樊星 王淑婷 李春艷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

一株高效鐵錳氧化細(xì)菌P1的分離鑒定及氧化條件優(yōu)化

樊星 王淑婷 李春艷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

利用富集培養(yǎng)技術(shù)從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離得到1株能夠氧化鐵錳的細(xì)菌，命名為P1。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，將菌株P(guān)1鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。利用單因素實(shí)驗(yàn)探討菌株P(guān)1的生長(zhǎng)及氧化特性；采用響應(yīng)面分析方法考察接種量、溫度、pH值3個(gè)因素對(duì)菌株P(guān)1氧化特性的影響，進(jìn)一步優(yōu)化菌株的氧化條件。結(jié)果表明，菌株P(guān)1的最佳氧化條件：溫度28.54℃，pH7.23，接種量4.35%。在此條件下，菌株P(guān)1在錳含量為200 mg/L、鐵含量為800 mg/L的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，錳氧化率達(dá) 93%以上，鐵氧化率達(dá)100%。

鐵錳氧化；Bacillus cereus；分離鑒定；氧化條件；響應(yīng)面分析法

鐵、錳是地殼的主要構(gòu)成成分，廣泛分布于自然界中。地下水在徑流地下的過(guò)程中，由于化學(xué)作用、物理作用及生物作用溶解了不同濃度的鐵、錳離子以及其他物質(zhì)，地下水的優(yōu)良品質(zhì)受到了破壞［1］。我國(guó)北方地區(qū)地下水鐵、錳超標(biāo)相對(duì)于南方較嚴(yán)重，鐵、錳超標(biāo)的地區(qū)主要分布在松花江流域［2］。地下水中鐵、錳含量過(guò)高會(huì)帶來(lái)諸多危害，主要包括以下幾個(gè)方面：易使衣物染色，水有鐵腥異味，F(xiàn)e2O3等鐵質(zhì)沉淀物會(huì)滋長(zhǎng)鐵細(xì)菌，阻塞管道，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)紅水現(xiàn)象；作為造紙、紡織、印染、化工、食品等生產(chǎn)用水會(huì)降低產(chǎn)品質(zhì)量，腐蝕生產(chǎn)設(shè)備及用具；長(zhǎng)期飲用含鐵、錳量過(guò)高的水還會(huì)嚴(yán)重影響身體健康，造成胰腺、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病，甚至導(dǎo)致人體慢性中毒［3-6］。因此，含有過(guò)量鐵、錳的地下水，需要處理后才能滿足工業(yè)生產(chǎn)和人民生活的要求。

地下水除鐵、錳技術(shù)經(jīng)歷了從自然氧化法、接觸氧化法向生物氧化法的過(guò)渡階段。由于自然氧化法和接觸氧化法在實(shí)施過(guò)程中存在許多問(wèn)題，如操作流程復(fù)雜、處理成本高、運(yùn)行難度大，出水水質(zhì)不穩(wěn)定和易造成二次污染等弊端［7］，而生物氧化法由于具有效果好，運(yùn)行效果穩(wěn)定，無(wú)有毒副產(chǎn)物之患，投資少等優(yōu)點(diǎn)［8］更為人們所接受。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于生物氧化法的研究主要集中在鐵氧化菌、錳氧化菌的篩選上，而對(duì)于鐵錳氧化菌的篩選研究較少，且篩選出的菌株對(duì)于錳離子的去除效果不理想［9，10］。因此，有針對(duì)性地篩選具有高效鐵錳氧化能力的菌株，將其應(yīng)用于地下水處理過(guò)程具有重要意義。

本研究通過(guò)富集培養(yǎng)，采用特異性培養(yǎng)基從地下水井淤泥中篩選出具有高效鐵錳氧化能力的細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA序列分析等對(duì)其進(jìn)行鑒定，利用單因素實(shí)驗(yàn)探討菌株的生長(zhǎng)及氧化特性，采用響應(yīng)面分析法對(duì)該菌株的氧化條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

選用黑龍江省紅旗農(nóng)場(chǎng)富含高鐵高錳污染物的地下水井淤泥作為微生物富集培養(yǎng)來(lái)源。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，加去離子水至1 L，pH調(diào)至7.0。

PYCM改良培養(yǎng)基［11］：蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.3 g，酵母浸膏0.2 g，MnSO4·H2O 0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaNO30.2 g，CaCl20.1 g，（NH4）2CO30.1 g，檸檬酸鐵銨0.8 g，去離子水1 000 mL，pH6.8-7.2，滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂，濕熱滅菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 高效鐵錳氧化菌的富集與分離 無(wú)菌水稀釋泥樣，攪拌10 min，取0.2 mL稀釋液加入到100 mL的LB培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)液5 mL加入到100 mL的鐵離子濃度為80 mg/L，錳離子濃度為20 mg/L的PYCM改良培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min 的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)；然后每隔1周以10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入到新鮮的PYCM改良培養(yǎng)液中，并逐漸提高鐵錳離子濃度，至培養(yǎng)液中鐵離子濃度達(dá)到800 mg/L，錳離子濃度達(dá)到200 mg/L，如此馴化約2個(gè)月。

取0.1 mL混合樣涂布于PYCM改良培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)至有明顯單菌落。針對(duì)生長(zhǎng)良好的單菌落，于鐵離子濃度為800 mg/L，錳離子濃度為200 mg/L 的PYCM改良培養(yǎng)基固體平板上進(jìn)一步劃線培養(yǎng)，分離純化3-4次，獲得純化后的多株鐵錳氧化菌株。將菌株回接于PYCM改良培養(yǎng)液中，驗(yàn)證是否對(duì)鐵、錳離子有氧化能力［12］。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中鐵錳離子含量、比較所得功能菌株的氧化能力，篩選出1株高效鐵錳氧化菌，命名為P1，并將其接種于PYCM改良斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，待長(zhǎng)出明顯菌落后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

鐵/錳氧化率的計(jì)算公式如下：

式中，氧化率總鐵/總錳：培養(yǎng)基接種培養(yǎng)后Fe2+/ Mn2+的總氧化率；氧化率對(duì)照組：未接種菌株培養(yǎng)基中Fe2+/ Mn2+氧化率；d（Fe2+/ Mn2+）初始：培養(yǎng)基中初始的Fe2+/ Mn2+質(zhì)量濃度（mg/L）；d（Fe2+/ Mn2+）剩余：接種培養(yǎng)基中剩余Fe2+/ Mn2+質(zhì)量濃度（mg/L）；d（Fe2+/ Mn2+）對(duì)照剩余：對(duì)照組培養(yǎng)基中剩余Fe2+/ Mn2+質(zhì)量濃度（mg/L）；氧化率鐵/錳：培養(yǎng)基中菌株生物氧化作用的Fe2+/ Mn2+氧化率。

1.2.2 高效鐵錳氧化菌的鑒定［13］

1.2.2.1 高效鐵錳氧化菌的形態(tài)觀察 將高效鐵錳氧化菌P1采用平板涂布法接種于PYCM改良固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定［14］。

1.2.2.2 高效鐵錳氧化菌的16S rDNA序列測(cè)定 提取細(xì)菌總DNA［15］， 采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物［12］，上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物：5'-GGTTACCTTCTTACGACTT-3'，引物由大連寶生物有限公司合成。以提取的總DNA作為模板，對(duì)該菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體 系：dNTPs 4 μL（2.5 mmol/L）、10×buffer 5 μL、上游引物及下游引物各2 μL（50 μmol/L）、Ex Taq酶0.5 μL、模板DNA 2 μL，加去離子水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，60℃退火90 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min［12］。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，并于紫外光下觀察，然后將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序［16］。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較，采用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［17］。

1.2.3 高效鐵錳氧化菌株生長(zhǎng)及氧化條件的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別以20℃、24℃、28℃、32℃和36℃作為溫度實(shí)驗(yàn)組；以5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0作為pH實(shí)驗(yàn)組；以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%和7.0%作為菌體接種量實(shí)驗(yàn)組；以12、24、36、48、60、72和84 h作為培養(yǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)組。以上各實(shí)驗(yàn)組的PYCM改良培養(yǎng)液均為50 mL，接種用菌懸液OD600值均調(diào)至1.0，恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，以不加菌作為陰性對(duì)照，以蒸餾水作為空白對(duì)照，在培養(yǎng)第3天測(cè)定鐵錳氧化率及生長(zhǎng)量OD600，分別采用過(guò)硫酸銨分光光度法和二氮雜菲分光光度法測(cè)定鐵、錳濃度［18］。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。

1.2.3.2 鐵錳氧化菌響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以溫度（A）、pH（B）、接種量（C）為自變量，以培養(yǎng)液中鐵離子的氧化率（Y1）和錳離子的氧化率（Y2）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken design（BBD）模型，設(shè)計(jì)三因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和鐵錳氧化率之間的函數(shù)關(guān)系，優(yōu)化鐵錳氧化的最佳環(huán)境條件。其中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。二次回歸方程用以擬合自變量和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系［19］，公式如下：

式中，Y：預(yù)期響應(yīng)值；A：常數(shù)；Aj：?jiǎn)我蛩刂本€系數(shù)；Ajj：?jiǎn)我蛩仄椒较禂?shù)；Aij：兩個(gè)因素的交互系數(shù)。

表1 菌株P(guān)1的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因子及水平列表

1.2.4 最佳培養(yǎng)及氧化條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 將菌株P(guān)1接種于PYCM改良培養(yǎng)液中，在最佳條件下培養(yǎng)3 d后，每12 h取樣檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)量OD600，同時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)液中鐵錳離子的剩余濃度，計(jì)算氧化率，設(shè)置3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 高效鐵錳氧化菌的分離純化

經(jīng)分離與純化獲得1株高效鐵錳氧化細(xì)菌，命名為P1。菌株P(guān)1菌落培養(yǎng)特征、革蘭氏染色照片和透射電鏡照片如圖1所示。菌株P(guān)1菌落和菌體形態(tài)特征分別見(jiàn)表2，生理生化指標(biāo)見(jiàn)表3。

圖1 菌株P(guān)1菌落及菌體形態(tài)

2.2 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株P(guān)1序列已在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為KP241859。菌株P(guān)1與數(shù)據(jù)庫(kù)中8個(gè)同源性較高的細(xì)菌模式株進(jìn)行比較，菌株P(guān)1的16S rDNA序列與蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus有較高的序列同源性，相似性高達(dá)99.0%。其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見(jiàn)圖2。目前，細(xì)菌分類(lèi)學(xué)家的共識(shí)是當(dāng)某兩個(gè)細(xì)菌的16S rDNA的相似性大于95%時(shí)，可將其歸為同一屬。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可知，菌株P(guān)1屬于Bacillus cereus。

表2 菌株P(guān)1形態(tài)特征

表3 菌株P(guān)1生理生化特征

圖2 菌株P(guān)1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同因素對(duì)菌株P(guān)1生長(zhǎng)量及鐵、錳氧化能力的影響情況，結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)溫度為28℃時(shí)，菌株P(guān)1生長(zhǎng)量和鐵、錳氧化率均達(dá)到最高點(diǎn)，生長(zhǎng)量為1.812，鐵、錳氧化率最大值分別為79.8%和 70.7%（圖3-A）。菌株P(guān)1生長(zhǎng)量及鐵、錳氧化率均隨pH增加先增大后減小，當(dāng)pH7.0時(shí)，菌株鐵、錳氧化率達(dá)最大值，分別為79.7%和68.5%。當(dāng)pH為6.5-7.5時(shí)，菌株P(guān)1生長(zhǎng)及氧化能力最佳（圖3-B）。接種量為4%時(shí)，菌株P(guān)1生長(zhǎng)量和鐵、錳氧化率均達(dá)到最大值，分別為1.801、81.7%和70.5%，可知4%為最佳接種量（圖3-C）。菌株P(guān)1生長(zhǎng)量及鐵、錳氧化率隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h，菌株P(guān)1鐵錳氧化率達(dá)到最大值，分別84.9%和68.2%（圖3-D）。綜上所述，影響菌株P(guān)1生長(zhǎng)量和鐵、錳氧化能力的最適條件為溫度28℃、pH7.0、接種量4%、培養(yǎng)時(shí)間72 h。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

菌株P(guān)1的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表4所示，每個(gè)響應(yīng)值實(shí)驗(yàn)總共17組，其中包括5組零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。利用Design-Expert 8.0.6軟件，對(duì)BBD模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析后，得到二次擬合模型為：

式中，Y1為菌株P(guān)1對(duì)鐵的氧化率，Y2為菌株P(guān)1對(duì)錳的氧化率；A1、B1、C1和A2、B2、C2分別為溫度、pH、接種量的編碼值。表5是利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得出的菌株P(guān)1鐵、錳氧化率響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)的回歸分析結(jié)果。

由菌株P(guān)1的回歸分析結(jié)果可知，菌株鐵氧化率、錳氧化率的失擬P值均>0.05，而鐵氧化率、錳氧化率的模型P值均<0.000 1，表明方程與實(shí)際情況擬合良好。由模型預(yù)測(cè)擬合度Pred R2和模型擬合系數(shù)R2可知，鐵、錳氧化率的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間具有良好擬合度；其校正后的擬合系數(shù)表明方程模型具有很高的可信度。信噪比大于4時(shí)表明模型合理，模型的信噪比Adeq Precisior1=38.930、Adeq Precisior2=32.568， 表 明 模型合理［20］。由表5可知，在菌株P(guān)1的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)中溫度、pH的P值均<0.000 1，說(shuō)明它們對(duì)菌株P(guān)1鐵、錳氧化率具有極顯著影響，同時(shí)，在以鐵氧化率為響應(yīng)值的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)中，接種量的P值為0.002 2，表明溫度和pH對(duì)菌株鐵氧化率的影響較接種量大，從溫度（F=171.14）與pH（F=200.06）的F值可以看出pH對(duì)鐵氧化率的影響較溫度更為顯著。而在以錳氧化率為響應(yīng)值的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)中，接種量P值為0.501 7，表明接種量對(duì)菌株錳氧化率沒(méi)有顯著影響，從溫度與pH的F值可知F溫度

圖3 各因素對(duì)菌株P(guān)1生長(zhǎng)量及氧化能力的影響

表4 菌株P(guān)1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 菌株P(guān)1響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

由上述結(jié)果可知，各因素對(duì)菌株鐵、錳氧化率的影響作用由大到小依次為：pH>溫度>接種量。

圖4為不同交互組合對(duì)菌株P(guān)1鐵錳氧化能力影響的響應(yīng)曲面圖。結(jié)合圖中等高線圖和響應(yīng)曲面圖能夠很好地分析交互組合對(duì)響應(yīng)值的影響情況。如圖所示，當(dāng)各因素固定在零水平時(shí)，較高氧化率集中在曲面的中心區(qū)域，且在此區(qū)域內(nèi)均存在菌株氧化率的極值點(diǎn)，經(jīng)軟件分析可以得到曲面的最高點(diǎn)，即3個(gè)因子的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，所得菌株P(guān)1氧化鐵離子的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為：溫度28.3℃，pH7.18，接種量4.27%；氧化錳離子的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為：溫度28.9℃，pH7.27，接種量4.46 %。

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析可得菌株P(guān)1的鐵錳氧化率最優(yōu)條件為：接種量4.35%，pH7.23，溫度28.54℃。

圖4 不同因素對(duì)菌株P(guān)1氧化率產(chǎn)生交互影響的響應(yīng)曲面圖

2.5 最佳條件驗(yàn)證結(jié)果

在最佳條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得菌株P(guān)1的生長(zhǎng)量及鐵錳氧化效果（圖5）顯示，通過(guò)對(duì)高效鐵錳氧化株菌生長(zhǎng)及氧化環(huán)境的優(yōu)化，使得菌株在3 d內(nèi)對(duì)鐵的氧化率達(dá)到100%，而對(duì)錳的氧化率達(dá)到93%以上。

3 討論

隨著地下水中高鐵錳污染情況的日益突出，近年來(lái)關(guān)于微生物應(yīng)用于處理富含鐵錳地下水的研究逐漸引起重視。國(guó)內(nèi)對(duì)于鐵錳生物氧化法的研究主要集中在鐵氧化菌、錳氧化菌的篩選、鐵錳氧化去除條件以及應(yīng)用方面的研究上［22］，已篩選的具有鐵氧化能力和錳氧化能力的細(xì)菌主要包括弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）［21］，節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）［23］和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）［24］等。目前，對(duì)于同時(shí)具備鐵氧化能力和錳氧化能力的鐵錳氧化菌株的篩選、生理生化研究以及氧化條件優(yōu)化等方面研究的較少［9-13］。而已篩選的具有鐵錳氧化能力的細(xì)菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）［11］和金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.）［25］，其鐵氧化率均可達(dá)到90%以上，但錳氧化率均不理想，且氧化過(guò)程持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，一般為6 d左右。因此，篩選出在富含鐵錳地下水條件下，具有高效鐵錳氧化能力的細(xì)菌對(duì)高鐵錳地下水處理至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)采用特異性的選擇培養(yǎng)基從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離篩選具有鐵錳氧化能力的菌株，同時(shí)，對(duì)菌株的鐵、錳氧化條件進(jìn)行優(yōu)化。常用的優(yōu)化方法主要有正交實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)曲面法兩種。正交實(shí)驗(yàn)法有一定局限性，它多采用線性模型，只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，無(wú)法精確找出整個(gè)區(qū)域內(nèi)因素最佳組合和最大響應(yīng)值［26］。而響應(yīng)曲面法則采用更為合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，并同時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)隨機(jī)誤差的影響，以回歸分析方法作為函數(shù)估算工具，將多因素實(shí)驗(yàn)的回歸因素和實(shí)驗(yàn)結(jié)果用簡(jiǎn)單的二次多項(xiàng)式模型來(lái)擬合，計(jì)算相對(duì)簡(jiǎn)便，它能夠連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)各個(gè)水平進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)模型為一個(gè)曲面，并且能夠在整個(gè)區(qū)域內(nèi)獲得最佳因素組合和最優(yōu)響應(yīng)值［27］。因此本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析方法對(duì)菌株的鐵、錳氧化條件進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明，各因素對(duì)菌株鐵、錳氧化率的影響作用由大到小依次為：pH>溫度>接種量。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后鐵、錳氧化率均比優(yōu)化前明顯提高。

在鐵錳氧化反應(yīng)體系中，主要存在兩種氧化方式，分別為化學(xué)氧化和生物氧化［23］。在本研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，兩種氧化作用中生物氧化占主導(dǎo)地位。其中化學(xué)氧化隨著pH值升高氧化率表現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。由于pH值為生物氧化中菌株氧化的主要影響因素，隨著pH值的逐漸升高，生物氧化率表現(xiàn)為先升高后下降的情況，在菌株最適pH7.23時(shí)，生物氧化率最高。因此隨著pH值的逐步升高，總氧化率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)。

另外，后續(xù)研究還將進(jìn)一步考查多株高效鐵錳氧化菌的復(fù)配并研究復(fù)配菌劑對(duì)富含鐵錳地下水的處理效果，為富含鐵錳地下水處理新方法的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

圖5 菌株P(guān)1的生長(zhǎng)量及鐵錳氧化效果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從富含鐵錳的地下水井淤泥中分離獲得1株能夠氧化鐵錳的細(xì)菌Bacillus cereus P1，在培養(yǎng)溫度28℃，pH7，接種量4%的條件下，于錳含量為200 mg/L、鐵含量為800 mg/L的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，鐵、錳氧化率分別為82%和73%。

采用響應(yīng)面分析方法對(duì)菌株P(guān)1鐵、錳氧化條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為：溫度28.54℃，pH7.23，接種量4.35%，鐵、錳氧化率最高分別可達(dá)100%和93.7%，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后鐵、錳氧化率比優(yōu)化前分別提高18%和19.3%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Isolation and Identification of an Efficient Fe/Mn-oxidizing Bacterial Strain P1，and the Optimization of Its Oxidizing Conditions

FAN Xing WANG Shu-ting LI Chun-yan
（College of Resource and Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

By enrichment culture，a Fe/Mn-oxidizing bacterial strain P1 was isolated from the sludge samples of groundwater well that was rich in Fe/Mn. According to morphologic and physiological-biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence analysis，strain P1 was identified as Bacillus cereus. Concurrently，single factor test was used to study the growth of strain P1 and its oxidation characteristics；and the response surface methodology（RSM）was employed to explore the effects of inoculation size，temperature and pH on the oxidation characteristics of strain P1 and further optimize the oxidation conditions. The results showed that the optimal oxidation conditions were temperature 28.54℃，pH 7.23，and inoculation size 4.35 %. At the optimal conditions，the removal ratios of Mn and Fe were 93 % and 100 % respectively in the selective medium containing 200 mg/L Fe and 800 mg/L Mn after strain P1 was cultured for 3 d.

Fe/Mn-oxidizing；Bacillus cereus；isolation and identification；oxidation conditions；response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.023

2015-09-29

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAJ12B01），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生SIPT計(jì)劃創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510224257）

樊星，男，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：good150030@sina.com

李春艷，女，博士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：chunyanli@neau.edu.cn