顏璐茜李佳蔓員濤周安佩縱丹李旦辛培堯，4何承忠，4

（1. 西南林業(yè)大學 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，昆明 650224；3. 西南林業(yè)大學 云南生物多樣性研究院，昆明 650224；4. 西南林業(yè)大學 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，昆明 650224）

滇楊遺傳多樣性的SRAP分析

顏璐茜1，2李佳蔓1，2員濤1，2周安佩1，2縱丹1，2李旦3辛培堯1，2，4何承忠1，2，4

（1. 西南林業(yè)大學 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，昆明 650224；3. 西南林業(yè)大學 云南生物多樣性研究院，昆明 650224；4. 西南林業(yè)大學 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，昆明 650224）

采用SRAP標記分析滇楊的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構。用篩選出的7對引物組合分析來自7個居群共208個樣本，共擴增得到條帶146條，多態(tài)性條帶73條，多態(tài)帶百分率為50%。滇楊物種水平上的觀測等位基因數(shù)（Na）為1.500 0，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.230 9，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）與Shannon’s信息指數(shù)（I）分別為0.136 6與0.210 0。遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.529 4，基因流（Nm）為0.444 4，表明居群間的遺傳變異大于居群內(nèi)，其基因交流處于中等水平。AMOVA分析也表明居群間的變異占總變異的55.61%。UPGMA、PCoA和Bayesian聚類分析結(jié)果一致，均顯示麗江與曲靖居群、楚雄與昭通居群的親緣關系較近。Mantel test結(jié)果表明滇楊居群間的遺傳距離與地理距離不相關。

滇楊；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構；SRAP標記

滇楊（Populus yunnanensis Dode）是我國西南地區(qū)特有的楊屬青楊派樹種，分布于云南中部、北部及南部的開遠、蒙自和文山，貴州威寧，四川涼山州的美姑、布拖等地，生長于海拔1 300-3 200 m，部分地區(qū)可達到3 700 m，多沿山澗河溪生長，在海拔2 000 m以上地帶有純林存在，而在海拔較低地區(qū)（<1 900 m）主要以混交林或散生形式存在［1］。由于滇楊具有 生長速度快、耐寒、易無性繁殖、抗葉銹病和葉斑病等優(yōu)良性狀［1，2］，兼有較高的觀賞價值［3］，被應用于環(huán)境保護、城市綠化并在林業(yè)生產(chǎn)中扮演著重要角色［4］，具有獨特的培養(yǎng)價值。目前關于滇楊的研究主要集中于生長特性［5-8］及栽培繁育［9-12］方面，通過與美洲黑楊（P. deltoides）、歐洲黑楊（P. nig ra）的種間雜交對其遺傳改良做出了嘗試［13，14］。但有關其分布區(qū)域內(nèi)的遺傳多樣性研究還未見報道。

在用于分析植物遺傳多樣性及種質(zhì)資源的多種分子標記中，SRA P（Sequence-Related Amplified Polymorphism）針對開放閱讀框進行標記，在分析種間、種內(nèi)雜交調(diào)查基因多態(tài)性與發(fā)現(xiàn)新的變異位點等方面有不可估量的價值［15］。該方法已被應用于遺傳多樣性分析［16］、遺傳圖譜構建［17］及差異表達基因分離［18］等實驗研究。楊樹SRAP標記體系的建立和優(yōu)化 已表明SRAP標記是一種適于楊樹遺傳多樣性研究的分子標記技術［19，20］?；诖?，本研究采用SRAP標記分析采集于四川省涼山州、云南省麗江市、曲 靖市、昆明市、大理市、楚雄市和昭通市7個滇楊居群的208個樣本，探討滇楊遺傳多樣性與遺傳結(jié)構，以期為其種質(zhì)資源的保護、開發(fā)和利用提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以行政區(qū)劃的地級市（自治州）為居群單位，按照隨機取樣的原則，從四川省涼山州、云南省麗江市、曲靖市、昆明市、大理市、楚雄市和昭通市共計7個滇楊居群中選取樣株，樣株間相隔100 m以上，采集嫩葉用硅膠干燥，帶回實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和SRAP分析 干燥后的葉片用冷凍混合球磨儀進行研磨，采用改良的SDS法依照標準酚/氯仿流程［21］提取分析樣本基因組DNA，利用0.8%的瓊脂糖凝 膠電泳和核酸蛋白檢測儀共同檢測基因組DNA的純度和濃度。

1.2.2 SRAP分析 根據(jù)SRAP引物設計原理［22，23］，在已有標準引物序列的基礎上自行設計正反引物各15條，共計225對引物組合。從中篩選出重復性好、多態(tài)性高、分辨率高的7對引物組合用于后續(xù)實驗。

PCR反 應 體 系（10 μL）：10×buffer（ 含25 mmol/L Mg2+）1 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.7 μL，正反引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.2 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O補足（2.6 μL）至10 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；前5個循環(huán)，94℃變性50 s，36℃退火50 s，72℃延伸90 s；后30個循環(huán)，94℃變性50 s，50℃退火50 s，72℃延伸90 s；72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)94℃變性10 min后在6%變性聚丙烯酰胺上進行電泳分離，恒定功率為70 W，電泳產(chǎn)物采用銀染法［24］進行譜帶的顯色反應。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)電泳圖譜中相同片段位置譜帶的“有”與“無”構建0/1矩陣。采用POPGENE version 1.32軟件［25］計算滇楊每個居群的多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)帶百分率、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon’s信息指數(shù)（I），以及滇楊總遺傳多樣性（Ht）、居群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）、Nei’s遺傳距離和遺傳相似系數(shù)。應用AMOVA 1.55軟件［26］進行分子變異方差分析。利用GENALEX v6.41軟件［27］對滇楊居群地理距離和遺傳距離的相關性進行Mantel test分析，依據(jù)遺傳距離進行主坐標軸分析（PCoA）。在NTSYS2.1e軟件［28］中運用非加權配對算術平均法（UPGMA）進行基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析。采用Structure 2.3.1［29］進行Bayesian聚類分析，選擇混合模型（Admixture model）和相關等位基因模型（Correlated alleles frequencies model），設定參數(shù)“burn-in-period”為104，MCMC重復運算105次，K值檢測范圍設定為1-11，每個K值獨立運行20次。應用Clumpp 1.1.2［30］對數(shù)據(jù)進行整理和分析，參照Evanno等［31］的方法確定最佳K值，利用Distruct 1.1［32］繪制Bayesian聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 SRAP多態(tài)性分析

篩選出的7對引物組合共擴增出條帶146條，多態(tài)性條帶73條，多態(tài)帶百分率為50%。引物組合Me3/Em9獲得的總條帶數(shù)（32條）、多態(tài)性條帶數(shù)（19條）、多態(tài)帶百分率（59.4%）均最高，引物組合Me3/Em8的最少，總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)帶百分率分別為14條、3條和21.4%（圖1和表1）。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物的6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染圖

表1 SRAP引物及其擴增結(jié)果

2.2 滇楊居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構

7個居群的遺傳多樣性（表2）顯示，平均多態(tài)帶百分率為22.70%，平均觀測等位基因數(shù)為1.227 0，平均有效等位基因數(shù)為1.107 6，Nei’s基因多樣性指數(shù)與Shannon’s信息指數(shù)分別為0.064 4與0.098 9。其中麗江居群的有效等位基因數(shù)（1.148 2）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（0.088 7）和Shannon’s信息指數(shù)（0.134 8）均最高，略高于曲靖居群（Ne=1.134 3，H=0.081 2，I=0.125 7）；而多態(tài)帶百分率與觀測等位基因數(shù)則是曲靖居群最高，分別為30.82%和1. 308 2；昭通居群的多態(tài)帶百分率（14.38%）、觀測等位基因數(shù)（1.143 8）、有效等位基因數(shù)（1.070 1）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（0.042 6）和Shannon’s信息指數(shù)（0.065 2）均最低。

滇楊總遺傳多樣性（Ht）為0.136 9，居群內(nèi)平均遺傳多樣性（Hs）為0.064 4，7個居群總遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.529 4，基因流（Nm）為0.444 4，表明居群間的遺傳變異大于居群內(nèi)，其基因交流處于中等水平。分子方差分析結(jié)果（表3）顯示，居群間的變異分量為6.71，占總變異的55.61%，差異達極顯著水平（P<0.001）。而居群內(nèi)個體的變異分量為5.36，占總變異的44.39%，低于居群間的變異程度。由此可知，滇楊的遺傳差異主要來自于不同居群之間。

表2 滇楊7個居群的遺傳多樣性

表3 滇楊7個居群的分子方差分析

兩兩居群間的最高遺傳分化系數(shù)出現(xiàn)在昆明與涼山居群之間，其Gst值為0.523 3；其次為昭通與涼山居群Gst值為0.509 2；而楚雄與昭通居群（Nm=1.987 8）、麗江與曲靖居群（Nm=1.704 9）基因交流最多，其Nm值均大于1（表4）。經(jīng)Mantel檢驗，滇楊7個居群的地理距離與遺傳距離的相關系數(shù)為-0.157（P=0.241），表明兩者間無相關性（圖2）。

表4 滇楊居群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm）

圖2 滇楊7個居群的地理距離和遺傳距離相關性

2.3 聚類分析

居群間的平均遺傳相似系數(shù)為0.909 7，變幅為0.876 2-0.971 6，楚雄與昭通居群之間遺傳相似系數(shù)最高，為0.971 6，其次為麗江與曲靖居群（0.945 6），涼山與昆明居群最低，為0.876 2。如圖3所示，在閾值為0.91時可分為3個組，涼山居群為第1組，昆明與大理居群構成第2組，其余4個居群為第3組。主坐標軸分析（PCoA）中，前3個特征向量的累計貢獻率為72%，基于PCoA的結(jié)果與UPGMA聚類結(jié)果基本一致，昭通與楚雄居群聚類，麗江與曲靖居群聚類，而涼山、大理、昆明3個居群相對分散（圖4）。

圖3 滇楊7個居群之間的UPGMA聚類圖

根據(jù)Evanno等［31］的方法確定最佳K值，滇楊7個居群的Delta K在K=2時最大（3.47），K=4（2.71）和K=6（1.97）時次之，分別對其進行聚類（圖5），3種K值的聚類結(jié)果基本一致，也與PCoA和UPGMA的聚類結(jié)果類似。如當K=4時，涼山居群單獨構成第1組，麗江和曲靖居群為第2組，昆明和大理居群組成第3組，昭通和楚雄居群被分到第4組。

圖4 滇楊7個居群的主坐標軸分析

圖5 滇楊7個居群的Bayesian分析

3 討論

SRAP標記多態(tài)性高，產(chǎn)率中等，重復性好，在基因組中分布均勻；較易對擴增得到的目的片段進行測序；操作簡單，其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，用少量的引物可以得到多個引物對，引物的使用效率高，可降低實驗成本，研究表明，SRAP標記比AFLP、RAPD等標記方式更能體現(xiàn) 表型的多樣性及 進化史［33，34］，其聚類結(jié)果要比AFLP更相似于形態(tài)學分析結(jié)果［19］。SRAP標記已廣泛應用于遺傳多樣性分析，但在不同樹種中擴增得到 的多態(tài)性各異，如 紫鉚（Butea monosperma）、桑樹（Morus）和石榴（Punica granatum）的多態(tài)帶百分率分別為91.90%、78.41%和53.20%［35-37］。而SRAP標記在楊樹遺傳變異分析中的應用較少，還處于起步階段，郭麗琴等［19］、陳罡等［20］通過建立和優(yōu)化SRAP-PCR體系，為SRAP標記在楊樹中的應用奠定了科學基礎，隨后郭娟等［38］對比了SRAP和EST-SSR標記在美洲黑楊品種間遺傳差異分析中的結(jié)果，并認為SRAP標記更適合用于楊樹親緣關系較近材料的分析。

遺傳多樣性是生物長期生存、進化和適應的結(jié)果［39］，研究遺傳多樣性，有利于合理保存和利用基因資源［40］。在滇楊的研究中，縱丹等［41］采用AFLP分析52株滇楊優(yōu)樹的遺傳多樣性，其多態(tài)帶百分率為64.52%，李里等［42］同樣用AFLP標記對采集于四川省和云南省的56株滇楊優(yōu)樹的遺傳多樣性進行了分析，多態(tài)帶百分率為59.25%。本研究中，滇楊的SRAP多態(tài) 帶百分率為50%，略低于AFLP分析結(jié)果。與楊屬其他樹種相比，遼寧楊為95.3%（SRAP）［20］，美洲黑楊為72.8%（SRAP）［43］，毛白楊為65.17%（AFLP）［44］，毛果楊為58%（AFLP）［45］，大青楊為52%（RAPD）［46］，胡楊為49.2%（RAPD）［47］，表明滇楊的遺傳多樣性水平中等。同時，由于無性繁殖群體與近緣有性繁殖種相比遺傳多樣性較低［39］，滇楊居群的Nei’s基因多樣性指數(shù)與Shannon’s信息指數(shù)（H=0.1366，I=0.2 100）均低于無性繁殖與有性繁殖同時存在的苦楊（P. laurifoli，SSR，H=0.3924，I=0.9185）和歐洲黑楊（SSR，H=0.2187，I=0.3348）［48］（表5）。

表5 分子標記揭示的楊屬樹種多態(tài)帶百分率

遺傳分化系數(shù)Gst為居群間變異與總變異的比值，Nm為居群間和居群內(nèi)的遺傳物質(zhì)交流［49］，二者均為分析居群遺傳結(jié)構的重要指標。Govindajaru認為，Nm>1則基因交流程度高，0.250

滇楊主要被用作行道樹或民間自發(fā)地用于四旁零散種植，栽種地域內(nèi)的百姓根據(jù)自己的判斷在有限范圍內(nèi)選取本地優(yōu)良單株采枝扦插繁殖［1］，促使滇楊在選取一定種源后僅在小范圍內(nèi)傳播，缺乏居群間的交流。同時，不科學的人工種植會造成遺傳上的高度同質(zhì)化［57］，降低滇楊的遺傳多樣性。因此，保護滇楊的遺傳多樣性，構建核心種質(zhì)并完善遺傳改良策略，是開發(fā)滇楊資源的必要環(huán)節(jié)。

4 結(jié)論

本研究利用7對SRAP引物組合從7個不同居群的208個滇楊樣本中共擴增出146條條帶，多態(tài)帶百分率為50%。滇楊居群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.529 4，基因流（Nm）為0.444 4，AMOVA分析結(jié)果表明居群間的變異占總變異的55.61%，表明滇楊的遺傳變異主要存在于居群間，居群間基因交流處于中等水平。UPGMA、PCoA和Bayesian聚類分析結(jié)果均顯示麗江與曲靖居群、楚雄與昭通居群的親緣關系較近，Man tel test結(jié)果表明滇楊居群間的遺傳距離與地理距離不相關。

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（責任編輯 馬鑫）

Genetic Diversity Analysis of Populus yunnanensis by SRAP Markers

YAN Lu-xi1，2LI Jia-man1，2YUAN Tao1，2ZHOU An-pei1，2ZONG Dan1，2LI Dan3XIN Pei-yao1，2，4HE Cheng-zhong1，2，4
（1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming 650224；2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming 650224；3. Yunnan Academy of Biodiversity，Southwest Forestry University，Kunming 650224；4. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，Southwest Forestry University，Kunming 650224）

To figure out the genetic diversity and genetic structure of Populus yunnanensis，208 samples from 7 populations were analyzed by sequence-related amplified polymorphism（SRAP）markers. With selected 7 pairs of primers，146 bands were obtained，in which 73 fragments（50%）were polymorphic. The values at the species level were 1.500 0 for observed alleles number（Na），1.230 9 for effective alleles number（Ne），0.136 6 for Nei’s genetic diversity index（H），and 0.210 0 for Shannon’s information index（I）. The genetic differentiation coefficient（Gst）was 0.529 4 and gene flow（Nm）was 0.444 4 and on intermediate stage，indicating that genetic variability of P. yunnanensis mainly took place among populations. Similarly，AMOVA showed that the genetic diversity among populations accounted for 55.61% of total. Clustering analysis by UPGMA，PCoA and Bayesian constantly revealed that population Lijiang and Qujing were in close relationship，and the same for population Chuxiong and Zhaotong. In addition，no correlation between the genetic distance and geographical distance was found by Mantel Test.

Populus yunnanensis；genetic diversity；genetic structure；SRAP marker

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.021

2015-04-22

國家林業(yè)公益性行業(yè)專項（201104076），國家自然科學基金項目（31360184，31460205），云南省中青年學術與技術帶頭人后備人才培養(yǎng)基金項目（2012HB021），西南林業(yè)大學大學生創(chuàng)新基金項目（C14113）

顏璐茜，女，碩士研究生，研究方向：植物生物技術；E-mail：695253285@qq.com

何承忠，男，教授，博士生導師，研究方向：林木遺傳育種與分子生物學；E-mail：hcz70@163.com