GSH-PX的作用是和SOD、過氧化氫酶（CAT）一起共同構成生物體內活性氧防御系統(tǒng)。機體對活性氧 O-2· 的第一道防線是SOD，它將 O-2· 轉化為過氧化氫和其他氫過氧化物；第二道防線是CAT和GSH-PX，其中CAT可清除過氧體系中的H2O2，GSH-PX分布在細胞的胞液和線粒體中，可同時清除H2O2和氫過氧化物，從而有效地保護機體[23]。本研究結果表明，隨著ZEA濃度的增加，細胞培養(yǎng)液中GSH-PX酶活力顯著增加，證明ZEA能產生氧化應激作用，細胞分泌更多的GSH-PX來應對氧化應激帶來的負面影響。

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