滕紅梅+昝亞玲+賈鵬+王玲麗+房敏峰+胡正海

摘要：通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定不同產(chǎn)地黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，以期為黃芪藥材質(zhì)量評(píng)定提供依據(jù)。采用Waters Symmetry C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm ），流動(dòng)相為乙腈-水（81 ∶19），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。結(jié)果表明：毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度在0.145 6～0.698 7 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 7，平均加樣回收率為100.35%，RSD為1.98%，所建方法快速、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好。4個(gè)省份16個(gè)產(chǎn)地藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量差異較大，其中內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市所產(chǎn)黃芪中其含量最高。從各地平均值看，內(nèi)蒙古自治區(qū)>山西省>甘肅省>黑龍江省，且內(nèi)蒙古自治區(qū)與其他3個(gè)省份藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異顯著。省內(nèi)之間的差異顯著性結(jié)果表明，內(nèi)蒙自治區(qū)和山西省產(chǎn)地之間差異較大，甘肅省和黑龍江省產(chǎn)地之間差異較小。

關(guān)鍵詞：黃芪；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；HPLC

中圖分類號(hào)： S567.01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0226-03

黃芪為著名滋補(bǔ)中藥，是豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.]的干燥根?，F(xiàn)代藥理研究表明：黃芪具有斂瘡生肌、延緩衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能[1]。諸多研究證明，黃酮類作為黃芪中的主要成分之一，其抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等多方面的藥理作用非常顯著[2-6]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為黃芪藥材中黃酮類的主要成分，已被2010版《中國(guó)藥典》作為黃芪藥材的指標(biāo)性成分[1]。

黃芪分布于華北、東北及西北地區(qū)。目前市場(chǎng)上的黃芪藥材產(chǎn)地較廣，品質(zhì)差異較大[7-8]。本研究通過(guò)對(duì)黃芪4個(gè)主產(chǎn)省份山西省、內(nèi)蒙自治區(qū)、黑龍江省、甘肅省16個(gè)不同產(chǎn)地藥材中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)行測(cè)定，并運(yùn)用SSR法比較不同產(chǎn)地黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的差異大小，研究結(jié)果可為黃芪藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 儀器、材料和試劑

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀、2998 PDA檢測(cè)器、RE-52AA 系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器、SHZ-DIII循環(huán)水式多用真空泵、FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)、FA1004電子天平、DK-S24電熱恒溫水浴鍋、GF-101型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 材料

黃芪藥材分別購(gòu)于山西省、內(nèi)蒙自治區(qū)、黑龍江省、甘肅省等當(dāng)?shù)厮幉氖袌?chǎng)，共4個(gè)省16個(gè)不同產(chǎn)地的黃芪，經(jīng)運(yùn)城學(xué)院滕紅梅教授認(rèn)定均為黃芪藥材。將藥材置于40 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干燥，研成粉末過(guò)60目篩保存以備用。

1.3 試劑

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：20141109）；水為二次重蒸水，甲醇和乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 Waters公司Symmetry C18 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相水-乙腈（81 ∶19）；柱溫，30 ℃；流速，1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)，260 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品6.950 mg置10 mL容量瓶中。加甲醇溶解、搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 將精確稱取的2 g黃芪粉末置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，于80 ℃水浴鍋中加熱回流4 h，待放涼后再搖勻過(guò)濾，濾渣用10 mL甲醇洗滌2～3次，之后將原液與洗滌液合并，減壓回收溶劑后將殘?jiān)蛹状既芙?，再轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻后用微孔濾膜過(guò)濾，即得到供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取毛蕊異黃酮苷對(duì)照品溶液 1 000 μL，加入濾過(guò)的甲醇2 000 μL，再用微孔濾膜濾過(guò)，置于樣品瓶中。按“2.1.1”節(jié)的色譜條件分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為y=3.80×107 x+1.06×106，r=0.999 7，線性范圍0.145 6～0.698 7 mg/mL。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精確吸取山西省渾源市同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.46%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山西省渾源市同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h檢測(cè)，顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.20%。

2.1.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取產(chǎn)自山西省渾源市的藥材粉末平行樣品5份，按“2.1.3”節(jié)的制備方法操作，顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.67%，平均含量為 0.234 mg/g，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 稱取含量已知的同一批樣品5份，每份約0.5 g，依次加入濃度為0.133 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液4 mL。按“2.1.3”節(jié)方法配制樣品溶液，并于“2.1.1”節(jié)色譜條件下進(jìn)樣，根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算出各對(duì)照品的平均加樣回收率。計(jì)算所得回收率為100.35%，RSD為 1.98%。

2.1.9 樣品含量測(cè)定 精確量取樣品溶液按照“2.1.1”節(jié)的色譜條件測(cè)定其峰面積，根據(jù)“2.1.2”節(jié)得出的回歸方程計(jì)算不同產(chǎn)地黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。

2.2 試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同產(chǎn)地黃芪藥材毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量比較 由表1可見(jiàn)，4省份16個(gè)不同產(chǎn)地的黃芪藥材中內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高，為 1.312 mg/g，山西省安澤市黃芪中含量最少，為 0.230 mg/g，包頭市藥材的含量是安澤市藥材的5.7倍，差別較為懸殊。含量最少的安澤黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量也是《中國(guó)藥典》中規(guī)定最低含量0.020%的10倍以上。

2.2.2 SSR法分析不同產(chǎn)地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異 由圖2可以看出，內(nèi)蒙古自治區(qū)來(lái)源藥材的毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量最高，甘肅省藥材含量最低，4個(gè)省份來(lái)源藥材結(jié)果為：內(nèi)蒙古自治區(qū)>山西省>甘肅省>黑龍江省，其含量平均值依次為：0.690、0.361、0.300、0.273 mg/g。運(yùn)用DPS軟件中SSR法分析4個(gè)省份不同產(chǎn)地黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的差異，結(jié)果表明：內(nèi)蒙古自治區(qū)來(lái)源藥材和其他3個(gè)省份之間差異顯著（P<0.05），其3個(gè)省份之間含量相對(duì)接近，山西省和黑龍江省間差異顯著，山西省和甘肅省、甘肅省和黑龍江省間差異不顯著。

由圖3可以看出，內(nèi)蒙古自治區(qū)的4個(gè)產(chǎn)地來(lái)源中，包頭市藥材含量最高，呼倫貝爾市藥材含量最低：包頭市和呼和浩特市與其他產(chǎn)地差異呈顯著水平，赤峰市和呼倫貝爾市差異不顯著。

由圖4可以看出，在山西4個(gè)產(chǎn)地中，安澤的含量最低，應(yīng)縣的含量最高，表明不同產(chǎn)地藥材的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異較為顯著。

由圖5可以看出，在甘肅的5個(gè)產(chǎn)地中，渭源的含量最低，宕昌的含量最高。宕昌與甘肅其他產(chǎn)地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量差異顯著，其他幾個(gè)產(chǎn)地的含量接近。

由圖6可以看出，黑龍江的3個(gè)產(chǎn)地中大興安嶺和長(zhǎng)白山、哈爾濱來(lái)源的藥材差異呈顯著水平，長(zhǎng)白山和哈爾濱來(lái)源的藥材差異不顯著。

3 結(jié)論

毛蕊異黃酮葡萄糖苷已經(jīng)被《中國(guó)藥典》作為衡量黃芪質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)標(biāo)志性成分。當(dāng)前，市場(chǎng)上的黃芪藥材產(chǎn)地較為混雜，主要來(lái)源地有山西、內(nèi)蒙古、甘肅及黑龍江等。本試驗(yàn)對(duì)4個(gè)黃芪主產(chǎn)省份16個(gè)產(chǎn)地的研究結(jié)果表明：產(chǎn)地不同黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量差異明顯，這一研究結(jié)果與劉楊等[7]及黃志勤等[9]對(duì)河北、河南、山西、內(nèi)蒙古等地黃芪藥材的研究結(jié)論相似，揭示毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異是造成各地黃芪藥材品質(zhì)不同的主要原因之一。

4個(gè)黃芪主產(chǎn)省份中，內(nèi)蒙古、山西、甘肅黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量整體較高，黑龍江平均含量較低，這與黃芪的道地產(chǎn)區(qū)為山西、內(nèi)蒙古和甘肅的傳統(tǒng)觀念相符。 4個(gè)省份不同產(chǎn)地的黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的差異顯著性結(jié)果表明，山西和內(nèi)蒙兩省份內(nèi)產(chǎn)地之間差異較大，甘肅和黑龍江兩省份內(nèi)產(chǎn)地之間差異較小。內(nèi)蒙古包頭和自治區(qū)內(nèi)其他3個(gè)產(chǎn)地之間的含量相差懸殊。說(shuō)明同為道地產(chǎn)區(qū)，黃芪藥材中的黃酮類有效成分含量差異較大，啟示我們?cè)u(píng)價(jià)藥材不能籠統(tǒng)以道地產(chǎn)區(qū)而論，要客觀評(píng)價(jià)藥材的品質(zhì)，需要科學(xué)合理地制定較為系統(tǒng)化的評(píng)價(jià)體系。

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