趙興華+裴新輝+楊佳明+趙夢姝

摘要：以皮蘭德龍和索邦為親本進(jìn)行百合雜交育種，探討親本的花粉活力，并進(jìn)行正反交試驗(yàn)，比較正反交的結(jié)實(shí)率，通過胚培養(yǎng)技術(shù)在克服受精后障礙的應(yīng)用，同時比較不同培養(yǎng)基對雜交胚生長效果的影響。結(jié)果表明：2個百合品種常規(guī)雜交，無論正反交授粉都不能得到雜交種子；采用切割柱頭授粉方式，其雜交的子房膨大率均值達(dá)51%；離體胚培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基含5%蔗糖、0.2 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：百合；雜交；胚培養(yǎng)

中圖分類號： S682.2+65.036

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

百合是單子葉植物亞綱百合科（Liliaceae）百合屬（Lillium）所有植物種類的總稱，百合均為多年生草本植物。目前，全球約有115種百合，中國已發(fā)現(xiàn)55種、18個變種，占世界百合屬植物的50%[1]。目前，全球用于切花生產(chǎn)的百合栽培品種大約有500多種[2]，多為品系內(nèi)或品系間雜交培育而成的品種。20世紀(jì)初，國外以荷蘭、日本、美國為中心開展了百合的育種工作，利用其優(yōu)良的東方系、麝香系、亞洲系進(jìn)行組間和種間雜交，培育出具有良好商業(yè)性狀的百合新品種，由此推出百合的OT和LA系列雜交新品種[3-5]。目前，市場上主要的百合切花集中在5個百合品系上：亞洲系（Asiatic hybrids）、東方系（Oriental hybrids）、麝香系（Longiflomm hybrids）、OT型、LA型等。在百合種間雜交育種實(shí)踐中，經(jīng)常把胚培養(yǎng)技術(shù)作為克服雜交后障礙的有效手段，至今通過胚培養(yǎng)獲得的百合種間雜交種有100余個[6-7]。中國對百合雜交后代的培育，僅局限于其野生種質(zhì)的種間雜交，目前也沒有獲得具有商業(yè)價值的百合新品種推廣應(yīng)用。本研究通過對LA型和東方系（O型）進(jìn)行組間雜交，采用常規(guī)授粉和切割花柱授粉方式以及離體胚搶救技術(shù)來克服其受精前后障礙，以期獲得LAO新型的百合雜交種。

1 材料與方法

1.1 材料

以百合雜交品種LA型/皮蘭德龍（Pirandello）與東方百合索邦（Sorbonne）為本研究的試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 雜交親本花粉生活力測定 在盛花期選取當(dāng)天開放的花朵，待花粉散開后采集不同植株上的花粉，用毛筆蘸上待測花粉接種在花粉萌發(fā)培養(yǎng)基[8]（100 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂 +0.02 g/L硼酸，調(diào)pH值至5.8）上，涂抹1薄層，12 h后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)不同品種花粉萌發(fā)率。在視野內(nèi)隨機(jī)數(shù)100粒清晰無重疊的花粉，萌發(fā)的按1下計(jì)數(shù)器，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)百分率，連續(xù)統(tǒng)計(jì)2次。

萌發(fā)率=（萌發(fā)花粉數(shù)/觀測花粉總數(shù)）×100%。

1.2.2 授粉 雜交授粉采用常規(guī)和非常規(guī)的方法。常規(guī)授粉是將花粉直接授在柱頭上，非常規(guī)授粉為切割柱頭授粉。切割柱頭授粉是將柱頭切掉，直接授粉于花柱上。

1.2.3 胚培養(yǎng) 授粉培養(yǎng)后50～60 d，取出膨大的子房，剝出其內(nèi)的胚珠（發(fā)育不完全的種子）進(jìn)行離體培養(yǎng)，分別置于含不同濃度蔗糖、6-BA和萘乙酸的1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其蔗糖濃度分別為3%、5%、7%，6-BA濃度分別為 0.1、02、0.3 mg/L，NAA濃度分別為0.01、0.02、0.03 mg/L，培養(yǎng)基中瓊脂含量為5 g/L，調(diào)節(jié)其pH值為5.8。進(jìn)行3周暗培養(yǎng)（溫度為25 ℃）后，在 1 500 lx LED燈下進(jìn)行全天光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度仍為25 ℃，培養(yǎng)3周；此后再次調(diào)整培養(yǎng)的光照時間，20：00將LED燈打開，至08：00關(guān)閉，使其保持12 h 的光照。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本花粉活性及正反交的結(jié)實(shí)率

東方系的索邦花粉萌發(fā)率高，達(dá)78.6%，而LA雜交系的皮蘭德龍花粉萌發(fā)率低，僅為8.3%。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，索邦花粉粒飽滿，而皮蘭德龍大部分的花粉粒發(fā)育不良，但也觀察到飽滿且發(fā)育良好的花粉粒。以皮蘭德龍、索邦為親本進(jìn)行正反交試驗(yàn)，2個組合各授粉100朵，授粉后1周左右，子房出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，敗育子房表現(xiàn)出子房前端有所膨大，沒有膨大的后端陸續(xù)開始枯黃萎蔫脫落。60 d后全部敗育，其中有膨大的子房，解剖后未得到有胚種子，呈現(xiàn)假膨大現(xiàn)象。

2.2 不同授粉方式對雜交結(jié)實(shí)的影響

為克服授精障礙采取非常規(guī)授粉方法是很有效的。2個百合品種在切割柱頭授粉方式下，其雜交的子房膨大率均值達(dá)到51%，且獲得有胚的種子。而作為對照常規(guī)授粉的母本，在其子房膨大之前就出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象，8 d便開始枯萎，不能得到正常發(fā)育的種子。2個百合品種以切割柱頭授粉方式的種子結(jié)實(shí)率較高（表1）。

2.3 不同蔗糖和激素濃度培養(yǎng)基對雜交種子培養(yǎng)的影響

從表2可以看出，培養(yǎng)基的蔗糖濃度對雜交組合種子培養(yǎng)的影響較明顯，其中含5%蔗糖的培養(yǎng)基最適宜百合雜交組合種子的培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基所用6-BA濃度為 0.2 mg/L、NAA的濃度為0.01 mg/L時，其種子成活率比較高。蔗糖含量為6%～8%時，幼胚的胚性生長情況最好，褐變率最低，在培養(yǎng)中，早熟萌發(fā)數(shù)隨蔗糖含量的增加而降低，這是由于高滲透壓阻止離體未成熟胚早熟萌發(fā)作用所致[9]。本研究結(jié)果表明，百合雜交組合的種子在含5%蔗糖培養(yǎng)基中其成活率均在50%以上，比較適合其種子的生長發(fā)育。因此，最佳培養(yǎng)基的蔗糖濃度為5%，6-BA濃度為 0.2 mg/L，NAA濃度為0.01 mg/L。

3 結(jié)論與討論

在百合雜交品系的研究中，國外對其AO、OT、LA進(jìn)行過組間雜交，但未見LA×O型雜交新種質(zhì)的研究報道。本試驗(yàn)首次開展了此項(xiàng)研究，所選取的材料LA型/皮蘭德龍（Pirandello）具有生長周期短（11周）、抗倒伏、抗葉燒病和花朵品質(zhì)維持較好等優(yōu)點(diǎn)。而本身為雜交品種的東方百合索邦（Sorbonne）花呈淺粉色且花朵大、花型美麗、具香味、生長周期較長（16周）、不抗葉燒病、耐弱光等特點(diǎn)。期望結(jié)合二者的優(yōu)良性狀，培育出生長周期較短、抗倒伏、抗葉燒病、 耐弱光、具香味且花色、花型都比較豐富的百合新品種。本研究為皮蘭德龍和索邦雜交育種及具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新品種選育奠定了基礎(chǔ)。

在實(shí)驗(yàn)室的條件下采取離體胚搶救的方式對2個品種百合的雜交胚進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了雜種胚和種子。本研究采用子房膨大率、種子成活率作為其雜交親和力的判定指標(biāo)，從而篩選出離體胚培養(yǎng)材料的最適宜的消毒滅菌液和消毒滅菌時間，以及最佳的培養(yǎng)基和最佳授粉方式。即對其子房先用乙醇消毒0.5 min后，再采用火燎的方法，此法對其材料的污染率最低，含5%蔗糖、0.2 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA的培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，最適合其胚的培養(yǎng)；在以LA雜交系百合為母本的雜交中，采取切割花柱的方法能提高雜交成功率，得到有胚的雜交種子，研究結(jié)果為克服百合遠(yuǎn)緣雜交的不親和性找到了良好途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]穆 鼎. 觀賞百合[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：15-23.

[2]程金水. 園林植物遺傳育種學(xué)[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2000.

[3]Matsubara S. Overcoming the self-incompatibility of Lilium longiflorum Thunb. by application of flower-organ extract or temperature treatment of pollen[J]. Euphytica，1981，30（1）：97-103.

[4]Okazaki K，Asano Y，Oosawa K. Interspecific hybrids between Lilium-‘Oriental，hybrid and L.‘Asiatic hybrid by embryo culture with revised media[J]. Breeding Science，1994，44：59-64.

[5]Okazaki K，Kunishige M. Introduction of the characteristics of Lilium concodor into L.בAsiatic hybrids by crossing through style-cutting pollination and embryo culture[J]. J Japan Soc Hort Sci，1994，63（4）：825-833.

[6]van Tuyl J M. Overcoming interspecific crossing barriers in lilium by ovary and embryo culture[J]. Acta Hort，1990，266：317-322.

[7]屈云慧，陳衛(wèi)民，吳學(xué)尉，等. 離體胚培救技術(shù)在百合育種中的應(yīng)用[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，19（2）：207-210，219.

[8]年玉欣，羅鳳霞，張 穎，等. 測定百合花粉生命力的液體培養(yǎng)基研究[J]. 園藝學(xué)報，2005，32（5）：922-925.

[9]李浚明. 植物組織培養(yǎng)教程[M]. 北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992：221-223.孫 梅，張維娜，高 亮，等. 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA的分離鑒定及對病原菌拮抗特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：275-279.