張海晨李彩霞王元忠張曉東

（1. 玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，玉溪 653100；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，昆明 650223）

滇龍膽1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因的克隆與表達(dá)分析

張海晨1李彩霞1王元忠2張曉東1

（1. 玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，玉溪 653100；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，昆明 650223）

旨在克隆滇龍膽1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因GrDXS，并進(jìn)行表達(dá)分析。以滇龍膽轉(zhuǎn)錄組為基礎(chǔ)，采用RTPCR技術(shù)從滇龍膽幼葉克隆GrDXS基因，并進(jìn)行原核表達(dá)和組織特異性表達(dá)分析。滇龍膽GrDXS基因（登錄號(hào)：KJ624995）全長(zhǎng)2 145 bp，編碼714個(gè)氨基酸；GrDXS蛋白相對(duì)分子質(zhì)量76.75 kD，pI為6.93；屬于DXS家族成員，可能定位于葉綠體；主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成；具有DXS蛋白的4類保守結(jié)構(gòu)域：焦磷酸硫胺素結(jié)合折疊域（IPR029061，69-425、366-555、87-268、315-407、407-558）、類轉(zhuǎn)酮酶嘧啶結(jié)合結(jié)構(gòu)域（IPR005475，394-559、394-555）、轉(zhuǎn)酮酶C端/丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶結(jié)構(gòu)域II（IPR009014，568-704，572-704）、轉(zhuǎn)酮酶C端結(jié)構(gòu)域（IPR005476，573-696）和1個(gè)轉(zhuǎn)酮酶結(jié)合位點(diǎn)（IPR020826，500-516）；與長(zhǎng)春花CrDXS蛋白親緣關(guān)系最近；GrDXS基因在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為100 kD，與預(yù)期蛋白大小一致；GrDXS基因主要在葉中表達(dá)。

滇龍膽；1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；生物信息學(xué)；表達(dá)模式

滇龍膽Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.是云南特色藥材，也是200多種中藥的主要原料［1］。近年來，隨著龍膽需求量逐年遞增，導(dǎo)致其野生資源遭到大肆破壞［1］。為此，2013年云南省啟動(dòng)了龍膽草航天育種工程，其主要目標(biāo)是培育高產(chǎn)、高抗、高龍膽苦苷含量、適合機(jī)械化種植和擴(kuò)大種植范圍的龍膽草新品種［2］。滇龍膽主要活性成分為龍膽苦苷，要從根本上解決龍膽藥源問題和提高其龍膽苦苷含量，首先必須探明龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理，為通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段生產(chǎn)龍膽苦苷奠定基礎(chǔ)。

龍膽苦苷屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物。在植物中，裂環(huán)環(huán)烯醚萜類骨架部分主要是通過質(zhì)體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成的［3］。1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，EC：4.1.3.37）是MEP途徑中的第一個(gè)催化酶，在焦磷酸硫胺素的存在下，能夠?qū)⒈崤cD-甘油醛3-磷酸縮合生成1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP），同時(shí)釋放二氧化碳，該反應(yīng)依賴于Mg2+或Mn2+等二價(jià)陽離子［4-6］。研究表明DXS催化丙酮酸的脫羧速率能夠被甘油醛3-磷酸所加速［7］。采用LC-MS-MS方法，通過檢測(cè)DXP的產(chǎn)生而測(cè)定植物粗提取物中DXS酶活性的方法已被報(bào)道［8］。目前，1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因已從水稻［9］、玉米［10］、苜蓿［11］、云杉［12］、沉香［13］、熊膽草［14］、甜瓜［15］、印度人參［16］等多種植物中分離。DXS基因的表達(dá)具有組織特異性，并被生物和非生物因素誘導(dǎo)。在生物誘導(dǎo)劑（100 mg/mL酵母提取物）和非生物誘導(dǎo)劑（30 mmol/L Ag+）共同誘導(dǎo)36 h，丹參SmDXS基因在誘導(dǎo)后其表達(dá)量逐漸升高，在36 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高［17］。在葡萄中，VvDXS基因與麝香葡萄香味相關(guān)聯(lián)，其表達(dá)受染色質(zhì)狀態(tài)和不同發(fā)育時(shí)期的影響［18］。

在日本，龍膽是重要的鮮切花，其研究主要集中于花色改良方面［19，20］。在中國(guó)，龍膽是重要的大宗藥材，其研究主要集中于種子萌發(fā)［21，22］、DNA條碼［23］、育種［2］等方面，尚未對(duì)滇龍膽GrDXS基因進(jìn)行研究。本研究根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中GrDXS基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)從滇龍膽幼葉中擴(kuò)增到GrDXS基因，并進(jìn)行序列分析、原核表達(dá)和組織表達(dá)特異性分析，以期為滇龍膽GrDXS基因功能和龍膽苦苷生物合成途徑的解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

滇龍膽無菌組培苗和盆栽苗均采自于玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.?；蚩寺∷貌牧蠟榈猃埬憻o菌苗幼葉，基因組織特異性表達(dá)分析所用材料為盆栽3年生滇龍膽的根和葉，采樣日期為2014年5月17日。

1.2 方法

1.2.1 葉片總RNA提取及GrDXS基因ORF的克隆 按照多糖植物組織提取試劑RNAiso（TaKaRa，大連）說明書提取滇龍膽幼葉總RNA；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書合成cDNA。根據(jù)原核表達(dá)載體pGEX-4T-1多克隆酶切位點(diǎn)和滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中GrDXS基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物 GrDXSBamHI-F：5'-GGATCCATGGCAGTTTC AGGATCTCTC-3'（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)），GrDXSXhoI-R：5'-CTCGAGTTACTTAAGCTGAAGAG CTTCTTTAGG-3'（下劃線為Xho I酶切位點(diǎn)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成）。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：PrimeSTAR Max Premix（2×）（TaKaRa，大連）25 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA模板3 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃變性10 s，55.4℃退火15 s，72℃延伸10 s，30循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、割膠，使用膠回收試劑盒（Qiagen，德國(guó)）對(duì)目的片段進(jìn)行回收；使用dATP（TaKaRa，大連）和Taq DNA Polymerase（天根，北京）進(jìn)行加尾，72℃反應(yīng)30 min；加尾產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、割膠，使用膠回收試劑盒（Qiagen，德國(guó)）對(duì)目的片段進(jìn)行回收，然后將其連接到pMD19-T載體（TaKaRa，大連）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（TaKaRa，大連）后進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取12個(gè)白斑搖菌；使用堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切檢測(cè)正確后選取3個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序（上海生工，上海），獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrDXS。

1.2.2 GrDXS基因原核表達(dá)載體構(gòu)建 對(duì)質(zhì)粒pGEX-4T-1（Amersham，瑞典）和pMD19-GrDXS分別進(jìn)行BamH I（TaKaRa，大連）和Xho I（TaKaRa，大連）雙酶切，回收載體片段和目的基因，按摩爾比1∶4進(jìn)行過夜連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa，大連），涂布于添加100 mg/L氨芐青霉素（TaKaRa，大連）+ IPTG（TaKaRa，大連）+ X-gal（TaKaRa，大連）的LB固體平板，12 h后挑取克??；搖菌后，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切檢測(cè)正確后，獲得原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-GrDXS。

1.2.3 GrDXS基因的生物信息學(xué)分析 使用NCBI網(wǎng)站BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，應(yīng)用Genetyx 6.1.8進(jìn)行翻譯，使用DNAMAN 7進(jìn)行多序列比對(duì)；使用Clustal X2.1進(jìn)行比對(duì)，然后使用MEGA6.0軟件內(nèi)置的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap=1 000；利用在線數(shù)據(jù)庫（http://molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11. html）進(jìn)行稀有密碼子分析。使用ChloroP服務(wù)器v1.1進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)；Interpro軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；ProtScale軟件進(jìn)行疏水性分析；PredictProtein對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；Swiss-Model自動(dòng)模式對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用ExPASy中的TMHMM工具預(yù)測(cè)蛋白的跨膜螺旋區(qū)；利用在線工具WOLF PSORT預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.2.4 GrDXS基因的原核表達(dá) 使用熱激法將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrDXS轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（全式金，北京），挑取單菌落接種于3 mL含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)12 h。然后以1∶100比例接種到無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)3 h（OD600≈0.8），在37℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)以相同條件的pGEX-4T-1轉(zhuǎn)化菌作對(duì)照；分別誘導(dǎo)0、2、4和6 h后，收集菌液2 mL。4℃、10 000 r/min離心1 min集菌，棄上清，加入100 μL ddH2O、25 μL的5×SDSPAGE上樣緩沖液，震蕩懸菌，沸水煮5 min。4℃、13 000 r/min離心5 min。取20 μL上清上樣，進(jìn)行SDS-PAGE（5%濃縮膠和12%分離膠）電泳檢測(cè)。4℃、6 000 r/min離心10 min，將誘導(dǎo)表達(dá)6 h的菌液50 mL進(jìn)行收集，使用1×PBS對(duì)菌體進(jìn)行洗滌1次。然后加入5 mL 1×PBS進(jìn)行懸菌，使用JY92-IIDN型超聲細(xì)胞破碎儀（新芝，寧波）進(jìn)行細(xì)胞破碎。條件為：冰浴，超聲時(shí)間30 min，工作3 s，間隔3 s，能量30%。4℃、18 000 r/min離心30 min，分離上清和沉淀。使用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白。

1.2.5 GrDXS基因的實(shí)時(shí)定量分析 分別取3年生滇龍膽的根和葉，提取總RNA，使用DNase I處理除去基因組DNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA。以轉(zhuǎn)錄組中GrGAPDH基因（GenBank登錄號(hào)KM061807）作為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物GrGAPDH-F（5'-AAGGGAGGTGCGAAGAAAGT-3'）和GrGAPDH-R（5'-AAGGAGCAAGACAGTTGGTTGT-3'），PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 31 s。根據(jù)GrDXS基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物GrDXS-F（5'-TGATAGTGATGGCACCTTCTGA-3'）和GrDXS-R（5'-TTCTTCCCTTACCAACCTCAAA-3'）。使用SuperReal PreMix Plus試劑盒（天根，北京）進(jìn)行qPCR，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 31 s。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)在ABI7000熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線、熔解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由定量PCR儀軟件自動(dòng)生成。使用內(nèi)參基因GrGAPDH表達(dá)校準(zhǔn)后，計(jì)算根莖葉中GrDXS基因相對(duì)表達(dá)量。采用比較Ct值的“2-△△Ct”的方法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)的分析處理。

2 結(jié)果

2.1 滇龍膽GrDXS基因序列的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用特異性引物擴(kuò)增出約2 000 bp的片段（圖1）。通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrDXS，酶切檢測(cè)結(jié)果表明雙酶切獲得的兩片段大小之和等于單酶切片段大小，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 GrDXS基因的生物信息學(xué)分析

利用Genetyx和DNAMAN軟件對(duì)GrDXS基因cDNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示GrDXS基因ORF全長(zhǎng)2 142 bp，編碼713個(gè)氨基酸。值得注意的是，本研究中克隆到的GrDXS基因與轉(zhuǎn)錄組拼接的GrDXS核苷酸序列不完全一致，二者相似性為99.53%。將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)KM974886。

圖1 GrDXS基因的PCR擴(kuò)增

使用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLASTp程序?qū)rDXS蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明滇龍膽GrDXS與長(zhǎng)春花CrDXS蛋白序列相似性最高（87.96%），與高良姜（Alpinia officinarum）AoDXS（AEK69519.1）蛋白相似性稍低（74.40%）。利用DNAMAN 7將GrDXS蛋白序列與從NCBI中挑選的相似性較高的部分序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果（圖2）表明GrDXS蛋白與已知蛋白相似性很高。利用Mega 6.0將GrDXS蛋白序列與已發(fā)表文獻(xiàn)中相似性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果（圖3）顯示，編碼滇龍膽GrDXS蛋白與長(zhǎng)春花CrDXS2a處于同一進(jìn)化枝，表明二者親緣關(guān)系較近。

使用ExPASy ProtParam tool對(duì)GrDXS蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明GrDXS蛋白單體相對(duì)分子質(zhì)量為76.75 kD，pI為6.93；帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為74，帶負(fù)電氨基酸殘基（Asp+Glu）為76。不穩(wěn)定指數(shù)為35.27，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為90.90，總平均疏水性（GRAVY）為-0.072，為親水蛋白。GrDXS蛋白含有20種基本氨基酸，其中丙氨酸含量最高，為10.40%；其次是亮氨酸和甘氨酸，分別為9.70%和9.40%；色氨酸含量最低，為0.3%。

利用SSpro方法對(duì)GrDXS蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（H）占34.45%，無規(guī)則卷曲（C）占47.06%，延伸帶（E）占18.49%。利用Swiss-Model Workspace使用自動(dòng)模式預(yù)測(cè)GrDXS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，該模型是以耐輻射球菌1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶［2o1x.1］為模板，在第69-705位氨基酸處建模，序列相似度為41.50%，其二聚體配基為Mg2+或焦磷酸硫胺素。使用InterPro在線工具對(duì)GrDXS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明GrDXS蛋白包含4類保守結(jié)構(gòu)域：焦磷酸硫胺素結(jié)合折疊域（IPR029061，69-425、366-555、87-268、315-407、407-558）、類轉(zhuǎn)酮酶嘧啶結(jié)合結(jié)構(gòu)域（IPR005475，394-559、394-555）、轉(zhuǎn)酮酶C端/丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶結(jié)構(gòu)域II（IPR009014，568-704，572-704）、轉(zhuǎn)酮酶C端結(jié)構(gòu)域（IPR005476，573-696）和1個(gè)轉(zhuǎn)酮酶結(jié)合位點(diǎn)（IPR020826，500-516）。

利用SignalP 4.1服務(wù)器分析GrDXS蛋白，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。利用TMHMM工具預(yù)測(cè)GrDXS蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明GrDXS蛋白不含跨膜螺旋區(qū)域，為非膜蛋白。使用ChloroP 1.1 Server對(duì)GrDXS蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明GrDXS蛋白含35氨基酸組成的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，因此該蛋白定位于葉綠體。

對(duì)GrDXS基因進(jìn)行稀有密碼子分析，結(jié)果表明GrDXS基因中稀有密碼子僅占0.84%，且無二聯(lián)或三聯(lián)稀有密碼子連續(xù)出現(xiàn)的情況，因此可選用大腸桿菌表達(dá)菌BL21或Rosetta（DE3）進(jìn)行原核表達(dá)。

2.3 GrDXS基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用BamH I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrDXS，可獲得目的片段和載體（圖5），表明GrDXS基因已成功插入載體pGEX-4T-1中。

2.4 GrDXS基因的原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrDXS轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）后，使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在37℃、終濃度為1 mmol/L IPTG下，分別誘導(dǎo)表達(dá)0、2、4和6 h后，提取細(xì)菌總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，pGEX-4T-1-GrDXS轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量約100 kD（含GST蛋白26 kD）處有1條蛋白條帶，并且隨誘導(dǎo)時(shí)間增加其蛋白含量逐漸增加，表明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrDXS在大腸桿菌Rosetta（DE3）中成功誘導(dǎo)表達(dá)了GrDXS蛋白。當(dāng)溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，蛋白表達(dá)量最大（圖6）。為檢測(cè)GrDXS融合蛋白的存在形式，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)6 h的菌體進(jìn)行超聲破碎，然后使用SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果（圖7）表明GrDXS蛋白全部以包涵體形式存在。

圖2 GrDXS蛋白與其它植物DXS蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果

圖3 GrDXS蛋白與植物中其它DXS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 GrDXS基因的組織表達(dá)分析

取3年生滇龍膽的根和葉，通過qRT-PCR分析GrDXS基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果（圖8）表明，GrDXS基因在葉中表達(dá)量遠(yuǎn)高于其在根中表達(dá)量。

3 討論

代謝途徑中終產(chǎn)物的量取決于該途徑的流量，而流量本身又取決于轉(zhuǎn)換相應(yīng)中間產(chǎn)物的每個(gè)酶反應(yīng)步驟的速率［8］。鑒定對(duì)代謝通量起重要作用的酶，將有助于對(duì)萜類化合物生物合成調(diào)控機(jī)制的闡明［8］。滇龍膽的主要藥效成分龍膽苦苷屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜類，主要通過MEP途徑合成。在植物中，1-脫氧木酮糖5-磷酸合酶被認(rèn)為是MEP途徑的一個(gè)限速酶［14，24］。因此，滇龍膽中GrDXS基因的表達(dá)情況直接或間接影響龍膽苦苷的生物合成。本研究對(duì)滇龍膽GrDXS基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明所克隆的GrDXS基因ORF全長(zhǎng)2 142 bp，編碼713個(gè)氨基酸，pI為6.93，這分別與印度人參WSDXS蛋白和牛巴貝斯蟲BbDXS蛋白類似［16，25］；GrDXS蛋白具有DXS蛋白中4類保守結(jié)構(gòu)域：焦磷酸硫胺素結(jié)合折疊域、類轉(zhuǎn)酮酶嘧啶結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)酮酶C端/丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶結(jié)構(gòu)域II、轉(zhuǎn)酮酶C端結(jié)構(gòu)域，與長(zhǎng)春花CrDXS蛋白序列相似性高達(dá)87.96%，因此所克隆基因?yàn)镚rDXS基因。

圖4 GrDXS蛋白二聚體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrDXS酶切檢測(cè)

圖6 37℃下誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GrDXS蛋白表達(dá)量的影響

圖7 GrDXS融合蛋白存在形式的檢測(cè)

圖8 GrDXS基因在根和葉中的相對(duì)表達(dá)

在植物中，DXS基因是以家族形式存在的［26］。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析、生化特征和基因表達(dá)特征，DXS蛋白可分為3類：第I類是在綠色組織中組成型表達(dá)，能夠?yàn)槌旨掖x物或光合作用代謝物如類胡蘿卜素和葉綠素的合成提供前體；第II類是在特定組織中表達(dá)，如與菌根共生累積前胡蘿卜素的根或小蠹或真菌感染針葉松樹脂道表皮細(xì)胞；第III類是最近幾年才提出的，其功能還未被最終確定［15］。在本研究中，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明GrDXS蛋白屬于第II類DXS蛋白，由于其又包含35個(gè)氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，推測(cè)其在葉綠體中參與MEP途徑。

DXS基因的表達(dá)具有組織和時(shí)空特異性，并與萜類的生物合成相關(guān)聯(lián)。在熊膽草中，CbDXS基因的表達(dá)水平與其藥效成分二萜苦蒿素的濃度高度相關(guān)［14］，而在擬南芥中AtDXS能夠通過MEP途徑控制二氧化碳的代謝流量［6］。在煙草中，過表達(dá)SlDXS和香葉基焦磷酸合成酶基因NtGPPS2導(dǎo)致二萜產(chǎn)量加倍［27］。在滇龍膽中，龍膽苦苷是在植物綠色組織（葉和莖）合成，然后通過莖轉(zhuǎn)運(yùn)到根中進(jìn)行儲(chǔ)藏的［28］。對(duì)滇龍膽GrDXS基因組織表達(dá)特異性檢測(cè)結(jié)果表明，GrDXS基因在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根，這與上述報(bào)道相一致。

本研究為滇龍膽GrDXS基因功能的解析奠定基礎(chǔ)。下一步將對(duì)GrDXS蛋白進(jìn)行純化和多克隆抗體制備、通過過表達(dá)或互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究GrDXS基因的功能，為龍膽苦苷生物合成途徑的闡明奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆滇龍膽GrDXS基因，并可表達(dá)出gst-DXS蛋白，且該基因在葉中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根中。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of Gene Encoding 1-Deoxy-D-xylulose 5-Phosphate Synthase in Gentiana rigescens

ZHANG Hai-chen1LI Cai-xia1WANG Yuan-zhong2ZHANG Xiao-dong1
（1. College of Resources and Environment，Yuxi Normal University，Yuxi 653100；2. Institute of Medicinal Plants，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650223）

The aims of this study are to clone the gene GrDXS encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase from Gentiana rigescens，and to analyze its expression. Based on the transcriptome of G. rigescens，a GrDXS gene was cloned from young leaves of G. rigescens by RT-PCR technology，and its prokaryotic and tissue-specific expression were also performed. The GrDXS gene（GenBank accession number：KJ624995）had a length of 2 145 bp coding for 714 amino acids，and the relative molecular weight of GrDXS protein was 76.75 kD with its pI of 6.93. GrDXS protein belonged to the member of DXS superfamily，and may localize in chloroplast，GrDXS protein composed of mainly random coil（47.06%）and α-helix（34.45%）. Four kinds of conserved domains: Thiamin diphosphate-binding fold（IPR029061，69-425，366-555，87-268，315-407，407-558），Transketolase-like，pyrimidine-binding domain（IPR005475，394-559，394-555），Transketolase C-terminal/Pyruvate-ferredoxin oxidoreductase，domain II（IPR009014，568-704，572-704），and Transketolase binding site（IPR020826，500-516），were all existing in GrDXS protein. GrDXS protein was the closest with CrDXS in Catharanthus roseus. The recombinant protein of GrDXS gene in Escherichia coli was approximately 100.00 kD（containing GST tag protein 26 kD），which was consistent with the anticipated size. GrDXS gene was primarily expressed in leaf.

Gentiana rigescens；1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase；bioinformatics；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.017

2015-05-16

云南省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201411390001）

張海晨，女，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：1285290757@qq.com

張曉東，男，博士，副教授，研究方向：植物代謝基因工程；E-mail：zxd95@126.com